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AULA Nº 15 –

Tecnologia do DNA recombinante

Fenómeno de restrição-modificação
As bactérias podem transferir fragmentos do seu DNA para outras bactérias
(fluxo genético horizontal); contudo este fenómeno tem restrições/barreiras para que
esta transferência se processe.
Barreiras à transferência horizontal de genes:
- Transformação: estado de competência, qualidade do DNA (o DNA que entra pode
não encontrar qualquer homologia com o da célula receptora).
- Transdução: receptores parietais (os fagos não infectam todas as células, o contacto e
consequente transferência de DNA depende da existência de receptores à superfície das
bactérias).
- Conjugação: receptores dos pili, exclusão de superfície (bactérias que são F+
apresentam este fenómeno, ou seja, modificam os receptores parietais para que a
conjugação com outras bactérias F+ não seja possível).
- Fenómeno de restrição-modificação: é a barreira mais importante, possibilitando à
bactéria a capacidade de reconhecer, ou não, como seu o DNA que é incorporado.

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Fig. 1 - Como exemplo tem-se o caso da infecção da E. coli K pelo fago λ. O fago
penetra na célula e incorpora o seu DNA no da bactéria, conduzindo à lise da mesma e a
produção de novos fagos (λK).

Colocando agora estes novos fagos em contacto com outras culturas de E. Coli
diferentes (B e C) é possível avaliar a sua eficiência de plaqueamento, ou seja, se existe
ou não restrição do novo hospedeiro (surgem placas de lise, pois ao formarem-se novos
fagos, as bactérias que os hospedaram são destruídas).
Eficiência de plaqueamento = nº de placas na estirpe em estudo/nº placas na estirpe
referência
Quanto maior este valor, menor a restrição.

Fig. 2 – Nesta figura avalia-se a eficência do plaqueamento (EP). É possível ver então
que a E.coli B hidrolisa o DNA do fago λK (veremos mais adiante que possui
endonucleases de restrição responsáveis por este fenómeno), enquanto a E. coli C não
impede a multiplicação deste fago.

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Fig. 3 – Esta figura serve apenas para demonstrar que a restrição neste caso é um
fenómeno recíproco (λB é restringido em E. coli K e o λK é restringido em E. coli B).

Fig. 4 – Este é mais um esquema do fenómeno mostrado na figura 3, em que 99,99% do


DNA dos fagos que entram nas bactérias são hidrolisados, mas 0,01% conseguem
incorporar-se, por um mecanismo de protecção que envolve metilação, que irá ser
explicado adiante.

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DNA recombinante
Este tipo de DNA combina material genético de duas ou mais fontes diferentes,
pela junção dos seus fragmentos, dando origem a uma nova sequência.
Uma das principais descobertas que levaram ao desenvolvimento da tecnologia
do DNA recombinante foi a existência de enzimas bacterianas que fazem cortes na
dupla cadeia do DNA. Estas enzimas, conhecidas com enzimas de restrição ou
endonucleases de restrição, reconhecem e digerem sequências específicas de 4 a 8
pares de bases. Normalmente, estas enzimas protegem a célula hospedeira, destruindo o
DNA do fago após a sua entrada na mesma. As células podem também proteger o seu
próprio DNA através da acção de metilases que, metilando nucleótidos específicos,
impedem a acção das enzimas de restrição que iriam actuar sobre esses nucleótidos.
As zonas de DNA reconhecidas pelas enzimas de restrição denominam-se locais
de restrição. Cada endonuclease tem o seu próprio sítio de reconhecimento.
As enzimas de restrição e as metilases funcionam pelo mecanismo de
competição enzimático.
Centenas de enzimas de restrição já foram purificadas e estão disponíveis
comercialmente. Os tipos I e III de endonucleases identificam o seu local de
reconhecimento e clivam o DNA alguns pares de bases antes ou depois deste. As
endonucleases tipo II, mais comuns, cortam o DNA directamente no local de
reconhecimento. Estas enzimas podem ser utilizadas para preparar fragmentos de DNA
contendo genes específicos ou porções destes. Por exemplo, a enzima de restrição
EcoRI, isolada da E. coli cliva o DNA entre G e A na sequência 5’ – GAATTC – 3’.
Como o DNA é antiparalelo esta sequência é invertida e oposta em ambas as cadeias.

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Fig. 5 – Do lado esquerdo mostra a acção da endonuclease EcoRI, ficando
separados os 2 fragmentos. Do lado direito encontra-se um fragmento que sofreu a
acção de uma metilase, que ao adicionar os grupos metilo protege o fragmento da acção
de uma endonuclease.

Tabela 15.1 - Exemplos de enzimas de restrição (classe II):

Muito cedo no desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, foi


evidente que a clonagem de DNA eucariótico em hospedeiros procariotas seria
preferível, no entanto, problemático. Isto porque o pré-mRNA eucariótico tem de ser

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processado e os procariotas não têm a maquinaria molecular necessária para tal função.
Em 1970, Howard Termin e David Baltimore resolveram este dilema, ao isolarem a
partir de retrovirus a enzima transcriptase reversa. Estes vírus têm um RNA genómico
que é copiado em DNA antes da replicação. Ao utilizar o mRNA processado como
molde para a síntese de cDNA, o processamento do RNA não é requerido enquanto, o
DNA clonado é expressado.
O próximo avanço foi conquistado em 1972 quando investigadores conseguiram
gerar, com sucesso, moléculas de DNA recombinante. Eles conseguiram que os
fragmentos emparelhassem as suas bases (annealing) e que estas fossem unidas
covalentemente através da DNA ligase. Assim, tornou-se possível a técnica de
introdução de DNA estrangeiro num vector de clonagem plasmídico.
Uma vez que os genes foram recombinados em vectores de clonagem, os
biólogos foram capazes de clonar genes específicos de vários organismos. Mas como se
pode distinguir os fragmentos de DNA que processam os genes de interesse dos
numerosos fragmentos cromossómicos produzidos pelas enzimas de restrição? Este
problema é resolvido por Southern blot. Esta técnica é capaz de detectar fragmentos de
DNA específicos de uma mistura de moléculas de DNA.

Vectores de clonagem e a criação de DNA


recombinante
A tecnologia de DNA recombinante depende do aumento de muitas cópias da
sequência de nucleótidos escolhida. Para atingir este objectivo, genes ou outros
elementos genéticos são inseridos em vectores de DNA que se replicam no organismo
hospedeiro. Há 4 tipos principais de vectores: plasmídeos, bacteriófagos e outros vírus,
comídeos e cromossomas artificiais. Cada tipo tem as suas vantagens, pelo que a
selecção de um bom vector de clonagem é crítica para o sucesso de qualquer
experiência de clonagem. Todos os vectores sintetizados experimentalmente têm as
seguintes características: uma origem de replicação, locais únicos de restrição e um
marcador genético.

Plasmídeos (mais frequentemente utilizados)


Os plasmídeos são vectores de clonagem excelentes, uma vez que se replicam
autonomamente e são fáceis de purificar. Muitos plasmídeos diferentes são utilizados

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em biotecnologia, sendo que todos são originados de plasmídeos naturais que foram
modificados geneticamente.

- Origem de Replicação
A origem de replicação permite ao plasmídeo replicar-se no hospedeiro
microbiano independentemente do cromossoma. O pUC19, plasmídeo da E. coli, dá
origem a um grande número de cópias porque se replica 100 vezes numa geração. Um
número elevado de cópias é, normalmente, importante porque facilita a purificação dos
plasmídeos e consegue aumentar dramaticamente a quantidade de produtos clonados
por célula. Alguns plasmídeos têm duas origens de replicação, cada um reconhece um
hospedeiro diferente. Por exemplo, o YEP24 é um vector que se consegue replicar nas
leveduras e na E. coli.

- Marcador Genético
Seguidamente à incorporação dos vectores pelos hospedeiros temos de ser
capazes de discriminar entre aqueles que obtiveram o vector com sucesso e os que não.
Isto é conseguido pela presença do gene que codifica uma proteína que é necessária para
a sobrevivência da célula. Este gene denomina-se marcador selectivo. É o caso do
pUC19, este codifica o factor de resistência para a ampicilina.

- Local de restrição (sítio de multiclonagem ou “polilinker”)


A região contendo os sítios de clivagem das enzimas de restrição é encontrada
apenas uma vez no plasmídeo e é essencial para a inserção de DNA estrangeiro. A
clivagem de um único sítio de restrição gera um plasmídeo linear. Alternativamente,
dois locais diferentes e únicos nos sítios de multiclonagem podem ser clivados e a
sequência entre ambos substituída por DNA clonado. Em ambos os casos, o plasmídeo e
o DNA a serem inseridos são incubados na presença de DNA ligase para que as
terminações compatíveis formem ligações covalentes de hidrogénio e fosfodiéster entre
o fragmento de DNA clonado e o vector. Este passo necessita de energia, pelo que ATP
é adicionado a esta reacção de ligação in vitro.

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Fig. 6 – Plasmídeo pUC19

No pUC19 a zona “polilinker” está localizada na terminação 5’ do gene lacZ que


codifica para a β-galactosidase. Esta enzima corta o dissacarídeo lactose em glucose e
galactose. Quando o DNA clonado é inserido na zona “polilinker" o gene lacZ deixa de
estar intacto (é alterado), pelo que a enzima não é produzida. Isto pode ser detectado
pelas cores das colónias de bactérias que contenham este plasmídeo (Fig. 7): as colónias
ficam azuis quando a β-Gal degrada o seu substrato alternativo, X-Gal que é incluído no
meio. Isto é importante porque a ligação de DNA ao vector nunca é 100% eficiente,
pelo que quando uma mistura de ligações é introduzida nos hospedeiros, temos de ser
capazes de distinguir as células que transportam o plasmídeo no qual o DNA foi
inserido com sucesso. No caso do pUC19, todas as células de E.coli que incorporam o
plasmídeo são seleccionadas pela resistência à ampicilina. Entre estas colónias, as que
contêm o plasmídeo sem o DNA pretendido serão azuis (presença do gene LacZ),
enquanto que aquelas que contêm o pUC19 com o DNA clonado pretendido serão
brancas (gene da LacZ alterado). Este processo é o mais utilizado como forma de
reconhecer as células que transportam a sequência de DNA clonado a ser estudada.

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Fig. 7 – As bactérias que têm a enzima β-galactosidase, dão origem a colónias
azuis, as bactérias que não contêm a enzima dão origem a colónias brancas, estas
últimas, são as que têm no seu plasmídeo a sequência de DNA pretendido.

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Fig. 8 – No canto superior esquerdo da imagem encontra-se um plasmídeo que
apresenta resistência à tetraciclina e à ampicilina que é clivado na zona Tc, na qual é
introduzido um fragmento de DNA que fica integrado no plasmídeo pela acção de uma
DNA ligase, tornando-se este recombinante. O plasmídeo é introduzido na bactéria
através de choques. De seguida é cultivada num meio com ampicilina e noutro com
tetraciclina. Não sobrevive no 2º meio pois a sequência do plasmídeo que oferecia
resistência a este composto foi alterada pela introdução do novo fragmento de DNA.

Bibliotecas Genéticas
Há várias maneiras pelas quais o DNA pode ser clonado e obtido. Pode ser
sintetizado por PCR ou pode ser localizado no cromossoma através de Southern
Blotting. No entanto, a amplificação dos genes por PCR requer o conhecimento de
antemão da sua sequência nucleotídica e uma sonda adequada deve ser obtida para o
Southern Blotting. Em ambos os casos, uma vez que o fragmento de DNA é purificado
este é clonado utilizando um procedimento semelhante ao descrito para os plasmídeos
recombinantes.
No entanto, se os investigadores quisessem clonar um gene mas não tivessem
qualquer ideia de qual seria a sequência de DNA? Uma biblioteca de genómica tinha de
ser construída e monitorizada.
O objectivo da construção de uma biblioteca genómica é ter o genoma clonado
de um microorganismo em pequenos fragmentos separados em vectores. Idealmente o
genoma inteiro é representado, ou seja, a soma dos diferentes fragmentos é igual ao
genoma total. Assim, um grupo específico de genes pode ser analisado e isolado.
A construção de uma biblioteca genómica começa com a clivagem do genoma
em pequenos fragmentos pelas endonucleases de restrição. Estes fragmentos genómicos
ou são clonados em vectores e introduzidos numa bactéria ou são inseridos em
partículas de fagos que são utilizadas para infectar o hospedeiro. Em ambos os casos,
milhares de clones diferentes, cada um com um pedaço diferente de DNA genómico
introduzido, são criados. Para seleccionar o clone desejado da biblioteca é necessário
saber algo acerca da função do gene alvo ou do elemento genético. Se a biblioteca for
inserida num microrganismo que expressa os genes estranhos, é possível analisar cada
clone por uma proteína ou fenótipo específico. Por exemplo, se formos estudar uma
nova bactéria do solo e quisermos encontrar o gene que codifica a enzima necessária

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para a síntese do aminoácido alanina, a biblioteca pode ser expressada na E. coli ou
Bacillus subtilis que são auxotróficos para a alanina (necessitam desta no seu meio para
se desenvolverem). Seguidamente à introdução do vector da biblioteca nas células
hospedeiras, aqueles que agora crescerem sem alanina serão bons candidatos para o
fragmento da biblioteca que contém o gene biossintético da alanina. O sucesso deste
procedimento depende do pressuposto que a função do produto do gene clonado é
similar em ambos os organismos. Se este não for o caso, o hospedeiro tem de ser da
mesma espécie daquele a partir do qual a biblioteca foi construída.
Neste exemplo, a bactéria do solo mutante, que não tem o gene em questão, é
utilizada como hospedeira da biblioteca genómica. A completação genética da
deficiência de uma célula hospedeira é por vezes denominada de salvação fenotípica.

Fig 9 – Esta clonagem molecular baseia-se na separação de clones em que cada um


exprime um fragmento do DNA inicial, sendo este introduzido num vector, resultando
assim em várias copias diferentes após o cultivo do mesmo.

Para se proceder à detecção de um clone recombinante, utiliza-se uma sonda que


não é mais que um oligonucleótido com uma sequência bem definida, que será
“complementar” da sequência alvo de DNA. Para se utilizar esta técnica é necessário

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conhecer muito bem ambas as sequências. Se se juntar a sonda marcada a uma colónia e
esta apresentar o DNA com a sequência alvo, a sonda ficará retida.

Fig. 10 – Demonstra a ligação entre a sonda marcada e a sequência alvo. A colónia em


estudo é transferida para uma membrana de nitrocelulose e é posta em contacto com a
sonda. Após a lavagem, faz-se uma autoradiografia onde se evidenciam os clones que
hibridaram com a sonda.

PCR
É uma técnica que
permite a rápida síntese de
muitas cópias de fragmentos
específicos de DNA, a partir
de uma mistura complexa de
DNA. Os investigadores
obtêm grandes quantidades
de fragmentos de DNA para
fins experimentais e de
diagnóstico.

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O primeiro passo é sintetizar fragmentos de DNA com sequências idênticas às
sequencias alvo. Tal é possível utilizando um sintetizador de DNA. Estes
oligonucleótidos sintéticos contêm, normalmente, 20 nucleótidos e servem como
primers para a síntese de DNA. Os primers são um dos componentes da mistura de
reacção, que contém também o DNA alvo (normalmente, cópias inteiras de genoma),
uma DNA polimerase (termicamente estável), e cada um dos quatro
desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTPs). A PCR requer uma série de reacções
repetidas – ciclos. Cada ciclo contém 3 passos que são executados com precisão numa
máquina denominada termociclo (Fig. 11).

Fig. 11 – Fases do PCR.

No primeiro passo, o DNA alvo contendo a sequência a ser amplificada é


aquecido e desnaturado de forma a obter-se uma única cadeia de DNA. Seguidamente, a
temperatura é diminuída para que os primers formem ligações de hidrogénio (annealing)
com o DNA em ambos os lados da sequência alvo. Como os primers são muito
pequenos e estão presentes em excesso, as cadeias do DNA alvo emparelham
preferencialmente com estes do que novamente umas com as outras. Finalmente, a DNA
polimerase extende os primers e sintetiza cópias da sequência do DNA alvo usando os
dNTPs. Apenas as polimerases que são capazes de funcionar a temperaturas elevadas

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são empregadas na técnica de PCR. Duas das enzimas mais comuns são a Taq
polimerase originária da bactéria termofílica Thermus aquacticus e a vent polimerase
originária da Thermococcus litoralis. No fim de um ciclo, as sequências alvo em ambas
as cadeias foram copiadas. Quando o ciclo de 3 passos é repetido as duas cadeias do
primeiro ciclo são copiadas para produzir 4 fragmentos. Estes são amplificados no
terceiro ciclo para produzir 8 produtos. Assim, cada ciclo aumenta o número de
moléculas de DNA alvo, exponencialmente. Dependendo da concentração de moldes de
DNA e de outros parâmetros como a composição em G + C do DNA a ser amplificada,
é teoricamente possível obter um milhão de cópias de DNA alvo após 20 ciclos e um
bilião após 30 ciclos.

Fig. 12 – Amplificação exponencial de DNA.

A PCR é normalmente utilizada para obter grandes quantidades de uma


sequência especifica, daí que os produtos da reacção sejam retirados e purificados ao
fim de um determinado número de ciclos. Esta técnica não é quantitativa, ou seja, a
quantidade final de produtos nem sempre reflecte a quantidade de DNA molde presente,
antes da amplificação.
A técnica de PCR é uma ferramenta essencial para muitas áreas da biologia
molecular, medicina e biotecnologia. A PCR é também usada para gerar DNA para
sequenciação nucleótidica. Como a PCR amplifica DNA mesmo em quantidades iniciais
muito pequenas, é utilizada no diagnóstico de doenças como a SIDA, tuberculose,
hepatite, vírus do papiloma humano e outros agentes infecciosos e doenças. Os testes
são rápidos, sensíveis e específicos. A PCR é particularmente valiosa para a detecção de

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doenças genéticas como a fenilcetonúria e distrofia muscular. A técnica também é
empregue nas ciências forenses para a detecção de DNA “fingerprint”.

Fig. 13 – Exemplo da utilização de um plasmídeo como vector. Este é aberto com


BamHI e EcoRI e com estes dois também se cliva o gene da somatostatina. Dá-se assim
a fusão dos dois fragmentos. Mas para que o vector se possa expressar in vivo é
necessário adicionar na zona clivada pela EcoRI o lac control com a gene da β-
galactosidase. Assim dá-se a produção de somatostatina ligada à β-galactosidase, e estas
podem ser separadas por clivagem química com brometo de cianogénio.

Aplicação da tecnologia do DNA recombinante

São enormes e promissoras as aplicações desta tecnologia:

1. Na identificação e tratamento de doenças condicionadas geneticamente;


2. No diagnóstico muito sensível de doenças infecciosas;
3. No diagnóstico pré-natal;
4. Na manipulação terapêutica de genes;
5. Na criação de organismos híbridos e transgénicos na medicina, agricultura e
pecuária;

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6. Na indústria farmacêutica;
7. Em estudos evolutivos e de descendência;
8. Na medicina legal, etc

Aplicações na industria farmacêutica

Tabela 15.2 - Exemplos de hormonas que podem ser produzidas pela tecnologia do
DNA recombinante e as suas aplicações.

No fim dos anos 70 as técnicas para clonar DNA foram utilizadas para produzir
insulina humana recombinante, e em 1982 teve inicio a produção comercial de insulina
por E.coli geneticamente modificada. Hoje em dia, apenas a insulina é produzida com
fins comercias. O resto dos exemplos apresentados no quadro, são apenas possibilidades
que estão a ser investigadas, de modo, a um dia estarem disponíveis a toda a população.

Aplicações Agrícolas

Os genes clonados
podem ser inseridos em
plantas tal como em células
animais. Uma forma bastante
popular de inserir genes nas
plantas, é com o plasmideo
recombinante Ti (plasmideo
indutor de tumores) isolado, a
partir da bactéria
Fig 15 – Mostra a introdução de um gene de interesse no
plasmídeo Ti e a inserção deste no genoma da planta
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Agrobacterium tumefaciens. Também é possível doar genes formando protoplastos
(células vegetais desprovidas de parede celular) e tornando-os permeáveis ao DNA e
inserindo de seguida o DNA recombinante desejado. Este método é utilizado para a
produção de plantas transgénicas.
A engenharia genética tornou as plantas resistentes aos stresses ambientais. Por
exemplo, os genes utilizados para a desintoxicação de herbicidas glicofosfatados foram
isolados a partir da Salmonella, para serem introduzidos na planta do tabaco usando o
plasmideo Ti ficando, assim resistentes ao herbicida. São ainda encontradas variedades
de algodão resistentes aos herbicidas sendo possível desenvolver culturas transgénicas.
Isto tem uma importância considerável porque muitas culturas sofrem de stress quando
tratadas com herbicidas. As plantas resistentes não são afectadas pelos químicos
utilizados para controlar as plantações.
Outros exemplos de culturas geneticamente modificadas e comercializadas são
as batatas e tomate. O “Golden Rice” é uma cultura geneticamente manipulada que pode
causar um importante impacto no mundo desenvolvido. Comparado com o arroz não
modificado está espécie contêm duas vezes mais ferro, porque foi geneticamente
modificada de forma a expressar os seus genes numa maior magnitude. Também serve
como uma boa fonte de beta-carotenos devido a introdução de genes bacterianos.
Uma variedade de novas aplicações agrícolas está a ser explorada. Um grande
esforço tem sido aplicado para defender as plantas sem recorrer ao uso de pesticidas
químicos. Uma estirpe de Pseudomonas fluorescens contendo o gene para a toxina do
Bacillus thuringiensis está ser desenvolvida, de forma, a proteger as plantas dos insectos
responsáveis pelas pestes, uma vez que esta toxina os destrói.

Bibliografia usada para a aula 15:


 Slides das Teóricas
 Apontamentos da aula
 Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda
M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 5ª edição,
McGrawHill, Cap. 15

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