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AULA Nº 4 – Nutrição Microbiana;

Meios de Cultura
Para obter energia e formar ou renovar os componentes celulares, os organismos
necessitam de ser fornecidos de nutrientes ou outros materiais que o permitam fazê-lo.
Estes nutrientes são todas as substâncias usadas em processos de biossíntese e obtenção
de energia e que, por isso, contribuem para o crescimento microbiano.
Para além dos nutrientes, outros factores ambientais, como a temperatura, níveis de
oxigénio e a concentração osmótica do meio, são cruciais para o desenvolvimento e
crescimento microbiano.

Composição elementar da célula microbiana


O peso de uma célula microbiana seca é da responsabilidade dos seus elementos
fundamentais: carbono, oxigénio, hidrogénio, azoto, enxofre, fósforo, potássio, cálcio,
magnésio e ferro. Estes são chamados de macronutrientes (ou macroelementos) já que
são necessários à célula em quantidades relativamente abundantes.

Composição aproximada de uma célula


% peso seco
Elementos Localização/Função
célula
Carbono 50
Oxigénio 20
Azoto 14 Componentes dos glícidos, lípidos, proteínas e ácidos
Hidrogénio 8 núcleicos.
Fósforo 3
Enxofre 1
Actividade de proteínas, algumas das quais envolvidas na
Potássio 1
síntese proteica
Cálcio 0,5 Responsáveis pela resistência dos endosporos ao calor
Co-factor, complexação com ATP e estabilização de
Magnésio 0,5
ribossomas e da membrana celular
Co-factor enzimático e de proteínas transportadoras de
Ferro 0,2
electrões e estrutura dos citocromos.
Manganês, Zinco, Zn : regulação enzimática; Mn2+: transferência de grupos
2+

Molibdénio, Cobre, ~0,3 fosfato; Mo2+: fixação de azoto; Co2+: componente da


Cobalto vitamina B12

Tabela 4.1 – Elementos constituintes da célula e respectivas funções.


Todos os microorganismos necessitam dos chamados micronutrientes ou elementos
residuais, para além dos mais abundantes macroelementos. Apesar de serem necessários
na maioria das células, estes elementos não parecem limitar o crescimento bacteriano.
Geralmente, integram a estrutura de cofactores ou mesmo de enzimas.
As funções e localização destes elementos estão discriminadas na tabela da página
anterior.
Apesar da composição em nutrientes ser tão variada, a célula não pode dispensar a
presença de nenhum deles. Assim, se apenas um dos nutrientes essenciais estiver em
deficiência, o crescimento será afectado, mesmo que as concentrações dos restantes
elementos estejam em valores apropriados.

Necessidades em Carbono, Hidrogénio e Oxigénio


Muitas vezes, as necessidades nestes três elementos são satisfeitas em simultâneo. O
carbono é necessário para o esqueleto dos compostos orgânicos, sendo que as
substâncias que fornecem o carbono contribuem igualmente com átomos de oxigénio e
hidrogénio. Para além de suprirem a célula com os átomos, os nutrientes orgânicos
funcionam igualmente como fontes de energia já que se encontram usualmente na forma
reduzida, possuindo electrões que podem doar a outras moléculas. Daí que, quanto mais
reduzido um composto orgânico está, mais energia contém, já que a transferência de
electrões de dadores reduzidos, com potencias de redução mais negativos, para
aceitadores oxidados com potencias mais positivos, leva à libertação de energia.
Uma fonte importante de carbono que, no entanto, não fornece hidrogénio à célula é
o CO2. Pensa-se que todos os microorganismos conseguem fixar o dióxido de carbono,
ou seja, reduzi-lo e incorporá-lo em moléculas orgânicas. No entanto, apenas os
organismos autotróficos podem usar o CO2 como fonte única ou principal de carbono.
Muitos organismos são autotróficos e grande parte deles realiza a fotossíntese, usando a
luz solar como fonte de energia. Outros obtêm energia a partir da oxidação de
compostos inorgânicos pela transferência dos seus electrões.
A redução do dióxido de carbono é energeticamente muito dispendiosa e nem todos
os organismos o usam como fonte de carbono quando na presença de compostos mais
reduzidos e complexos como a glicose. Os organismos que usam como fonte de carbono
moléculas orgânicas mais reduzidas são designados de heterotróficos, usando essas
moléculas tanto como fonte de carbono como de energia (a via glicolítica, por exemplo,
fornece tanto o esqueleto carbonado, como energia na forma de ATP e NADH).
Existem ainda alguns microorganismos com um metabolismo tão flexível quanto a
fontes de carbono, que poderão degradar o álcool amilico, a parafina e até mesmo a
borracha, como é o caso dos Actinomicetes. A Burkholderia cepacia pode utilizar mais
de 100 compostos carbonados enquanto que as bactérias metilotróficas podem
metabolizar compostos de um carbono, como o metano, metanol e ácido fórmico. Há
ainda evidências de que alguns microorganismos conseguem metabolizar substâncias
indigestíveis pelo humano, como pesticidas.

Classificação dos organismos quanto ao tipo de nutrição


Como visto anteriormente, os organismos são designados de autotróficos ou
heterotróficos, quanto às fontes de carbono que utilizam. Na tabela abaixo, encontram-
se as restantes classificações, de acordo com as fontes de energia e electrões
(hidrogénio).

Fontes de carbono, Energia e Electrões


Fontes de Carbono
Autotróficos • Apenas CO2 ou como principal fonte
Heterotróficos • Compostos orgânicos

Fontes de Energia
Fototróficos • Luz solar
Quimiotróficos • Oxidação compostos orgânicos e inorgânicos

Fontes de Electrões
Litotróficos • Moléculas inorgânicas reduzidas
Organotróficos • Moléculas orgânicas reduzidas

Tabela 4.2 – Classificação de organismos quanto às fontes de carbono, energia e


electrões

Apesar dos organismos poderem apresentar diversas formas de suprirem as suas


necessidades metabólicas, estes são organizados de acordo com a fonte principal de
carbono, energia e electrões. Maioritariamente, estes apresentam-se como
fotolitoautotróficos ou quimioorganoheterotróficos. As outras duas classes, com
menos organismos, são importantes ecologicamente, na medida em que habitam lagos
poluídos, utilizando os compostos orgânicos lá depositados para o seu metabolismo,
como é o caso dos seres fotoorganoheterotróficos. Os seres quimiolitoautotróficos
contribuem para as transformações químicas que continuamente ocorrem nos
ecossistemas como é o caso da conversão da amónia em nitratos ou da transformação do
enxofre em sulfatos.

Categorias Nutricionais
Fontes Energia – Electrões – Microorganismos
Tipo Nutricional
Carbono Representativos
Fotolitoautotróficos Luz – Compostos Inorgânicos – CO2 Cianobactérias, Algas
Bactérias fotossintéticas, Arqueas
Fotoorganoheterotróficos Luz – Compostos Orgânicos
halófitas
Energia Química (inorgânica) – Compostos Bactérias oxidificantes do Enxofre,
Quimiolitoautotróficos
Inorgânicos – CO2 Bactérias Nitrificantes

Energia Química (orgânica) – compostos Protozoários, Fungos, Bactérias


Quimioorganohetrotróficos
Orgânicos Patogénicas com interesse industrial.

Tabela 4.3 – Categorias Nutricionais e características principais.

Como referido anteriormente, a propósito das necessidades elementares das


bactérias, há microorganismos com metabolismo bastante flexível. Assim, há
organismos que se apresentam como fotoorganotróficos na ausência de oxigénio, mas
na presença de níveis adequados de oxigénio, oxidam moléculas orgânicas, utilizando
energia química nelas contidas, actuando como quimioorganotróficos, como é o caso
das bactérias não sulfúricas. Em condições de oxigénio intermédias, tanto podem
realizar a fotossíntese ou o metabolismo oxidativo. Por seu turno, as Beggiatoa, são
capazes de degradar moléculas orgânicas e inorgânicas (CO2) como fontes de carbono.
Estes últimos são chamados de mixotróficos por combinarem os processos
quimiolitoautotróficos e o metabolismo heterotrófico.

Necessidades em Azoto, Fósforo e Enxofre


Para o crescimento normal, a célula microbiana precisa estar fornecida de outros
elementos, para além dos que obtém a partir dos compostos anteriormente discutidos. A
célula tem de incorporar em quantidade igualmente razoável átomos de azoto, fósforo e
enxofre, que apesar de poderem ser obtidos da mesma fonte que o carbono, oxigénio e
hidrogénio, têm normalmente fontes inorgânicas distintas.
Vejamos cada elemento mais detalhadamente.
• Azoto: É necessário na síntese de aminoácidos, purinas e primidinas, alguns
glícidos e lípidos, cofactores enzimáticos e outras substâncias. Para ser
assimilado, o azoto, tal como os outros dois elementos, deve encontrar-se na
forma reduzida, no caso, na forma de NH3 (amónia). O principal destino deste
elemento é a sua incorporação em aminoácidos e tal é conseguido através da
acção de enzimas como a glutamato desidrogenase, glutamina sintetase (gasto
de ATP) – ver reacção 4.1 – ou glutamato sintase. A amónia pode ser obtida por
dois processos distintos, a redução assimilatória de nitratos ou a redução e
assimilação atmosférica de azoto (N2), usando o sistema da nitrogenase. O
primeiro processo é realizado pela maioria dos seres fototróficos e por alguns
quimiotróficos, que reduzem o nitrato a amónia, incorporando-a de seguida na
redução assimilatória. O segundo processo é realizado por variadas bactérias
como as cianobactérias e a bactéria simbiótica Rhizobium.

Reacção 4.1
ATP ADP + Pi

NH3 + Ácido Glutamico Glutamina


Glutamina Sintetase

• Fósforo: Existe na constituição dos ácidos núcleicos, fosfolípidos, nucleótidos,


variados cofactores, proteínas e outros componentes celulares. Quase todos os
microorganismos utilizam o fosfato inorgânico como fonte de fósforo, sendo
capazes de o integrar directamente no seu interior. A incorporação de fosfato tem
sido extensamente estudada nas E. coli, bactérias que conseguem utilizar fosfato
orgânico e inorgânico. Alguns organofosfatos como a hexose – 6 – fosfato, são
capturados directamente, através da presença de proteínas transportadoras.
Outros organofosfatos são muitas vezes hidrolisados no periplasma pela acção
da fosfatase alcalina, levando à produção final de fosfato inorgânico,
transportado depois através da membrana. Quando existe à disposição da célula
fosfato inorgânico, este atravessa a membrana através de canais proteicos. Esse
transporte pode ser de natureza passiva, quando o fosfato se encontra em
grandes concentrações, sendo transportado por sistemas Pit, ou de natureza
activa, quando as concentrações exteriores de fosfato são baixas, entrando na
célula por meio de sistemas de transporte PST (phosphate-specific transport)
que apresentam grande afinidade para o fosfato. Os sistemas PST são do tipo
ABC, especificados mais abaixo.

• Enxofre: Requerido na síntese de substâncias como os aminoácidos cisteína e


metionina, alguns glícidos, biotina e tiamina. Como no caso do azoto, a maioria
dos organismos utiliza o enxofre na forma reduzida, obtido a partir de sulfatos,
na redução assimilatória de enxofre.

Factores de Crescimento
Na presença das fontes dos seus elementos fundamentais como carbono, fósforo,
azoto e enxofre e de energia, os microorganismos têm a capacidade de crescer e de se
reproduzirem. Os microrganismos possuem as enzimas e as vias metabólicas que
necessitam para a síntese dos componentes celulares requeridos para a sua
sobrevivência. No entanto, muitos microrganismos não possuem uma ou várias enzimas
essenciais, não podendo sintetizar os seus componentes indispensáveis, devendo obtê-
los ou aos seus precursores através do ambiente externo. Os compostos orgânicos que
não podem ser sintetizados na célula e são essenciais ou percursores de essenciais, são
designados de factores de crescimento. Estes englobam-se em três grupos principais,
considerados clássicos: 1) aminoácidos – síntese de proteínas, 2) purinas e
pirimidinas – síntese de ácidos núcleicos e 3) vitaminas – parte integrante ou os
próprios cofactores enzimáticos – que existem em pequenas quantidades. Alguns
microorganismos necessitam de mais de uma vitamina como é o caso da Entrococcus
faecalis, que precisa de 8 vitaminas diferentes.
As bactérias que necessitam de factores de crescimento, já que não têm a capacidade
de os sintetizar, são designadas vulgarmente de auxotróficas, enquanto que a
Escherichia coli é prototrófica já que é capaz de se desenvolver num meio simples,
sendo que a única fonte de carbono é a glicose, pois possui uma maquinaria enzimática
muito desenvolvia que lhe permite obter todas as outras substâncias que necessita, a
partir desta. Algumas bactérias têm a capacidade de fornecer factores de crescimento a
outras colónias diferentes da sua, como observado na figura abaixo.

Figura 4.1 – Staphylococcus aureus fornece NAD ao Haemophilus influenzae

O conhecimento da especificidade dos factores de crescimento permite quantificar a


contribuição para o crescimento de determinada substância. Através da realização de
uma curva de calibração realizada a partir de diferentes culturas de uma determinada
bactéria (pode ser Lactobacillus ou Streptococcus) com diferentes concentrações de
factor de crescimento, observa-se o crescimento total da cultura. Assim, para determinar
a quantidade de factor de crescimento numa cultura problema, compara-se o valor com
os da curva de calibração, através de extrapolação de valores. Estes ensaios de
quantificação são simples, sensíveis e específicos, sendo usados em substituição a
métodos mais avançados, no caso da biotina e da vitamina B12.
Muitos microorganismos são capazes de sintetizar vitaminas, o que tem sido
utilizado na indústria. Muitas vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis são obtidas
através de fermentações industriais, como é o caso da riboflavina (Cândida, Ashbya),
coenzima A (Brevibacterium), vitamina B12 (Pseudomonas), vitamina C (Erwinia), β-
caroteno (Dunaliella) e vitamina D (Saccharomyces).

Mecanismos de Transporte de Nutrientes


O primeiro passo no uso dos nutrientes é a sua captura pela célula. Este processo
deve ser específico, na medida em que nutrientes sem interesse para a célula não devem
ser assimilados, o que é conseguido pelo facto de a membrana ser selectiva e ser
permeável apenas a alguns tipos de substâncias. Como os microorganismos se
encontram normalmente em ambientes com concentrações baixas de nutrientes,
usualmente diluídos, é necessário que estes sejam transportados activamente, isto é,
contra o gradiente de concentração.
Existem diversos nutrientes que a célula tem de assimilar e já que este é um
processo específico, não é de estranhar que a célula possua diversos meios de captura
dessas mesmas substâncias. Os mais importantes mecanismos de transporte são a
difusão facilitada, o transporte activo e a translocação de grupo, sendo que os dois
últimos se realizam com gasto de energia e contra o gradiente de concentração.

Difusão facilitada
Algumas substâncias como o glicerol conseguem atravessar a membrana por
difusão passiva. Este é o processo no qual as moléculas se movem de uma zona de
concentrações mais elevadas para uma zona de concentrações mais baixas, ou seja, a
favor do gradiente de concentração. Como demonstrado na figura 4.2, a taxa de difusão
é proporcional à diferença de concentrações entre o interior e o exterior da célula e, por
isso, à medida que os nutrientes vão entrando, se não forem usados de imediato, essa
taxa de difusão diminui, já que a concentração no interior da célula aumenta. Moléculas
pequenas como H2O, O2 e CO2, atravessam a membrana por este processo simples.
Taxa de Difusão

Gradiente de Concentração

Figura 4.2 – Relação entre gradiente de concentração e a taxa de difusão, nos processos
de difusão simples e facilitada.
Moléculas maiores como iões e substâncias polares não conseguem atravessar a
membrana pelo processo anterior. Ao invés, a taxa de difusão é aumentada pela
presença de proteínas transportadores, designadas de permeases, que se encontram
integradas na membrana plasmática, sendo este novo processo designado de difusão
facilitada. Ao contrário da difusão simples, este mecanismo permite que pequenas
diferenças no gradiente de concentração aumentem o transporte de nutrientes. Neste
caso, os valores da taxa de transporte e do gradiente de concentração não são
proporcionais, sendo que, como observado na figura 4.2, o gráfico atinge um patamar
em que o transporte é constante, correspondendo ao momento em que todas as
permeases estão saturadas com nutrientes, não aumentado a taxa de transporte, mesmo
que se aumente a quantidade de nutrientes disponíveis, o que acontece com gráficos de
cinética enzimática. Esta não é a única semelhança com reacções enzimáticas, já que
também as permeases são específicas para determinadas substâncias. O que acontece é
que assim que o nutriente se liga
à parte exterior da proteína,
provoca uma mudança de
conformação na mesma, havendo
libertação da substância para o
interior. A proteína irá
eventualmente regressar à sua
conformação inicial, permitindo
a captura de novas substâncias,
sendo então um processo Figura 4.3 – Modelo da Difusão Facilitada
reversível. (figura 4.3)
Apesar da existência de proteínas de membrana, este processo só é possível na
presença de um gradiente de concentração. Assim que este desaparece o transporte
cessa, podendo ser mantido, no entanto, no caso dos eucariotas, com a passagem dos
nutrientes para outros compartimentos celulares ou, no caso dos procariotas, ser
utilizado rapidamente no metabolismo.

Transporte activo
Quando os nutrientes já se encontram em concentrações elevadas dentro da célula,
apesar da difusão facilitada ser um processo bastante eficiente, este não tem a
capacidade de transportar moléculas contra o seu gradiente de concentração. Esta
situação ocorre na maioria das vezes já que, como foi referido, as bactérias encontram-
se variadas vezes em ambientes muito diluídos. Neste caso, dois processos são vitais, o
transporte activo propriamente dito e a translocação de grupo.
O transporte activo permite a passagem de nutrientes para um compartimento de
concentração superior, tendo, para o efeito, de gastar energia metabólica. Este é um
processo em muito semelhante à difusão facilitada, já que faz igualmente uso de
permeases, tão especificas quanto as anteriores, diferindo no gasto de energia e na
capacidade dos últimos em desenvolverem gradientes de concentração mais definidos.
Assim, qualquer inibidor que bloqueie a produção de energia vai igualmente impedir o
transporte de substâncias para o interior da célula.
Os sistemas de transporte activo são do tipo ABC (ATP-binding cassette), existente
nas bactérias, archae e nos eucariotas. Normalmente, estes sistemas são constituídos por
dois domínios membranares, hidrofóbicos, associados na sua face citosólica a dois
domínios de ligação ao ATP (ver figura 4.4). Os domínios intramembranares formam
um poro enquanto que os domínios de ligação do ATP se ligam a este, hidrolizando-o,
permitindo então, o transporte da substância. Estes transportadores utilizam ainda
proteínas de ligação ao substrato que se localizam no periplasma em bactérias gram-
negativas ou que se encontram associadas aos lípidos membranares da face externa das
bactérias gram-positivas. As substâncias que entram nas bactérias garm-negativas têm
de atravessar a membrana externa antes de passarem pelos transportadores ABC,
podendo neste espaço ocorrer outros tipos de transporte activo. Se a molécula for
pequena pode ser usada uma porina vulgar como as OmpF enquanto que se a molécula
for de maiores dimensões devem passar por meio de porinas especializadas.

Figura 4.4 – Esquema de transportadores ABC


As bactérias podem também dispor de energia para este tipo de transporte, a partir
de gradientes protónicos através da membrana. Um exemplo muito estudado é o da
permease de lactose da E. coli que transporta uma molécula de lactose para o interior da
célula, ao mesmo tempo que um protão entra dentro da célula (este gradiente protónico
é conseguido pela actividade da cadeia respiratória – figura 4.5, (1)). Este tipo de
transporte em que duas moléculas são transportadas na mesma direcção é designado de
simporte. Pensa-se igualmente, que a ligação de um protão a uma proteína
transportadora muda a sua forma, aumentando a afinidade para a substância que é co-
transportada. A E. coli usa este simporte para transportar aminoácidos e ácidos
orgânicos como o succinato e o malato.

O gradiente protónico pode ser usado no transporte activo de forma indirecta,


quando associado à formação de um
gradiente de iões sódio. Por exemplo, o
transporte de sódio nas E. coli liberta
sódio para o exterior enquanto existe
movimento de protões para o interior,
transporte designado de antiporte. (figura
4.5, (2)) Este gradiente de sódio formado à
custa do movimento de protões é que vai
permitir o transporte de glícidos e
aminoácidos, já que a sua ligação às
proteínas transportadores (figura 4.5, (3))
provoca uma mudança de conformação
das mesmas fazendo com que as
moléculas se orientem na direcção do
interior da célula (figura 4.5, (4)). Como a
concentração em sódio no interior é baixa,
este irá dissociar-se da proteína, passando
para o interior da célula, assim como a
molécula a transportar. (figura 4.5, (5)) Figura 4.5 – Transporte activo, usando
gradientes de protões e sódio
Muitas vezes os microorganismos possuem mais de um sistema de transporte para o
mesmo nutriente, como é mais uma vez o caso da E. coli que possui 5 sistemas de
transporte para a galactose, 3 para os aminoácidos leucina e glutamato e 2 para o
potássio. A importância desta variedade reside na possibilidade de competição que
promove a adaptação a vários ambientes já que podem diferir a nível da afinidade, da
energia gasta ou mesmo na regulação.
A translocação de grupo é um mecanismo de transporte activo no qual as
moléculas a transportar sofrem alterações químicas enquanto são levadas para o interior
da célula. O grupo mais estudado é o sistema fosfoenolpiruvato: açúcar
fosfotransferase (PTS) que transporta uma grande variedade de açúcares nas células
procarióticas através da sua fosforilação usando o fosfoenolpiruvato (PEP) como dador
de fósforo, segundo a reacção abaixo:

Reacção 4.2 – PEP + Açúcar (fora célula)  Piruvato + Açúcar – P (dentro célula)

O sistema PTS consiste em duas enzimas, EI e EII e uma proteína de baixo peso
molecular, estável ao calor, HPr.
F igura
4.6 –

Translocação de grupo: o sistema de transporte PTS

A HPr e a EI são citoplasmáticas, enquanto que a EII é mais variável na sua


estrutura, composta frequentemente por três domínios: EIIA (ou EIII) que é
citoplasmática e solúvel, podendo estar ou não ligada ao domínio seguinte consoante o
açúcar que é transportado, a EIIB, hidrofilica, mas frequentemente associada ao terceiro
domínio e EIIC, uma proteína hidrofóbica inserida na membrana. O processo de
transporte, exemplificado na figura 4.6, consiste na passagem de um fósforo altamente
energético, do fosfoenolpiruvato, com auxílio da EI e da HPr, para a EII, através dos
seus domínios hidrofílicos (1). Assim, a molécula de açúcar atravessa a membrana
através do domínio EIIC (2), sendo depois fosforilada pelo domínio EIIB (3). A enzima
EII é específica para alguns açúcares variando em cada sistema PTS, enquanto que a
enzima EI e a proteína HPr são comuns a todos os sistemas PTS.
Este sistema está largamente distribuído nos procariotas, à excepção de alguns
Bacillus que possuem o sistema PTS e ainda o glicolítico, enquanto que algumas
bactérias aeróbias parecem não apresentar PTS. As famílias Escherichia (as E. coli
transportam glicose, frutose, manitol, sacarose e outros por este mecanismo),
Salmonella, Staphylococcus e outras bactérias anaeróbias facultativas possuem estes
sistemas, assim como algumas aeróbias obrigatórias.
Estas proteínas do sistema fosfoenolpiruvato: açúcar fosfotransferase actuam
também como quimioreceptores para a quimiotaxia.

Transporte do ferro
A assimilação de ferro nos microorganismos está dificultada, já que o ião férrico
(Fe3+) e os seus derivados são extremamente insolúveis, o que o torna pouco disponível
para ser capturado. Assim, os microorganismos (bactérias e fungos) desenvolveram
mecanismos de assimilação de ferro, através da secreção de sideróforos – moléculas de
baixo peso molecular que são capazes de complexar o ferro férrico, provendo a célula
com esse ião.
Estas moléculas podem ser hidroxamatos ou fenolatos-catecolatos. Muitos fungos
produzem ferricromo (figura 4.7, (a)), um hidroxamato, enquanto que as E. coli
produzem um catecolamato designado de enterobactina. (figura 4.7, (b)) Pensa-se que
cada ião ferro é complexado por três sideróforos formando um complexo octaédrico
(figura 4.7, (c)) (número de coordenação igual a seis).
Assim que o complexo ferro-sideróforo atinge a superfície da célula liga-se ao seu
receptor podendo ser transportado inteiramente para o interior da célula por
transportadores do tipo ABC ou libertar o ferro directamente. Nas E. Coli o ião ferro
libertado no espaço periplasmático é transportado pela membrana com auxílio de um
transportador. Após entrar na célula é
reduzido à sua forma ferrosa (Fe2+) para
ser incorporado em citocromos e enzimas.
O ferro é tão importante para a célula
que podem existir vários meios de
aquisição de maneira a que a célula seja
abastecida de acordo coma s suas
necessidades.

Figura 4.7 – Sideróforos: (a) Ferricromo – evidenciado


o grupo hidroxamato; (b) Enterobactina – evidenciado
o grupo catecol; (c) Complexo Ferro-Enterobactina

Meios de Cultura
Os estudos de microbiologia dependem largamente na habilidade para crescer e
manter os microorganismos em laboratório, o que apenas é possível quando existem
meios de cultura apropriados.
Um meio de cultura pode ser definido como uma preparação líquida ou sólida
usada para o crescimento, transporte e preservação de microorganismos em laboratório.
Para ser efectivo deve conter os nutrientes necessários ao crescimento do
microorganismo em questão, sendo que meios específicos são bastante importantes para
a identificação, isolamento e estudos acerca de um determinado microorganismo. O
conhecimento de habitat de uma bactéria permite a aproximação da constituição do
respectivo meio de cultura.

Classificação dos meios de cultura quanto à composição


• Meios sintéticos: estes meios são quimicamente definidos, já que todos os seus
componentes são conhecidos. São usados em culturas de microorganismos
fotolitoautotróficos que conseguem crescer em meios relativamente simples
contendo CO2 como fonte de carbono (sob a forma de Na2CO3 ou HCO3-),
nitrato ou amónia como fonte de azoto, sulfato, fosfato e outros minerais.
(tabela 4.4) Alguns organismos quimioorganoheterotróficas podem crescer em
meios constituídos apenas por glicose como fonte de carbono e sais de amónia
como fonte de azoto.

Meio de Cultura Sintético


Substância Função Quantidade (grama)
Glucose Fonte Carbono e Energia 1
NH4PO4 Fonte de Azoto; Tampão 5
K2HPO4 Fonte de Fósforo; Tampão 1
NaCl Sal Inorgânico 5
MgSO4.7H2O Fonte de Magnésio e Enxofre 0,2
Água destilada Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

Tabela 4.4 – Exemplo de um meio de cultura sintético

• Meios complexos: ao contrário dos meios sintéticos, estes são constituídos por
substâncias acerca das quais não se conhece a composição química exacta. Entre
elas encontram-se as peptonas – fracções de proteínas hidrolisadas, contendo,
por isso, aminoácidos e péptidos, resultante da digestão proteolítica de fontes de
proteínas, extractos de carne – contêm aminoácidos, nucleótidos, minerais,
vitaminas e extractos de leveduras – fontes de vitamina B assim como de
compostos carbonados e nitrogenados. Os meios complexos mais comuns são o
caldo nutritivo (tabela 4.5), o caldo de soja triptica e o agar de MacConkey
(tabela 4.6).

Caldo Nutritivo Vulgar

Substância Função Quantidade (grama)


Extracto de carne Fonte de péptidos, glícidos e vitaminas 3

Peptona Fonte de péptidos e aminoácidos 5

NaCl Mantém equilíbrio osmótico 5

Água Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

Tabela 4.5 – Constituição de um caldo nutritivo vulgar


• Meios enriquecidos: meios aos quais são adicionados sangue ou soro e outras
substâncias nutritivas, cujo objectivo é promoverem o desenvolvimento de
bactérias com crescimento lento.

Classificação dos meios de cultura quanto ao estado físico


Os meios podem ser classificados como líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Quando
se deseja um meio sólido, um meio líquido pode ser solidificado através da adição de
agar – polímero sulfatado composto principalmente por D-galactose, 3,6-anidro-L-
galactose e ácido D-glucorónico, extraído das algas vermelhas – usando-se
normalmente agar a 1,5%. O agar é muito popular para este fim, pois após ter sido
fundido em água fervida pode ser arrefecido sem endurecer até aos 40º C. É também um
bom agente endurecedor pois não é degradado pela maioria das bactérias.
Para solidificação pode usar-se igualmente sílica gel para o crescimento de bactérias
autotróficas em meios sem substâncias orgânicas ou para determinar as fontes de
carbono de seres heterotróficos em meios com diferentes substâncias orgânicas.
Para meios semi-sólidos acrescentam-se menores quantidades de agar,
normalmente, agar a 7%.

Classificação dos meios de cultura quanto à função


• Meios selectivos: Como o próprio nome indica, estes meios promovem o
crescimento de uma espécie específica. Por exemplo, os sais biliares ou
corantes como a fucsína e o cristal violeta inibem o crescimento das bactérias
gram-positivas, não afectando, no entanto, o desenvolvimento das gram-
negativas. Vários tipos de agar são utilizados na detecção das E. coli e outras
bactérias relacionadas contendo substâncias que inibem o crescimento de
bactérias gram-positivas. Esta selectividade também pode ser conseguida usando
nutrientes que determinada cultura metaboliza, como o caso da celulose, usada
no isolamento de bactérias que digerem celulose.
• Meios diferencias: estes são meios que permitem a distinção entre diferentes
tipos de bactérias, permitindo identificar determinado microorganismo de
acordo com as suas características biológicas. O agar sanguíneo é
simultaneamente um meio enriquecedor e diferencial. Permite a distinção entre
bactérias hemolíticas ou não hemolíticas. As primeiras produzem zonas limpas à
volta das suas colónias, resultando na destruição das hemácias (figura 4.8). Por
seu turno o agar de MacConkey
(tabela 4.6) é ao mesmo tempo um
meio diferencial e selectivo. Como
contém lactose, as colónias que
fermentam a lactose surgem rosadas –
também podem ser identificadas com
indicador de pH (ácido láctico) –
podendo ser distinguidas facilmente
das restantes colónias, já a presença de
Figura 4.8 – Cultura de Streptococcus β-
sais biliares confere-lhe características hemolíticos
de um meio selectivo.

Agar MacConkey
Substância Função Quantidade (grama)
Digesto pancreático de gelatina Fonte péptidos e aminoácidos 17
Digesto pancreático de caseína Fonte péptidos e aminoácidos 1,5
Digesto de carne animal Fonte péptidos, vitaminas e nucleótidos 1,5
Lactose Indicador diferencial 10
Sais biliares Inibidor gram-positivas 1,5
NaCl Mantém equílibrio osmótico 5
Vermelho neutro Indicador pH 0,03
Cristal violeta Inibidor gram-positivas 0,001
Agar Agente solidificante 14
Água destilada Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

Tabela 4.6 – Constituição do Agar de MacConkey

Isolamento de culturas puras


No meio natural, as bactérias crescem em populações complexas e misturadas,
contendo várias espécies diferentes. Para o estudo de uma cultura individual é
fundamental que essa espécie esteja isolada das restantes, isto é, uma cultura pura. As
técnicas de purificação são de grande importância, pois muitos agentes patogénicos
causadores das principais doenças bacterianas humanas foram isolados, o que permitiu
o estudo aprofundado dessas culturas específicas.

Placas de cultura espalhadas


Quando as culturas estão suficientemente espalhadas numa superfície de agar que
permita que todas as células cresçam em colónias completamente separadas, cada
colónia representa uma cultura pura. A chamada cultura espalhada é uma maneira fácil
e simples de obter culturas puras (figura 4.9). São conseguidas através da transferência
de um pequeno volume (deve conter entre 30 e 300 células) de uma solução diluída
(figura 4.9, (2)), de uma mistura microbiana, para o centro de uma placa de agar, sendo
depois espalhada igualmente em toda a sua dimensão (figura 4.9, (4)), com uma ansa
esterilizada (figura 4.9, (3)). As células dispersas na placa irão desenvolver-se me
colónias separadas, podendo ser usada para a contagem da população microbiana.

Figura 4.9 – Técnica das placas de cultura espalhadas

Placas de cultura: método das estrias


Nesta técnica, a mistura microbiana é transferida
para uma caixa de petri, coberta de agar, com uma ansa
esterilizada, desenhando bandas na superfície, com
diversos padrões. Durante o processo, células isoladas,
libertadas durante a dispersão da mistura, irão
desenvolver-se em colónias separadas (figura 4.10).
Em ambos os processos descritos, o sucesso do Figura 4.10 – Colónias bacterianas
isolamento depende da distância entre as células. em agar, fixadas pelo método das
placas de cultura em bandas
Culturas em placas inoculadas
É uma técnica usada largamente em colónias de bactérias e fungos. A amostra
original é diluída várias vezes (de acordo com a figura 4.11), de maneira a reduzir a
população microbiana para obter colónias separadas quando colocadas na placa.
Pequenos volumes das amostras diluídas são misturadas com agar liquido, arrefecido
aproximadamente aos 45º C, sendo vertidas directamente para caixas de petri estéreis.
Após o endurecimento do agar, cada célula é fixada e forma uma colónia individual. As
placas que contêm entre 30 a 300 colónias são contadas.

Figura 4.11 – Técnica das placas estéreis

Morfologia e crescimento das colónias


As diferentes formas e tamanho das colónias (figura 4.12), permitem a sua
identificação de uma maneira
simples mesmo quando existem
diversas colónias na mesma
cultura, servindo igualmente para
o seu isolamento. No ambiente
natural, muitas bactérias e fungos
parecem crescer em biofilmes,
podendo, no entanto, formar Figura 4.12 – Morfologia de Colónias Bacterianas
colónias discretas.
Normalmente, o crescimento mais rápido das células ocorre na periferia da colónia
podendo mesmo ocorrer autólise nas antigas porções centrais das colónias. Estas
diferenças de velocidade estão relacionadas com os
gradientes de nutrientes, oxigénio e os próprios
produtos tóxicos produzidos pelas colónias. Assim,
à periferia existem quantidades perfeitas de
oxigénio e nutrientes, enquanto que no centro, que é
mais denso, a difusão está dificultada, assim como a
eliminação de produtos tóxicos levando ao
afrouxamento ou mesmo paragem do crescimento
no centro da colónia.
As bactérias a crescer me meios sólidos de agar
podem formar colónias de formas complexas. Esses
padrões dependem da disponibilidade dos nutrientes
e da dureza da superfície. Ainda é desconhecido o
mecanismo exacto da formação de tão distintos
padrões, no entanto julga-se estar relacionado com a
concentração de nutrientes, a quimiotaxia bacteriana
Figura 4.13 – Exemplos de
e mesmo a presença de liquido à superfície da colónias de Bacillus subtillis
colónia, assim como a comunicação celular.

Bibliografia usada para a aula nº 4:


Slides das Teóricas
Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M.
Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 5ª edição, McGrawHill,
Cap. 5