DIAGNSTICO BIOQUMICO: PRINCPIOS TCNICAS - Espectrofotometria a capacidade de uma substncia ou um produto derivado de reao bioqumica em absorver ou emitir luz,

, em um determinado comprimento de onda, sob condies fsico-qumicas estabelecidas. A maioria das analises bioqumicas realizadas no laboratrio clinico baseia-se no principio da quantidade de luz absorvida ou refletida, de acordo com as leis de Beer e Lambert: 1 Lei de Lambert: quando a concentrao de um analito constante, a absoro depende do comprimento do caminho ptico. 2 Lei de Beer: quando o caminho ptico constante e igual a 1, a concentrao diretamente proporcional quantidade de luz absorvida ou inversamente proporcional ao logaritmo da luz transmitida, em relao luz incidente. A determinao da concentrao do analito feita a partir da comparao de uma soluo padro de concentrao conhecida da mesma substncia. Quando a concentrao tem relao linear com a absoro, calcula-se o fator de calibrao, que multiplicado pela absorvncia da substncia a ser quantificada, encontrando-se assim a concentrao. Quando uma substncia no segue a lei de Beer no h linearidade entre absoro e concentrao, usa-se uma curva de calibrao por meio de grfico da absorvncia de padres de concentraes conhecidas. Os principais componentes do espectrofotmetro so a fonte de luz, o monocromador, o compartimento para amostra, ou cubetas, o detector e o dispositivo de leitura. Com o avano tecnolgico, os espectrofotmetros microprocessados permitem funes automticas, armazenamento de dados, clculos de curva-padro, mais sensibilidade e confiabilidade nos resultados, menor volume de amostra e reagentes, controle de temperatura e facilidade operacional. - Eletroforese a separao de molculas baseada na sua carga eltrica sob a ao de um campo eltrico externo. Quando uma voltagem aplicada a uma soluo, gera-se uma corrente eltrica pelo fluxo dos ons: ctions migram em direo ao plo negativo (catodo) e nions em direo ao plo positivo (anodo). Muitas molculas orgnicas so anfoteras, ou seja, podem estar carregadas positiva ou negativamente, dependendo do pH da soluo. A mobilidade, ou taxa de migrao, da molcula dependente de vrios fatores dentre eles esto a carga eltrica, tamanho, propriedades do meio de suporte, fora do campo eltrico, endosmose, fora inica do tampo e temperatura. Ao ser aplicada uma diferena de potencial a uma mistura de macromolculas com tamanho e/ou cargas diferentes, as molculas migraro com velocidade e/ou direes diferentes, dependendo de seus tamanhos e cargas. Deve haver equilbrio entre todos os fatores citados, de modo a permitir modelos de migrao sem distoro, com exatido, sensibilidade e qualidade dos resultados obtidos.

O sistema de eletroforese composto de uma cuba com tampa, meio de suporte, reagentes (tampo, corante ou revelador, fixador, transparentizador), fonte eltrica de corrente contnua, densitmetro. A eletroforese encontra aplicaes tanto na pesquisa e no desenvolvimento botecnolgico (DA recombinante) quanto nos diagnsticos clnico e forense. A aplicao da eletroforese no laboratrio clnico diversificada, sendo utilizada na separao e quantificao de protenas sricas, anlise de isoenzimas (LDH, CPK, fosfatasse alcalina), lipoprotenas, hemoglobinas e na separao de cidos nuclicos. Pelo principio da eletroforese, novas metodologias foram desenvolvidas com o objetivo de melhorar a especificidade e sensibilidade do teste, diminuir o volume e amostra, tempo de anlise e automatizao do processo como a focalizao isoeltrica, eletroforese de protenas e eletroforese capilar. -Cromatografia: Definida como um sistema que separa os componentes de uma mistura (soluo) pela interao do composto com uma fase estacionria e outra mvel medida que atravessa o meio de suporte. A fase estacionria aquela composta pelo meio de suporte e qualquer solvente e a fase mvel aquela em que h fluxo de gs (cromatografia gs) ou lquido (cromatografia lquida) pelo sistema. O mtodo cromatogrfico classifica-se geralmente de acordo com o mtodo de separao (princpio cromatogrfico, o tipo da fase mvel e fase estacionria). Quanto aos mecanismos de separao de fsico-qumicos , a cromatografia classifica-se em: Cromatografia lquida por adsoro (lquida/slido), partio (lquida/lquido) ou por troca inica, ou Cromatografia gs por absoro (gs/slido) ou partio (gs/lquida). O cromatgrafo o equipamento usado para a realizao da separao cromatogrfica. Ele consiste de cinco unidades bsicas: um sistema para o suprimentos da fase mvel, injetor de amostra, uma coluna ou coluna aberta, um detector (fotmetros, fluormetros, sistemas eletroqumicos, condutividade trmica, ionizao de chama) e um processador de dados. O sistema para o suprimento da fase mvel pode variar de um simples cilindro de gs a um complexo mecanismo de mbolos conectado a quatro ou cinco reservatrios de solventes. Devido ao grande numero de combinaes entre as fases mvel e estacionria, a cromatografia um procedimento importante no laboratrio clnico, permitindo separar misturas complexas, identificando e quantificando as substncias individualmente, sendo o mtodo de referncia em toxicologia. Em geral, a cromatografia a gs usada para a separao de materiais volteis. A cromatografia lquida separa lquidos no volteis e slidos. Muitas substncias no volteis, tais como aminocidos, esterides, cidos graxos de alto peso molecular, so derivatizadas em sub-produtos volteis e dosados por cromatografia gasosa. Peptdeos, polipeptdeos, protenas e outros biopolmeros so separados somente por cromatografia lquida. A evoluo da cromatografia lquida de alta presso, inicialmente para separar e medir a concentrao de drogas e seus metablitos nos lquidos corporais, alcanou os limites de picogramos para uma grande variedade de compostos de interesse clinico.

A cromatografia liquida em coluna e a cromatografia a gs tem algumas desvantagens: tempo de preparo da amostra, tempo de anlise, necessidade de pessoal altamente capacitado e custo elevado do equipamento e sua manuteno. - Eletroqumica Engloba a medida da voltagem ou corrente eltrica gerada pela atividade de ons especficos. No laboratrio clnico, so especialmente usados os procedimentos baseados na potenciometria e amperometria. Potenciometria: a diferena de voltagem ou potencial eltrico entre dois eletrodos numa clula eletroqumica conectados por uma soluo eletroltica condutora, quando nenhuma corrente externa aplicada e a clula est em equilbrio. Um eletrodo consiste em um condutor metlico nico em uma soluo eletroltica. Para medir o potencial de um eletrodo, necessria presena de uma fonte com voltagem constante, chamada de eletrodo de referncia. O eletrodo usado para a medio chamado de eletrodo indicador. A concentrao de determinados ons em uma soluo pode ser obtida medindo-se a diferena de potencial entre esses dois eletrodos, pelo potencimetro. Eletrodos de referncia: Existe dois tipos de eletrodos de referncia, o eletrodo saturado de calomel e o de prata, eles tm um potencial fixo, independente da atividade o analito. Eletrodos ons seletivos: Consiste em uma membrana seletiva para o on a ser medido, separando-se uma soluo de referncia de concentrao fixa para esse mesmo on e um elemento de referncia de uma soluo a ser analisada. muito sensvel e especifica para o on a se analisado. Eletrodos de vidro: Formulado com diferentes composies, para determinar a seletividade para H+, Na+, K+, Li+ e outros. Muito usados para medir Na+ no soro. Eletrodos de fase slida: Usado para medir diretamente a atividade de Cl. Eletrodos de troca inica: Substncia carregadora de ons seletiva envolvida por um solvente inerte, so muito usadas para medir K+, NH4+ e Ca2+. Eletrodo de pCO2: Incorpora dois eletrodos, referncia e indicador, em um mesmo sensor. A amostra fica em contato com a membrana que permevel ao gs e no soluo. - Amperometria: baseada na medida da corrente que passa atravs de uma clula eletroqumica quando aplicada uma voltagem constante aos eletrodos. Uma importante aplicao dessa tecnologia o eletrodo de pO2. O sensor consiste em um catodo de platina, um anodo de prata, uma soluo eletroltica e uma membrana gs permevel. Uma voltagem constante mantida entre o catodo e o anodo. O primeiro biossensor desenvolvido foi para medir glicose e, desde ento alguns outros esto disponveis como uria, bilirrubinas e lactato. - Automao em qumica clnica Analisadores automticos no laboratrio permitem que sejam processadas muitas amostras em curto perodo de tempo, graas maior velocidade de realizao das anlises. A automao permite tambm a eliminao de passou ou tarefas

repetitivas e montonas, que podem levar instabilidade ou erro nas anlises, melhorando a qualidade e produtividade. A automao ajuda na identificao da amostra e do paciente, medida e adio de reagentes, pipetagem da amostra, homogeneizao de amostra e reagente, incubao da mistura, calibrao do ensaio, medida e leitura da reao, liberao do resultado e armazenamento dos dados. A escolha do instrumento e equipamento a ser utilizado em cada servio dependera de inmeros aspectos tcnicos e econmicos. Muitos dos princpios analticos usados para determinao de constituintes sricos so tambm usados para analisar os mesmos constituintes na urina. A automao de dosagens urinrias mais difcil, pois muitos constituintes esto presentes em concentraes bem menos que no soro, exigindo menor limite de deteco e maior faixa de linearidade de reao, que permitam a medida de concentraes maiores do analito sem diluies. - Testes laboratoriais remotos Existem agora muitos instrumentos compactos, eles podem ter grande variedade de testes disponveis e usar vrios tipos de amostra, preferencialmente sangue total, eliminando-se a etapa de preparo da amostra. A maioria usa pequenos volumes de amostra e libera resultados em at 15 min. Os reagentes usados geralmente so prontos para uso, assim como calibradores e controles.