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AULA Nº 8 – Metabolismo Biossintético

O anabolismo é a síntese de moléculas complexas a partir dos produtos


provenientes do catabolismo. Envolve uma série de passos. Basicamente, primeiramente
formam-se pequenas moléculas que são chamadas de metabolitos percursores. Depois,
dá-se a síntese dos monómeros (exemplo: aminoácidos, nucleótidos, carbohidratos
simples e lípidos simples), que vão dar origem às moléculas complexas, a partir dos
metabolitos percursores. De seguida, dá-se a síntese das macromoléculas (exemplo:
proteínas, ácidos nucleicos, etc.) e a reunião destas mesmas nas estruturas celulares.

Este processo requer energia e ela aparece-nos sob a forma de ATP. Além de
energia, o anabolismo requer uma fonte de electrões reservada, pois o anabolismo é um
processo redutivo e os electrões são adicionados às pequenas moléculas enquanto estas
são usadas para formar as macromoléculas.

Resumindo…

Etapas da biossíntese das macromoléculas:

• Produção de unidades moleculares;


• Activação desses monómeros com dispêndio de ATP;
• Polimerização dos monómeros activados.

Uma das macromoléculas sintetizadas nos procariotas é o peptidoglicano.

A Síntese do Peptidoglicano tem três fases:

1. Fase citoplasmática
2. Fase membranar
3. Fase parietal
Fig 8.1: Síntese do peptidoglicano

Esta síntese envolve dois “carriers”. O primeiro, uridina difosfafo (UDP)


funciona nas reacções citoplasmáticas. No primeiro passo da síntese do peptidoglicano,
derivados de UDP do N-acetilmurárico e da N-acetilglucosamina são formados. De
seguida, há uma adição sequencial de aminoácidos ao UDP-NAM, de modo a formar o
pentapéptido UDP – NAM, sendo que o ATP é necessário neste passo. Este produto é a
primeira unidade importante sintetizada no citoplasma.
De seguida, este péptido liga-se através de uma ligação fosfato ao bactoprenol
que é considerado o segundo “carrier”, localizado no lado citoplasmático da membrana
plasmática. O intermediário resultante é um álcool com 55 carbonos. Depois, UDP
transfere NAG para o complexo bactoprenol-NAM-pentapéptido de modo a gerar o
NAM-NAG-pentapéptido. Este último está ligado ao bactoprenol, que vai transportar o
péptido pela membrana, desde a parte interna da membrana para a parte externa da
membrana, onde vai ser sintetizado o peptidoglicano em si.
Após isto, o NAM-NAG-pentapéptido, liga-se, já na parte externa da membrana,
a uma cadeia de peptidoglicano. É esta unidade que vai ser libertada para o espaço
periplasmático, sendo que o bactoprenol é desfosforilado (ficando apenas com um
fosfato ligado a si) e volta para o lado citoplasmático, onde poderá participar numa nova
síntese. (ver figura 8.1 para síntese esquematizada)
Alguns antibióticos actuam a este nível, de modo a interferirem na síntese do
peptidoglicano. Por exemplo, a bacitracina impede que haja a desfosforilação do
bactoprenol.
O último passo na síntese do peptidoglicano é a transpeptidação, onde se criam
ligações peptídicas entre as cadeias de peptidoglicano. Antes de acontecer a
transpeptidação propriamente dita, há que haver uma descarboxilação do terminal D-
alanina, que vai fornecer a energia necessária para que a transpeptidação aconteça.

Fig 8.2: Transpeptidação – Reacções de transpeptidação na formação de


peptidoglicano em E. coli e S. aureus.

Na transpeptidação estão envolvidas também as enzimas PBP – Penicillin


Binding Proteins, que existem no folheto externo da membrana. Quando existem
mutações nestas, as bactérias ficam sujeitas a alterações por parte da penicilina e da
vancomicina.
Além do mais, a penicilina liga-se às PBP, alterando-as. Não há transpeptidação
e a célula morre porque para a célula crescer tem que haver biossíntese e corte (por
parte das lisinas). O corte, neste caso, continua a funcionar, mas a biossíntese não e
portanto o citoplasma sai pelos “buracos” formados pela diferença de pressão osmótica,
e a célula morre.
Já a vancomicina despromove a descarboxilação do terminal D-alanina, não
havendo também transpeptidação.
Síntese do DNA

Outra síntese que estudamos nos procariotas é a síntese do DNA. Esta síntese é
mais normalmente chamada de Replicação do DNA, e é importante para a duplicação
do material genético. É semiconservativa, ou seja, as moléculas filhas contêm uma
cadeia igual à molécula mãe e uma cadeia nova. O DNA na E. coli é circular e a
replicação começa num único local, a origem (ver figura 8.3). Daí se dizer que o
genoma bacteriano é um replicão. Quando se dá a conjugação da E. coli, observa-se um
diferente tipo de mecanismo chamado “rolling-circle replication”, que é também
observado quando há replicação de plasmídeos e reprodução de alguns vírus. Durante
este processo, a extremidade 3’-OH livre cresce por obra das enzimas da replicação. À
medida que esta extremidade cresce, enquanto o growing point anda à volta do molde
circular, a extremidade 5’ é retirada (do inglês, “displaced”) e forma uma cauda que está
constantemente a crescer. Este mecanismo é particularmente útil para os vírus porque
permite uma produção rápida e contínua de muitas cópias do genoma a partir de um
único evento de iniciação.
As enzimas que catalisam a síntese do DNA são as chamadas DNA polimerases.
A E. coli possui três: a I, que está envolvida em mecanismos de reparação de DNA, a II
e a III, que está mais envolvida na replicação do DNA, mas para funcionar tem existir
um primer, uma molécula iniciadora, que possui sequências curtas de ácidos nucleicos,
com a extremidade 3’-OH livre, que se vai ligar à cadeia complementar. Todas as DNA
polimerases conhecidas catalisam a síntese de DNA na direcção 5’ para 3’.
Para que as DNA polimerases catalizem uma cadeia complementar de DNA, são
necessárias três coisas: (1) um molde, que se leia na direcção 3’ para 5’, (2) um primer e
(3) dNTPs.
Na E. coli, a replicação começa quando um conjunto de proteínas DnaA se liga
a sequências de nucleótidos específicas no sítio de origem da replicação (o locus oriC).
Estas proteínas hidrolisam ATP de modo a que as ligações de hidrogénio que ligam as
duas cadeias de DNA se partam e o molde seja de apenas uma cadeia. Mas não só estas
proteínas conseguem manter esta única cadeia funcional. Outras proteínas, como as
helicases, as single-stranded DNA binding proteins (SSBs) e as topoisomerases ajudam-
nas.
As helicases são responsáveis por desenrolar as cadeias de DNA. As SSBs
mantêm as cadeias longe umas das outras assim que elas são separadas e as
topoisomerases aliviam a tensão gerada pelo rápido desenrolamento da dupla hélice.
Isto é importante porque por causa deste rápido desenrolamento, pode haver formação
de superenrolamentos positivos na hélice e estes podem impedir a replicação se não
forem removidos. A enzima DNA girase (uma topoisomerase) desfaz os
superenrolamentos positivos que ocorrem à frente da bifurcação de elongação durante a
síntese do DNA.
Assim que o molde estiver preparado, o primer que é necessário para a DNA
polimerase III pode ser sintetizado. Este é sintetizado por uma primase, com a ajuda de
outras proteínas – formando um complexo chamado primossoma.

Como a DNA polimerase deve sintetizar DNA na direcção 5’ para 3’, apenas
uma das cadeias, chamada cadeia líder ou primária, pode ser sintetizada
continuamente na sua terminação 3’, à medida que o DNA desenrola. A outra cadeia,
chamada de cadeia secundária, não se pode formar na mesma direcção pois não há
nenhuma extremidade 3’-OH livre onde os nucleótidos possam ser ligados. Então, esta
cadeia é sintetizada descontinuamente na direcção 5’ para 3’ como uma série de
fragmentos, chamados de fragmentos Okazaki (que são pequenos fragmentos de
cadeias de DNA simples que se emparelham com a cadeia complementar, que se ligam
covalentemente na extremidade 5’ a um primer).
Ou seja; enquanto a cadeia primária precisa apenas de um primer (e apenas um
primossoma) para iniciar a síntese, a cadeia secundária precisa de vários primers e
vários primossomas, que serão, depois, eventualmente retirados. Quando isso acontece,
os fragmentos Okazaki são ligados pela enzima DNA ligase, que forma uma ligação
fosfodiéster entre a extremidade 3’-hidroxil da cadeia que está a crescer e a extremidade
5’-fosfato do fragmento de Okazaki.
Fig 8.3: Genoma bacteriano é circular. Na figura maior, síntese do DNA
resumida.

A replicação pára quando o replissoma reconhece um local de terminação no


DNA. Quando a replicação de um genoma circular está completa, as duas cadeias filhas
podem permanecer entrelaçadas – formando catenanos. Isto traz obviamente
problemas. Porém, as topoisomerases resolvem o problema, fazendo com que as
moléculas de DNA sejam temporariamente cortadas, de modo a que cada cadeia seja
separada (ver Figura 8.4).

Fig 8.4: Mecanismos de acção das topoisomerases (Catenação e Decatenação).

Quando a antibióticos que inibam a síntese do DNA temos como exemplos as


quinolonas. Isto porque afectam a actividade das topoisomerases II (girases) gyrA,
gyrB e das topoisomerases IV (parC; parE) e logo, há uma paragem na síntese do DNA.
Síntese do RNA

A síntese do RNA a partir do DNA é chamada de transcrição. Esta é feita através


da RNA polimerase e gera três tipos de RNA: mRNA (RNA mensageiro), rRNA (RNA
ribossomal), tRNA (RNA de transferência) e os pequenos RNAs reguladores. A reacção
é bastante similar à que é catalizada pela DNA polimerase. ATP, GTP, CTP e UTP são
usados para produzir um RNA complementar a partir do molde de DNA. Porém, estes
nucleótidos contêm ribose e não desoxirribose (ver Figura 8.5).

Fig 8.5: Fenómeno de transcrição.

Esta síntese é feita, tal como a do DNA, na direcção 5’ -> 3’, com os nucleótidos
a serem adicionados à terminação 3’ da cadeia que cresce. É produzido pirofosfato que é
depois hidrolisado a ortofosfato. Esta reacção faz com que a síntese do DNA e RNA
seja irreversível.
A transcrição envolve três processos distintos: iniciação, elongação e
terminação. Apenas uma pequeno segmento de DNA é transcrito (enquanto que na
replicação do DNA é preciso que todo o molde seja copiado) e a iniciação começa
quando a RNA polimerase se liga à região promotora do gene. É nesta altura que o
factor sigma entra. Ele vai reconhecer a região promotora do gene e vai fazer com que
se dê o início da transcrição. É de notar que o factor sigma serve apenas para reconhecer
a região promotora e fazer com que a RNA polimerase se ligue lá, de modo a começar a
transcrição. Ele sai dessa zona mesmo antes da transcrição em si começar.
Essas regiões promotoras onde se vai iniciar a transcrição têm, nas bactérias,
duas características: uma sequência de seis bases (muitas vezes TTGACA) que se situa
35 pares de bases antes do local de iniciação da transcrição, e uma sequência TATAAT
que se situa 10 pares de bases abaixo do mesmo local. Estas regiões são chamadas -35 e
-10 sites. É entre eles (e até ao local +1, onde se inicia a transcrição) que se situa a
região promotora, onde a RNA polimerase se liga. Assim que estiver ligada, a RNA
polimerase começa a desenrolar o DNA sem a ajuda de helicases. O sítio -10 é rico em
adeninas e timinas, o que faz com que as ligações de hidrogénio que mantém a dupla
hélice do DNA enrolada sejam mais fáceis de serem “partidas”. Quando o DNA é
desenrolado nesta zona, forma-se o “open complex”, que se move com a RNA
polimerase à medida que esta procede à transcrição de mRNA a partir do DNA, durante
a elongação. É também durante a elongação que mRNA’s com uma única cadeia são
libertados e as duas cadeias de DNA ficam de novo com a sua estrutura de dupla hélice.
A terminação da transcrição dá-se quando a RNA polimerase se dissocia do
molde de DNA. Isso acontece quando a enzima encontra no gene sequências de
nucleótidos que a “mandam” parar de sintetizar mRNA – sequências terminadoras.
Forma-se então mRNA com dois genes (formam operão – conjunto de genes
transcritos pelo mesmo DNA e dependentes do mesmo promotor).

Fig 8.6: Outra imagem relativa à transcrição: aqui pode ver-se as três fases desta
síntese.

ATENÇÃO: A RNA polimerase progride na direcção 3’ para 5’ aquando da


transcrição. Porém, o mRNA é sintetizado na direcção 5’ para 3’, de modo a ser
complementar e anti-paralelo ao molde de DNA.
Síntese Proteica nos Procariontes

A última síntese de que falamos é a Síntese Proteica nos procariontes. Esta dá-se
por interacção entre os ribossomas e o mRNA. O ribossoma procariótico é constituído
por duas subunidades, 30S e 50S, sendo que quando juntas, perfazem um valor de
sedimentação de 70S (ver Fig 8.7). Estas subunidades são construídas a partir de uma
ou duas moléculas de rRNA e muitos polipéptidos. A região do ribossoma directamente
responsável pela tradução é chamada de domínio da tradução. Ambas as subunidades
contribuem para este domínio.

Fig 8.7: Ribossoma procariótico.

O RNA ribossomal tem três papéis. Obviamente, contribui para a estrutura do


ribossoma. A parte rRNA 16S da subunidade 30S é necessária para a iniciação da
síntese proteica nas bactérias, pois é a extremidade 3’ desta parte do rRNA que se
complexa num local do mRNA, chamada sequência Shine-Dalgarno, que se situa no
ribosome-binding site (RBS). Isto ajuda o mRNA a posicionar-se no ribossoma. O
rRNA 16S também contém uma proteína necessária ao início da tradução, entre outros.
Finalmente, parece que o rRNA 23S tem um papel catalítico na síntese proteica.
Iniciação da Síntese Proteica

E. coli e a maioria das bactérias começam a síntese proteica usando um


aminoacil-tRNA modificado, o N-formilmetionil-tRNA, que só pode ser usado para
iniciação. Quando este se liga à subunidade 30S do ribossoma, dá-se a iniciação. Como
já foi dito, esta subunidade tem uma molécula de rRNA 16S com sequências de
nucleótidos que são complementares da sequência Shine-Dalgarno na sequência líder do
mRNA. Esta sequência líder não é traduzida, apenas transcrita. Isto porque o papel da
sequência líder é alinhar o mRNA com as bases complementares do rRNA 16S, de
modo a que o codão para o iniciador fMet-tRNA seja traduzido primeiro. Os mRNA’s
têm um codão iniciador (normalmente AUG) que se liga especificamente ao anticodão
fMet-tRNA. Finalmente, a subunidade 50S liga-se à estrutura formada pela subunidade
30S + mRNA, formando um complexo activo ribossoma-mRNA.
Nas bactérias, são necessários três factores iniciadores: IF-3, que previne que a
subunidade 30S se ligue somente à subunidade 50S e promove a ligação correcta entre o
mRNA e a subunidade 30S; IF-2, que liga GTP ao fMet-tRNA e promove a ligação do
fMet-tRNA iniciador ao sítio P da subunidade 30S (GTP é hidrolisado quando se dá a
associação da subunidade 50S à subunidade 30S); IF-1, que parece ser requerido para a
libertação de IF-2 e GDP, e para ajudar a associação da subunidade 50S à subunidade
30S.

Elongação da Cadeia Polipeptídica

Toda a adição de aminoácidos a uma cadeia polipeptídica a crescer é resultado


de um ciclo de elongação composto por três fases: Ligação do aminoacil-tRNA,
reacção de transpeptidação e translocação.
O ribossoma tem três locais onde os tRNAs se podem ligar: “site” P (local
doador), “site” A (aminoacil ou aceitador site) e um “site” E (local de saída, do inglês
“exit site”).
A primeira fase do ciclo de elongação é a fase de ligação do aminoacil-tRNA.
Este é inserido no “site” A de modo a que o seu anticodão esteja alinhado com o codão
do mRNA. Esta ligação inicia a segunda fase do ciclo de elongação, a reacção de
transpeptidação. Esta é catalisada pela peptidil transferase, que é uma ribozima existente
no interior do rRNA 23S. O grupo alfa-amino do “site” A ataca nucleofilicamente o
grupo alfa-carboxilo do C-terminal do aminoácido do “site” P do tRNA. A cadeia
peptídica ligada ao tRNA é transferida para o “site” A, à medida que se forma uma
ligação peptídica entre a cadeia e o aminoácido. A última fase é a translocação. Três
coisas acontecem simultaneamente: (1) o peptidil-tRNA move-se do “site” A para o
“site” P; (2) o ribossoma move um codão com o mRNA de modo a que um novo codão
seja posicionado no “site” A; e (3) o tRNA livre deixa o “site” P e é movido para o
“site” E, de onde sai do ribossoma.

Terminação da Síntese Proteica

A síntese proteica pára assim que o ribossoma chega a um destes três codões –
UAA, UAG e UGA. Estes são encontrados no mRNA.

Antibióticos Inibidores da Síntese Proteica

Muitos antibióticos são inibidores da síntese proteica por se ligarem ao


ribossoma procariótico. São exemplos desses antibióticos:

- Aminoglicosidas – Liga-se à subunidade 30S do ribossoma, não deixando que


a 30S se reúna com a 50S. Interfere na síntese proteica porque inibe directamente o
processo de síntese e também por causar uma má leitura do mRNA. São mais efectivos
contra bactérias Gram Negativo. Pode ser tóxico, causar náusea, perda de equilíbrio e
respostas alérgicas. Ex: Streptomicina, canamicina, gentamicina.

- Tetraciclinas – Liga-se também à subunidade 30 S do ribossoma. Impede que


as moléculas aminoacil-tRNA se liguem ao A site do ribossoma. São activos contra
bactérias tanto Gram negativo como Gram positivo. Doses altas podem resultar em
diarreia, náusea, entre outros.

- Macrolidas – Liga-se ao rRNA 23S da subunidade 50 S do ribossoma,


inibindo assim a elongação da síntese proteica. Funciona muito bem contra bactérias
Gram positivo e algumas Gram negativo. Costumam ser usadas em pacientes que são
alérgicos a penicilina.

- Lincosamidas
- Oxazolidinonas
- Everninomicinas
- Streptogaminas

Bibliografia usada para a aula nº 8:


Slides das Teóricas e Apontamentos
Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M.
Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill,
Cap. 11 e 34