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AULA Nº6 – CONTROLO

MICROBIOLÓGICO POR
AGENTES QUÍMICOS E FÍSICOS
Definição de Termos Frequentemente Utilizados
Existem tratamentos que tanto podem inibir o crescimento, como também matar
determinados microrganismos dependendo das condições. Em determinadas situações é
necessário eliminar todos os microrganismos de um objecto. No entanto, outras
situações requerem apenas a destruição parcial da população microbiana.

Esterilização: processo através do qual todas as células vivas, esporos viáveis e


vírus são removidos de um objecto ou habitat. Quando a esterilização é efectuada por
um agente químico, este último designa-se esterilizante.

Desinfecção: morte, inibição ou remoção de microrganismos potencialmente


patogénicos, normalmente aplicada apenas em objectos inanimados. A desinfecção tem
como objectivo principal a destruição, mas também reduz substancialmente a população
microbiana. Alguns esporos e microrganismos podem resistir à desinfecção, portanto
esta não significa necessariamente esterilização.

Sanitização: relacionada com a desinfecção, em que a população


microbiana é reduzida a níveis considerados seguros pelos padrões de saúde
pública, ie, níveis não prejudiciais.

Anti-sepsia: prevenção de infecção ou sepsis que é conseguida através de anti-


sépticos. Estes são agentes químicos aplicados a tecidos para prevenir infecção através
da morte ou inibição de crescimento; eles também reduzem a população microbiana.
Como são aplicados a tecidos, são menos tóxicos que os desinfectantes.

Um desinfectante ou anti-séptico pode ser extremamente eficaz contra um


determinado grupo de microrganismos, causando a sua total destruição (morte), neste
caso esse agente é designado bactericida, fungicida, algicida ou viricida. Outros
químicos não matam, mas previnem o crescimento dos microrganismos; se estes agentes

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forem removidos o crescimento é retomado, estes agentes designam-se bacteriostático,
fungistático.

Cinética da Morte Bacteriana


A população microbiana não é morta instantaneamente quando exposta a um
agente letal, a morte dá-se de uma forma progressiva. A morte populacional, como o
crescimento populacional, é geralmente exponencial, ie, há uma igual redução na
população para intervalos de tempo constantes.

O logaritmo do nº de bactérias sobreviventes versus o tempo de exposição do


microrganismo ao agente resulta numa recta:

Neste exemplo o valor do D121 (temperatura = 121ºC) é de 1 minuto. Este valor


corresponde ao tempo necessário para que haja redução de 90% da população. O
parâmetro D será discutido em maior pormenor mais à frente.

A bactéria é definida como morta se não houver crescimento e reprodução


quando inoculada numa cultura que normalmente apoiaria o seu crescimento.

Condições que Influenciam a Eficiência da Actividade


dos Agentes Antimicrobianos
A eficiência de um agente microbiano depende de pelo menos 6 factores:

Dimensão da população: devido ao facto de uma fracção equivalente da


população microbiana ser morta durante cada intervalo, uma população maior demorará
mais tempo a morrer do que uma população menor.

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Composição da população: a eficiência de um agente microbiano varia muito
com a natureza dos organismos a serem tratados, isto porque os microrganismos diferem
grandemente quanto à sua susceptibilidade. Os endosporos bacterianos são muito mais
resistentes aos agentes antimicrobianos do que a maioria das células vegetativas e as
células jovens são menos resistentes que células maduras.

Concentração ou intensidade do agente antimicrobiano: normalmente,


quanto mais concentrado ou intenso o agente químico, mais rapidamente os
microrganismos são destruídos. Contudo, a eficiência do agente não se encontra
directamente relacionada com a sua concentração ou intensidade. Até um certo ponto,
um pequeno aumento da concentração do agente leva a um aumento exponencial da sua
eficiência; a partir desse ponto, aumentos podem não elevar o índice de morte. Por
vezes um agente pode até ser mais eficiente quando menos concentrado.

Tempo de exposição: quanto mais tempo a população é exposta ao agente


antimicrobiano, mais microrganismos são mortos.

Temperatura: normalmente uma elevação na temperatura a que actua o agente


estimula a actividade deste último.

Ambiente Local: A população a ser controlada está rodeada de factores


ambientais que tanto podem proteger como expor os microrganismos à destruição. Por
exemplo, como o calor mata mais eficazmente a um pH ácido, comidas ácidas são mais
facilmente pasteurizadas do que comidas com pH mais elevado como o leite. Outro
factor ambiental importante é a presença de matéria orgânica. Esta protege os
microrganismos do aquecimento e de químicos; por esta razão é necessário limpar um
objecto antes que este seja desinfectado ou esterilizado.

Métodos Físicos de Controlo Microbiano


Os quatro agentes físicos mais utilizados no controlo microbiano são:

Calor: é um dos métodos mais utilizados para destruir microrganismos. Pode ser
aplicado tanto o calor húmido como o calor seco. Devido ao calor ser tão utilizado no
controlo microbiano, é essencial que existam parâmetros de medida da eficiência da
morte pelo calor:

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TDP (thermal death point): a mais baixa temperatura à qual uma suspensão
microbiana é morta em 10 minutos.

TDT (thermal death time): o tempo mais curto necessário para matar todos os
organismos numa suspensão microbiana a uma temperatura específica e sob condições
definidas.

Valor D (decimal reduction time):


unidade mais realista e mais precisa já
que é teoricamente impossível “destruir
completamente” os microrganismos
numa amostra. Traduz o tempo
necessário para matar 90% da população
(redução da população para 1/10) de uma
amostra a uma dada temperatura. O valor
D é inversamente proporcional à
temperatura como ilustrado no gráfico.
Os valores D são utilizados para fazer
uma estimativa da resistência de um microrganismo a diferentes temperaturas através do
cálculo do valor Z, sendo que este é o aumento de temperatura necessário para reduzir o
valor D a 1/10.

Valores de D e Z de alguns
organismos patogénicos:

- Calor húmido:
mata eficazmente bactérias,
vírus e fungos. A exposição a
água a ferver durante 10 min é suficiente para destruir células vegetativas e esporos
eucarióticos. Infelizmente a temperatura de ebulição da água (100ºC) não é elevada o
suficiente para destruir endosporos bacterianos, estes podem sobreviver horas na
ebulição. Assim concluímos que a ebulição não esteriliza.

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Condições aproximadas
para a morte pelo calor
húmido:

Esterilização por calor húmido: deve ser realizada a temperaturas acima dos 100ºC para
destruir todos os esporos bacterianos, isto requer o uso de vapor saturado sob pressão. É
conseguida com auxílio de um AUTOCLAVE:

- numa atmosfera de vapor de água, isenta de ar, todas as bactérias são mortas, mesmo
sob a forma esporulada, em 20 min – 115/120ºC.

- água é fervida para produzir vapor que é libertado para o interior da câmara do
autoclave; o ar que inicialmente se encontra no interior da câmara é forçado a sair até
que a câmara esteja cheia de vapor saturado e que os outlets estejam fechados; vapor
saturado e quente continua a entrar na câmara até que sejam atingidos os valores de
temperatura e pressão desejados (geralmente 121ºC), a esta temperatura o vapor
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saturado destrói todas as células vegetativas e endosporos de um volume pequeno em 10
a 12 min mas o tratamento continua até aos 15 min para maximizar a segurança.

- Usos: meios de cultura; objectos de borracha; certos plásticos; vidro; instrumentos de


colheita; descontaminação de culturas microbianas, produtos patológicos, objectos
contaminados.

Efeito do ar retido na temperatura de autoclavagem:

Indicadores de esterilização:

- indicadores biológicos: utilizam-se endosporos de Bacillus stearothermophilus (muito


resistentes); depois da autoclavagem a cultura é incubada por vários dias, se não houver
crescimento bacteriano significa que a esterilização foi bem sucedida; possui a
desvantagem de demorar algum tempo.

- indicadores químicos: papel indicador que muda de cor quando a temperatura é


suficiente para a autoclavagem; fita cola na qual aparece a palavra estéril; mudança de
cor ou aparecimento da palavra estéril significa que a esterilização foi eficaz.

- Calor seco: os itens a serem esterilizados são colocados num forno a 160-
170ºC durante 2-3 horas. A morte bacteriana resulta da oxidação dos constituintes
celulares e desnaturação de proteínas (destruição de microrganismos a temperatura
vizinha da de carbonização da matéria orgânica). Apesar de ser menos eficaz que a
esterilização por calor húmido, o calor seco não provoca a corrosão do vidro ou metais e
pode ser utilizado para esterilizar pós, óleos, etc. No entanto, o calor seco não é
indicado para materiais termossensíveis, como alguns plásticos e borracha.

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- Outros processos de controlo microbiano pelo calor:

- Pasteurização (leite):

Clássica: 63ºC por 30 min.

HTST (high temperature short-term pasteurization): utilizada para


maiores quantidades da amostra; 72ºC por 15 seg, seguido de refrigeração rápida.

UHT (ultrahigh-temperature sterilization): 140-150ºC por 1-3 seg;


produtos submetidos a este método não necessitam de refrigeração e podem ser
conservados a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 meses.

Tindalização: método descontínuo de aquecimento de material; com um


1º aquecimento eliminam-se as células vegetativas, esperam-se 24 hrs, sendo que neste
intervalo de tempo os esporos germinam, sendo depois eliminados pelo 2º tratamento
térmico.

Baixas Temperaturas: apesar do ênfase estar sobre a destruição dos microrganismos,


muitas vezes a técnica de controlo mais conveniente é a inibição do seu crescimento e
reprodução pelo uso de refrigeração ou congelação. A congelação é um óptimo método
de conservação e armazenamento de produtos por um longo prazo, já a refrigeração
conserva os produtos apenas por um curto período de tempo, pois esta desacelera a
reprodução e crescimento microbiano mas não os trava por completo.

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Ultrafiltração: excelente forma de reduzir a população microbiana em soluções de
material temossensível e por vezes também pode ser utilizada para esterilizar soluções.
O filtro remove os microrganismos mas não os destrói. Existem dois tipos de filtros:

- Filtros de profundidade

- Membranas filtrantes: filtros circulares de membranas porosas feitas de nitrato


de celulose, acetato de celulose, policarbonato e outros materiais sintéticos. Membranas
com poros de aproximadamente 2 μm são utilizadas para remover a maior parte das
células vegetativas, mas não removem vírus. As membranas são normalmente
antecedidas de filtros de profundidade que removem as partículas de maiores dimensões
para que estas não entupam a membrana filtrante. A solução é sugada pelos filtros com a
ajuda de um aspirador e é colectada num recipiente previamente esterilizado.

Segurança no trabalho: o ar também pode ser esterilizado por filtração.

Câmaras biológicas de segurança de fluxo laminar utilizando filtros HEPA (high


efficiency particule air) é um dos sistemas d filtração de ar mais importantes. A câmara
de fluxo laminar força o ar a atravessar os filtros HEPA. Isto protege um trabalhador dos

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microrganismos a serem manipulados (vírus tumorais, DNA recombinante,
Mycobacterium tuberculosis) dentro da câmara e impede a contaminação do ar.

Hotes de fluxo laminar de alta segurança contendo filtros HEPA (poro de 0,2 μm).

Radiações: consiste em incidir um determinado tipo de radiação no material a


esterilizar.

UV: possui um fraco poder penetrante; utilizada na esterilização de superfícies e


salas, sendo que as lâmpadas de UV têm de estar desligadas quando estas superfícies ou
salas estão a ser usadas, devido aos danos que esta radiação poderá causar na pele e
olhos.

Ionizante: possui um elevado poder penetrante, daí ser tão eficaz na


esterilização; destrói endosporos bacterianos e células vegetativas, no entanto não é
eficaz contra vírus; radiação gama do cobalto 60 é utilizada para esterilizar antibióticos,
hormonas, suturas, alimentos, plásticos e material descartável; possui a desvantagem de
ser muito dispendioso.

Agentes Químicos Anitmicrobianos


Agentes químicos são normalmente utilizados na desinfecção e anti-sepsia,
sendo que muitos factores influenciam a eficiência desses agentes.

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Características de um desinfectante desejável:

- largo espectro
- activo em fracas concentrações e na presença de matéria orgânica
- não tóxico para as pessoas
- não corrosivo
- inodoro, ou odor agradável
- baixa tensão superficial
- solúvel em água e em lípidos
- estável e barato
- acção rápida
- não ser afectado por factores ambientais (luz)
- compatível com sabões, detergentes e outros produtos químicos
- efeito residual na superfície
- não poluente

Principais agentes desinfectantes e anti-sépticos:

Fenóis e derivados

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Actividade:
- bactericida contra as formas vegetativas incluindo o M. tuberculosis
- sem acção sobre endosporos, à temperatura ambiente

Vantagens:
- activos contra M. tuberculosis
- efectivos na presença de matéria orgânica
- mantêm-se activos nas superfícies bastante tempo após aplicação

Desvantagens:
- odor desagradável
- podem causar irritação da pele

Álcoois

Actividade: são bactericidas e fungicidas mas não esporicidas

Aplicações:
- anti-sepsia da pele e instrumentos médicos (termómetros)
- desinfecção e descontaminação de superfícies e bancadas

Compostos Halogenados

São solúveis em água e libertam o iodo lentamente para minimizar


irritações e queimaduras.

Actividade:

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- importantes agentes antimicrobianos

- destroem todas as formas vegetativas mas não são esporicidas

Aplicações:

- iodo é usado como anti-séptico para a pele

- o cloro é usado no tratamento de águas municipais e


piscinas e na indústria alimentar

Pastilhas de cloro

- ácido peracético: utilizado como alternativa a compostos clorados;


desinfectante hospitalar de superfícies (instalações, equipamentos e utensílios) em
contacto com matéria orgânica.

Aldeídos

Modo de acção: inactivam ácidos nucleicos e proteínas, originam ligações cruzadas e


alquilações.

Actividade:
- eficazes contra formas vegetativas e esporos
- podem ser utilizados como químicos esterilizantes

Aplicações: desinfecção de equipamentos hospitalares e de laboratório.

Nota: o glutaraldeído apresenta vantagens relativamente ao formaldeído, já que é menos


irritante e mais activo.

Compostos de amónio quaternário

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Actividade: destroem formas vegetativas microbianas, mas não são esporicidas nem
actuam contra o M. tubercolosis.

Aplicações: desinfecção de talheres e pequenos instrumentos, anti-sépticos para a pele.

Vantagens:

- estáveis
- não tóxicos
- suaves e não irritantes

Desvantagens: são inactivados pela água dura e sabões.

Gases esterilizantes

Actividade:

- microbicida e esporicida
- o Oet é um agente alquilante de elevado poder penetrante

Aplicações:
- material descartável empacotado em papel ou polietileno
- artigos de plástico (caixas de petri, seringas, suturas, catateres)
- Oet é explosivo e tem acção irritante nas mucosas. Requer a utilização de
câmaras especiais que controlam a concentração de Oet, temperatura e humidade
- condições de esterilização: 5 a 8 hrs a 38ºC ou 3 a 4 hrs a 54ºC, 40-50% de
humidade, concentração Oet 700 mg/l

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Níveis de actividade dos desinfectantes:

Avaliação da Eficiência do Agente Antimicrobiano

Dilui-se o desinfectante e adiciona-se o microrganismo que fica a incubar


durante x min. Ao fim desse tempo o microrganismo é replicado para um meio de
cultura novo, aguardando-se 1 a 2 dias par verificar se ele se desenvolveu ou não.

Determinação do índice de fenol:

Teste de avaliação em que a actividade do desinfectante é comparada com a do fenol.

Técnica:

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- série de diluições do fenol e do desinfectante em estudo, inoculam-se com as
bactérias (Salmonella typhi e Staphylococcus aureus)
- colocar em banho de água a 20 ou 37ºC
- subculturas em meio novo com intervalos de 5 min e incubar 2 ou mais dias

A diluição que inibe o crescimento ao fim de 10 min de contacto mas que não inibe ao
fim de 5 min é utilizada para calcular o índice de fenol.

Quanto mais elevado o índice de fenol  mais eficaz o desinfectante.

Um índice de fenol maior que 1  Desinfectante mais eficaz que o fenol.

Coeficiente de fenol (CF) de alguns desinfectantes:

Bibliografia usada para a aula nº 6

Slides das Teóricas

Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood e Christopher J.
Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill, Cap. 7

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