MANUAL DE PROCEDIMENTOS BSICOS EM MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO HOSPITALAR

MDULO 3

PROCESSAMENTO DE MATERIAL CLNICO IDENTIFICAO DOS MICRORGANISMOS DE IMPORTNCIA CLNICA

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Introduo Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros Gram positivos Neisserias Enterobactrias Bactrias No Fermentadoras Bacilos Curvos ou Espiralados

7. Bacilos Gram positivos 8. Fastidiosos 9. Anaerbios 10. Interpretao de Resultados e Relatrios

Autores

Introduo Enterobactrias Fastidiosos, Espirilados, Aeromonas e Vibrio Bacilos Gram positivos Interpretao e Relatrios Dr. Carlos Emilio Levy - Centro Infantil Dr. Domingos Boldrini - Campinas SP Estafilococos e Estreptococos Dra. Angela von Nowakonski - Servio de Microbiologia Clnica do Hospital das Clinicas da UNICAMP

No fermentadores Dr Carlos Emilio Levy e Dr Igor Mimica

Anaerbios Dr. Igor Mimica e Dra.Lycia Mimica - Faculdade de Cincias Mdicas da Santa Casa de So Paulo SP

Revisores:

Dr. Lauro Santos Filho - Departamento de Cincias Farmacuticas da UFPB

Dr. Emerson Danguy Cavassin - Laboratrio de Microbiologia do Hospital das Clnicas da UE Londrina PR.

Captulo 1 INTRODUO ROTINA DE LABORATRIO 1. Introduo 2. Esquemas de Identificao: Meios de cultura 3. Microscopia: Tcnica para preparo do esfregao 4. Semeadura em Meios de Cultura 5. Incubao 6. Avaliao do crescimento e Contagem 7. Identificao 8. Esquema geral de identificao bacteriana

Captulo 2 ESTAFILOCOCOS, ESTREPTOCOCOS, ENTEROCOCOS E OUTROS COCOS GRAM POSITIVO 1. Introduo 2. Identificao preliminar 3. Identificao de estafilococos 4. Identificao de estreptococos

Captulo 3 NEISSERIAS 1. Introduo 2. Isolamento 3. Transporte e semeadura do material 4. Bacterioscopia e identificao

Captulo 4 ENTEROBACTRIAS 1. Introduo 2. Tipos de Testes Utilizados 3. Etapas da Identificao de Enterobactrias 4. Identificao da Enterobactrias de importncia Clnica 5. Identificao Sorolgica

Captulo 5 BASTONETES NO FERMENTADORES 1. Introduo e provas de identificao 2. Procedimentos para a identificao 3. Tabelas de Identificao dos Bactrias no fermentadoras 4. Tabela Geral de Consulta para identificao de Bactrias no fermentadoras 5. Referncias bibliogrficas Captulo 6 BACILOS CURVOS OU ESPIRALADOS 1. Introduo 2. Campylobacter 3. Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas 4. Referncias bibliogrficas

Captulo 7 BACILOS GRAM POSITIVO 1. Introduo 2. Orientao geral para identificao de bacilos Gram positivo 3. Corineformes 4. Listeria, Erisipelotrix e Kurthia 5. Bacilos esporulados 6. Actinomicetos 7. Referncias bibliogrficas

Captulo 8 FASTIDIOSOS 1. Caractersticas gerais 2. Bartonella 3. Bordetella 4. Brucella 5. Francisella

6. Haemophilus 7. Legionella 8. Pasteurella 9. Actinobacillus 10. Capnocytophaga 11. Eikenella 12. Kingella 13. Cardiobacterium hominis 14. Chromobacterium violaceum 15. Streptobacillus moniliformis

Captulo 9 BACTRIAS ANAERBIAS ESTRITAS 1. Introduo 2. Fatores predisponentes 3. Processamento dos materiais, identificao e teste de sensibilidade aos antimicrobianos 4. Referncias

Captulo 10 INTERPRETAO DE RESULTADOS E RELATRIOS 1. Introduo 2. Relatrios microbiolgicos 3. Anlise microbiolgica 4. Sugestes de relatrios por material 5. Referncias

Abreviaturas:

AS = gar sangue AC = gar chocolate BAL=lavado bronquio-alveolar BHI = Brain Heart Infusion (infuso cerebro-corao) CLED = gar CLED CTA = Cystine Trypticase agar DNAse = prova da Desoxi-ribonuclease EIA = imunoensaio enzimtico ELISA = teste de imunoabsoro ligado a enzima H2S = cido sulfdrico H2O2 = perxido de hidrognio (gua oxigenada) LCR = lquido cefaloraquidiano ou lquor LJ = gar Lowenstein Jensen MC = gar MacConkey mL = mililitro MYC = Mycosel NYC= meio New York City ONPG =o-nitrofenil-beta D-galactopyranosideo PCR = reao de polimerase em cadeia PYR = pyrrolidonil aminopeptidase rpm = rotaes por minuto SAB = gar Sabouraud SS = gar Salmonella Shigella SPS = Polietanol sulfonato de sdio TIO = caldo tioglicolato TMM = gar Thayer Martin modificado TSB = tripticase Soy Broth (caldo tripticase soja) UFC= unidades formadoras de colnia

CAPTULO 1 - INTRODUO ROTINA DE LABORATRIO

1. INTRODUO: O objetivo deste fascculo dar orientaes sobre procedimentos da rotina microbiolgica a partir da chegada do material bancada at a identificao dos principais microrganismos de importncia clnica. 1.1. O Mdulo 3 compreende: Esquema prtico de seleo de meios mais empregados na semeadura para isolamento de microrganismos de rotina. Leitura dos materiais semeados com base nas caractersticas das colnias, bacterioscopia e principais agentes esperados. Esquema geral de identificao. Identificao dos gneros e espcies de bactrias de importncia clnica. 1.2. O microbiologista ou responsvel pela rotina dever conferir as requisies ou pedidos de exame de cada material e a respectiva amostra para: Verificar a existncia de pedido e amostra apropriadamente identificados. Tipos de exames solicitados. Se a quantidade de material suficiente. Aspecto da amostra - purulento, lmpido, hemorrgico, etc. 2. ESQUEMAS DE IDENTIFICAO: Meios de Cultura 2.1. Cultura para fungos ou micobactrias Para fungos: Sabouraud e Mycosel, ver orientao especfica para semeadura. Para micobactrias: Lowenstein Jensen, materiais contaminados com flora devem ser previamente descontaminados (escarro, urina, BAL, fezes) 2.2. Coprocultura - recomendava-se semear em caldo enriquecedor do tipo Selenito, Tetrationato, etc., que tm valor duvidoso, sendo indicado atualmente para pesquisa de portadores. 2.3. Escarro para tuberculose - deve ser conservado em geladeira ou tratado para descontaminao, antes de semear em Lowenstein Jensen.

Tabela 1 - Meios de cultura para semeadura dos principais materiais clnicos Indicao de exames microscpicos
MEIOS DE CULTURA MATERIAL
AC AS
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Lmina
MC
X X X X X X X

TIO
X

OUTRO

LJ

SAB

MYC

Abscesso profundo Ferida cutnea/cirrgica Abscesso cerebral Abscesso pulmonar Bipsia 2.10 Coprocultura (fezes) 2.2 Lquido de Dilise 2.11 Endomtrio/ Amnitico Escarro piognicos Escarro para Tuberculose 2.3 Esperma/ Prosttico Fstula/ Dreno Gnglio 2.10 Lavado Brnquico (BAL) 2.4 Lquor (LCR) 2.5 Nasal/ Orofaringe Osso (Bipsia2.10 / Aspirado) Ocular Orofaringe Ouvido Peritonial/ Asctico Pleural Ponta de cateter 2.6 Sangue/ Hemocultura 2.7 Uretral 2.9 Urina 2.8 Vaginal/ Endocervical 2.9
Legenda: AS= gar sangue AC= gar chocolate CLED = gar CLED MC = gar Mc Conkey MYC = Mycosel
X

uma 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 uma duas duas duas SS no uma uma duas uma uma no 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 duas uma duas no uma duas uma uma uma 2.1 duas no uma TM CLED uma uma uma

TM

BAL =lavado bronco-alveolar (LBA) LJ = gar Lowenstein Jensen TIO = caldo tioglicolato TM = gar Thayer Martin (opcional) SAB = gar Sabouraud SS = gar Salmonella Shigella

2.4. Lavado brnquico: Homogeneizar o material em Vortex; Centrifugar parte do material e fazer duas lminas com o sedimento; Se houver pedido de pesquisa de micobactrias e fungos, fazer quatro lminas; Semear 10 L com ala descartvel ou calibrada e semear em AC para contagem de colnias (1/100); Diluir 1 mL da amostra em 9,0 mL de salina estril, homogeneizar e semear 10 L em AC para contagem de colnias (1/1.000); Semear desta mesma diluio com a ala de 1 L em gar Mc Conkey para contagem de colnias (1/10.000). 2.5. Lquido Cfalo Raquidiano (LCR): Centrifugar por 10 minutos/ 2.000 RPM, quando purulento, semear sem centrifugar. Semear em AC + AS + TIO Quando solicitado, pesquisar Criptococos, usando colorao com Tinta da China.

2.6. Ponta de cateter: 5 cm da ponta do cateter deve ser rolada 5 vezes sobre a placa de AS, utilizando a tcnica semi-quantitativa de Maki. Quando enviado pedao maior de cateter pode-se injetar 1 mL de salina cultivar separadamente (lmen). A superfcie externa pode ser semeada pela tcnica de Maki 2.7. Hemoculturas positivas: Semear em AC e fazer bacterioscopia (Gram). Frascos para micobactrias, fazer bacterioscopia (Ziehl).

2.8. Urina: dever ser semeada com ala calibrada de 10 L em Agar CLED (Brolacin). Se houver pedido de bacterioscopia: colocar 10 L da urina sobre uma lmina nova e deixar secar, corar pelo Gram, e verificar a presena de bactrias. Urina para diagnstico da tuberculose: deve ser guardada em geladeira ou descontaminada antes de semear.

2.9. Secreo vaginal, endocervical, uretral e urina: Fazer exame fresco de secreo vaginal para pesquisa de Trichomonas Centrifugar a urina para pesquisa de Trichomonas Na cultura para Neisseria gonorrhoeae suficiente gar-Chocolate. Para melhorar o isolamento, semear material endocervical e uretral, utilizando o meio seletivo de Thayer Martin. Mycoplasma e Ureaplasma swab uretral ou endocervical, removendo previamente a secreo e colhendo as clulas da mucosa por rotao do swab no canal. Usar meio de transporte especfico. 2.10. Para amostras slidas: bipsias, gnglios, amostras de tecidos, etc: Fragmentar o material com um gral e pistilo de porcelana ou vidro estreis contendo 1-2ml de salina estril ou caldo BHI ou TSB. Semear os fragmentos ou a poro lquida, e guardar o restante do material na geladeira para eventual uso. Estudos quantitativos so trabalhosos pois dependem de pesar o material slido, tritur-lo, diluir em volume definido de caldo (BHI, TSB ou Tioglicolato), bem como semear volume definido (10 ou 100L com pipeta calibrada, usando ponteira estril). O clculo para a contagem de colnias deve levar em conta o nmero de gramas de tecido usado e a diluio do caldo (UFC/grama de tecido). 2.11. Lquido de dilise: recomenda-se fazer cultura quantitativa semeando-se como urina, com ala calibrada e contagem de colnias, usando ala de 10 L e liberando o resultado em UFC/mL (multiplicando por 100). Paralelamente faz-se cultura qualitativa, semeando 2 a 3 ml em 5 ml de caldo (TSB, BHI ou Tioglicolato). No caso de cultura quantitativa negativa e qualitativa positiva, relatar: cultura positiva para (nome da bactria isolada), menor que 102 UFC/mL. 2.12. Casos especiais: No caso de secreo prosttica, em que o material bastante escasso, e existe contaminao uretral, recomenda-se semear rapidamente aps a coleta com ala calibrada de 10 L, e o resultado relatar em UFC/mL (multiplicando o nmero de colnias significativas do mesmo agente por 100),como para uroculturas.

Para outros materiais escassos colhidos com swab em meio de transporte: (material de vesculas, swab de crnea ou conjuntiva, uretral, etc.), pode-se semear diretamente o swab nos meios de cultura indicados, ou tentar obter uma concentrao do material do swab colocando-o em tubo estril com 0,5 mL de salina estril e agitando no vortex (mixer). Centrifugar e utilizar o sedimento como inoculo, ou fazer esfregao para bacterioscopia.

Tabela 2 - Escolha de Meios de Cultura Seletivos em Relao ao Agente

Agente Bordetella pertussis Brucella spp Campylobacter jejuni Corynebacterium diphtheriae Legionella spp Listeria monocytogenes Mycoplasma/ureaplasma Neisseria Neisseria meningitidis Vibrio spp Obs: Existem meios cromognicos especficos para diferentes patgenos.

Meio especfico de acordo com manuais de fabricantes Agar sangue Bordet-Gengou Brucella agar Campylobacter agar Agar cisitina-telurito Agar carvo-extrato de levedura tamponado Agar Listeria McBride Transporte: Meio B10 Shepard Cultura: Meio A7 Shepard Thayer Martin Thayer Martin TCBS Salmonella spp e S. typhi, E. coli O 157 Para algumas espcies de Candida Listeria monocytogenes, etc.

3. MICROSCOPIA - Tcnica para preparo do esfregao: Utilizar lmina nova e limpa. Identificar a lmina de maneira segura. Rolar toda a superfcie do swab sobre a lmina para no destruir as clulas. Procurar no fazer esfregao espesso e nem muito delgado. Fixar rapidamente na chama. Quando material escasso, demarcar a rea do esfregao Proceder o mtodo de colorao mais apropriado.

4. SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA: 4.1. Semeadura inicial - qualitativa Organizar as placas, pr-aquecidas em estufa(ideal para fastidiosos), ou temperatura ambiente, sobre a bancada conforme o material a ser semeado. Identific-las com o nmero da amostra e iniciais do paciente. Separar as lminas correspondentes cada exame, a serem preparadas e identific-las. Homogenizar o material, quando lquido (urina, LCR, sangue, pleural, etc.), escolher a poro mais purulenta no caso de secrees, ou no caso de fezes a parte com sangue, muco ou pus. Os swabs devero ser rolados sobre os meios de cultura, seguindo a sequncia dos mais ricos para os mais seletivos (AC, AS, MC). Com material muito lquido (LCR, pleural no purulento, concentrar o material por centrifugao a 2.500rpm (1500g) por 10-15 minutos e semear o sedimento. Na semeadura de rotina pode-se utilizar placas com divises de dois e trs compartimentos para racionalizao de gastos, mas seu uso exige maior habilidade na semeadura a fim de se obter colnias isoladas. Exs.: a) Semear hemocultura em placa trplice: gar sangue, gar chocolate e gar Mc Conkey. b) Semear secrees em placa dupla: gar sangue e gar Mc Conkey, proceder uma semeadura que permita o crescimento de colnias isoladas, etc. Tcnica de Semeadura Qualitativa - A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o prprio swab (do meio de transporte), ou amostra do material removida com ala (estril) flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentrao do inculo, que permita o isolamento de todas as colnias diferentes. Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para aprimorar a tcnica de semeadura e isolamento de colnias. Fig 1 Descarregar o material num canto da placa, Flambar a ala Esfriar a ala em um canto do gar Semear partindo da ponta da primeira semeadura

A cada mudana de direo flambar a ala e esfri-la. 4.2. Semeadura Quantitativa - Materiais indicados ou recomendados

Urina BAL (lavado bronco alveolar) Aspirado traqueal Bipsia de tecido Lquido de dilise Secreo prosttica Cateter (tcnica de Maki e outras) 4.2.1. Tcnica de Semeadura Quantitativa O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do nmero de ufc obtidas aps incubao. Utilizam-se dois artifcios para o efeito de diluio do material: uso de pequenos volumes- normalmente de 1, 10 ou 100 L. O nmero de ufc obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 mL, relativo ao volume inoculado; 1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada ou pipeta com ponteira estril. tcnicas dilucionais- costuma-se utilizar a diluio seriada do material em escala decimal, isto , 1:10, 1:100, 1:1.000... O nmero de ufc obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 mL, relativo diluio utilizada; 10, 100, 1.000..., respectivamente.

Procedimentos gerais homogeneizar o material com agitao manual em diferentes direes ou em vortex (mixer) obter o volume definido pela tcnica com o auxlio de uma pipeta com ponteira estril ou ala calibrada. No caso da ala, observar a integridade da pelcula formada at deposita-la na parte superior da placa. Ainda com a ala, sem flambar at o final da semeadura,

distribuir o material em linha reta at a outra extremidade. Perpendicularmente, distribuir o material por toda a superfcie de

maneira uniforme. Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes, ou at que a superfcie da placa esteja seca, alterando a direo da estria (Figura 2) evitar o uso de placas midas e, aps semeada, no incubar caso haja umidade na superfcie do agar evitar o rompimento do agar, estriando o material suavemente uma suspenso com 105 ufc/mL deve resultar em um tapete de colnias que cubra toda a superfcie do agar de maneira uniforme, com colnias confluentes

Figura 1

a) Inoculo inicial

b) Espalhamento

5. INCUBAO determinados.

a incubao deve seguir alguns parmetros

5.1. Atmosfera Para bactrias no exigentes em secrees, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. Para bactrias exigentes tais como: pneumococos, hemfilos e Neisserias ou fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 35% de CO2). Para Campylobacter necessrio tenso de 5 a 10% de CO2 e restrio de O2 sendo conveniente o uso de geradores especficos.

Para bactrias anaerbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita (vide captulo especfico).

5.2. Temperatura 36oC +/- 1oC a temperatura para a grande maioria das bactrias da rotina, incluindo os anaerbios e micobactrias. Fungos podem ser cultivados a 30oC ou 25 e 35oC (vide fascculo especfico) 42oC pode ser necessrio para isolar espcies de Campylobacter, Acinetobacter baumannii, e algumas espcies de Pseudomonas. 5.3. Umidade Bactrias fastidiosas e exigentes (Neisserias patognicas e hemfilos) crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tenso de 5% de CO2 com um chumao de algodo embebido em gua estril. 5.4.Tempo Em geral a primeira leitura realizada com 18 a 24horas de incubao ou em casos de urgncia para iniciar a identificao e antibiograma, a partir de 6 horas possvel visualizar crescimento de algumas enterobactrias. Para anaerbios recomendvel a primeira leitura com 48 a 72h de incubao Para bactrias exigentes ou de crescimento lento o perodo de incubao pode ser bastante prolongado: Mycobactrias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas at 45 dias). 5.5. Leitura alguns aspectos so fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnstico presuntivo e direcionar o exame. Caractersticas macroscpicas das colnias 5.5.1 Tamanho O tamanho das colnias dever ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode formar colnias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa Puntiforme (<1 mm de dimetro) - colnias muito pequenas, caractersticas de bactrias mais exigentes Pequena (at 2 mm de dimetro) Shigella e Yersinia costumam crescer em MC e SS como colnias pequenas e lactose negativa. Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp., Enterococcus spp., pneumococos, Streptococcus spp. Cndida spp. e alguns

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esfafilococos

coagulase

negativo

tambm

costumam

formar

colnias pequenas Mdia (at 3 mm de dimetro) Enterobactrias, no

fermentadores e Estafilococos Grandes (mais de 4 mm de dimetro) Bacillus spp., algumas enterobactrias como Klebsiella e Enterobacter, o mesmo ocorre com no fermentadores como Pseudomonas. Vale lembrar a formao de vu, caracterstico do gnero Proteus, Comamonas e algumas cepas de Pseudomonas. 5.5.2 Cor A colorao depender do meio de cultura utilizado o Meios no diferenciais pode-se identificar a colorao caractersticas de alguns microrganismos: S. aureus amarelo Micrococcus amarelo Serratia avermelhado Roseomonas - rseo Pseudomonas diferentes tons de verde e castanho Enterococcus casseliflavus amarelo

o Meios

diferenciais

colorao

da

colnia

sofre

interferncia das reaes que ocorrem com substratos dos meios de cultura Utilizao da lactose no MC vermelho Utilizao da lactose no CLEC amarelo Utilizao do manitol em agar manitol salgado amarelo Produo de H2S no HE e SS - negro

5.5..3 Hemlise Baseada na lise de hemcias contidas no agar sangue (5%) o Lise total denominada hemlise, ocorre a formao de halo de transparncia ao redor e/ou sob a colnia: S.

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pyogenes,

S.

agalactiae,

Listeria,

S.

aureus,

S.

haemolyticcus, Enterococcus ... o Lise parcial denominada hemlise, h formao de halo com colorao esverdeada: S. viridans, S. pneumoniae, Enterococcus. o Ausncia de lise definida como hemlise, meio de cultura inalterado: Enterococcus, Estafilococos coagulase negativo ...

5.5.4 Forma da colnia Redonda E. coli, Klebsiella, Serratia, Stenotrophomonas,

Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos Irregular Bacillus Produo de vu Proteus, Comamonas, Pseudomonas Filamentosas fungos filamentosos Formando pontas, como estrelas Cndida Com depresso no centro Pneumococo Cerebriforme Pseudomonas stutzeri Elevada Klebsiella, Bacillus Chata Enterobacter, Pseudomonas Pseudomonas, Proteus, Providencia, Morganella,

5.5.5 Consistncia Frivel, quebradia - Moraxella Mucide Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus Seca E. coli, Citrobacter, S. aureus Butirosa (manteiga) Candida

5.5.6 Densidade Opaca: E. coli, Candida, S. aureus Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococo

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5.5.7 Cheiro Eikenella corrodens cheiro de cloro Pseudomonas cheiro adocicado Anaerbios cheiro ftido

6. AVALIAO DO CRESCIMENTO E CONTAGEM 6.1. Cultura Quantitativa Avaliar a homogeneidade de crescimento pela placa Contar separadamente todas as colnias diferentes, at 300 ufc Para a contagem deve-se marcar com uma caneta o verso de cada unidade contada, para evitar que se conte duas vezes a mesma colnia Contagens maiores devem ser determinadas por estimativa o Dividir a placa em 4 ou 8 partes o Observar a homogeneidade do crescimento e contar as partes que sejam mais representativas do crescimento total o Contar o nmero de ufc da parte escolhida e multiplicar pelo total de partes Converter o nmero de ufc contadas em ufc/mL ou ufc/g, conforme o material analisado Utilizar o fator de correo o do volume: 1 L multiplicar por 1.000 10L multiplicar por 100 100L multiplicar por 10

o e/ou diluio utilizados: diluio 1:10 multiplicar por 10 diluio 1:100 multiplicar por 100 diluio 1:1000 multiplicar por 1000

6.2. Cultura Semi-quantitativa e Qualitativa

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Para a maioria das culturas no se padroniza o volume do inculo e semeia-se o swab e/ou com a ala, com a finalidade apenas de obter colnias isoladas para posterior identificao (secrees cutneo-mucosas, fezes, etc.). Para estes materiais o objetivo pode ser encontrar um patgeno especfico entre bactrias da microbiota considerada normal na rea de onde foi obtida a amostra clnica (S. pyogenes em orofaringe, Salmonella e Shigella em fezes, N. gonorrhoeae em secreo uretral, etc). Outras vezes deve-se relatar as bactrias potencialmente patognicas e descrever a relao entre as colnias isoladas (predomnio de..., presena de... ou raras colnias de...) Ex: Cultura de ferida cirrgica = predomnio de S. aureus, presena de P. aeruginosa e raras colonias de E. coli, e ignorar raras colonias de Staphylococcus coagulase negativo, ou de estreptococos alfa

hemolticos, corineformes, quando bacterias potencialmente patognicas forem isoladas. 7. IDENTIFICAO 7.1 meios de cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material Agar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos Agar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e

facultativas. Quando incubado em CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se observar halos esverdeados com colnias hemolticas Agar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo

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o Lactose positiva colorao avermelhada o Lactose negativa colorao inalterada o Como exceo, eventualmente, podem crescer

Enterococcus, Candida e Bacillus Agar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra) Agar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao alaranjada) e produo de H2S (colorao negra) Agar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae

7.2 colorao de Gram Deve-se realizar a colorao de Gram para todas as colnias crescidas em meios no seletivos quando o aspecto deixar dvidas quanto a sua classificao Com uma agulha microbiolgica estril, pegar pequena poro de uma colnia isolada e passar para uma lmina limpa e identificada Para facilitar a leitura, pode-se homogeneizar o material com uma gota de soluo salina estril em movimentos centrfugos Aguardar para que seque e fixar rapidamente sobre a chama Correlao entre as principais bactrias de importncia clnica e os tipos morfotinturiais: o Gram positivo Cocos Cadeias longas - estreptococos aerbios e anaerbios Cachos estafilococos e peptococos

(anaerbio)

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Cachos

ttrades

Micrococcus,

Stomatococcus, Aerococcus spp. Coco-bacilo (podem formar cadeias curtas) Aos pares Enterococcus Gram varivel Gardnerella Em chama de vela S. pneumoniae

Bacilos Retos e curtos Lactobacillus, Erisipelotrix, Listeria, Rhodococcus Ramificados Nocardia, Streptomyces,

Actinomyces, Propionibacterium (anaerbico) Difterides Corynebacterium Esporulados Bacillus, Clostridium

o Gram negativos Cocos (visualizados aos pares) Neisseria, Moraxella, Branhamella, Acinetobacter, Veillonella (anaerbio)

Coco-bacilo - Haemophillus (pleomrfico, ora cocobacilo, ora bacilo), Brucella, Bordetella, Pasteurella, Actinobacillus, Enterobactrias Bacteridesa (anaerbicos),

Bacilos Curvos Campylobacter, Helicobacter, Vibrio Helicoidais Arcobacter e Borrelia. Leptospira e Treponema (no visveis ao Gram) Retos Enterobactrias, no fermentadores Extremidades (anaerbio) afiladas Fusobacterium

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Extremidade (anaerbio)

bifurcada

Bifidobacterium

8. Esquema geral de identificao bacteriana 8.1 Analisar o crescimento bacteriano o Observar as caractersticas das diferentes colnias crescidas em cada meio de cultura utilizado. Lembrar que o tamanho das colnias de um mesmo agente pode ser varivel, conforme a proximidade com outras colnias o Por exemplo, semeadura em AS e MC: Observar quantos tipos de colnia cresceram em cada agar As colnias que cresceram somente em AS devem ser de microrganismo Gram positivo ou mais exigente Todas as colnias presentes no MC, microrganismos Gram negativo, devem apresentar correspondente no AS o A escolha dos meios utilizados para cada material deve estar relacionada aos agentes esperados. A Tabela 3 traz a relao dos principais meio de cultura e o seu perfil de seletividade

Tabela 3- Crescimento dos microrganismos nos principais meios de cultura utilizados na rotina Mais provvel Gram negativo, leveduras e enterococo Gram positivo
AC AS CLED MC SS Caldo TIO

+ +

+ +

+ +

+ -

+ -

+ +

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Gram negativos exigentes

+ + -

+ -

+*

Haemophilus
Anaerbios
+Meio d suporte ao crescimento - Meio no d suporte ao crescimento * Principalmente em coluna alta

8.2 Optar entre o crescimento a ser valorizado e o que dever ser ignorado

o Muitas vezes impossvel definir o significado clnico de um isolado sem conhecer sua identificao o Todo crescimento deve ser classificado como patgeno em potencial ou mero contaminante. Para tanto, deve-se reunir evidncias microbiolgicas, clnicas e epidemiolgicas: Conhecer os principais patgenos esperados para cada material biolgico (vide fascculo 2 para maiores detalhes) Obter o mximo de informaes apresentado Os componentes da microbiota residente (Micrococcus, sobre o quadro clnico

Estafilococos coagulase negativo, S. viridans...) apresentam menor valor preditivo positivo como agentes infecciosos, sendo de fcil interpretao na maioria dos casos. Entretanto, em condies especficas podem participar como agentes

patognicos. Por exemplo: Duas ou mais hemoculturas perifricas com S. viridans podem ser consideradas como possvel diagnstico de bacteremia por este agente, devendo ser investigada a possibilidade de endocardite Observar se a cultura pura ou se existem diferentes tipo de colnias, neste caso, se h predomnio de um tipo. As culturas puras apresentam maior valor preditivo positivo para diagnstico, especialmente em stios intensamente colonizados.

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Por exemplo: cultura pura

de Pseudomonas aeruginosa ou

Candida em coprocultura. Entretanto, podem ocorrer tambm como contaminantes. Por exemplo: cultura pura de S. viridans em swab de orofaringe Sempre que possvel, deve-se traar um paralelo entre os achados da bacterioscopia direta do material e o resultado da cultura, buscando: Valorizar achados de cultura bacterioscopia com predomnio de cocobacilos pleomrficos em BAL e

isolamento de Haemophillus em cultura, ainda que em baixas contagens por dificuldades de crescimento Definir contaminantes presena de abundantes clulas epiteliais na bacterioscopia da urina no centrifugada ou em escarro, denotando a contaminao com a microbiota local Detectar falhas nas condies de coleta e/ou

processamento laboratorial e uso de antimicrobianos Bacterioscopia de liquor, lquido articular ou secreo conjuntival com diplococos Gram negativo aos pares intracelulares e cultura negativa Caracterizao de infeco por anaerbios cultura

negativa com bacterioscopia revelando microrganismos com caractersticas morfolgicas de anaerbios

Quantificao em culturas quantitativas os achados da bacterioscopia direta devem coincidir com as contagens obtidas em cultura (urocultura, BAL, aspirado traqueal ...)

8.3 Colorao de Gram das colnias isoladas o Sempre que utilizar meio no seletivo o Quando utilizar meios seletivos e desejar confirmar a concordncia entre a classificao morfotinturial e o meio utilizado o Para verificar a presena de leveduras, neste caso o exame direto com salina suficiente

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8.4 Direcionamento da identificao

De acordo com o crescimento em meio seletivo e o resultado da bacterioscopia, seguir a rotina especfica:

Coco Gram positivo, vide Cap. 2 - Staphylococcus e Streptococcus Coco Gram negativo, vide Cap. 3 - Neisserias e diferencial de Acinetobacter. Bacilo Gram negativo e oxidase negativa, vide Cap. 4 - Enterobactrias Bacilo Gram negativo e oxidase positiva semear no TSI Se no fermentador, vide Cap. 5 - No Fermentadores Se fermentador, vide Cap. 6 - Aeromonas / Plesiomonas / Vibrio

Bacilo curvo ou espirilado, vide Cap. 7 - Bacilos Curvos ou Espiralados Coco-bacilo Gram negativo que cresce apenas em gar Chocolate podendo ou no necessitar de CO2 vide Cap. 8 - Fastidiosos Cocobacilo ou bacilo Gram positivo, vide Cap. 9 - Bacilos Gram positivos Bactria que no cresce em aerobiose, vide Cap. 10 - Anaerbios estritos

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Captulo 2 - ESTAFILOCOCOS, ESTREPTOCOCOS, ENTEROCOCOS E OUTROS COCOS GRAM POSITIVOS

1. INTRODUO: Os Estafilococos so as bactrias no esporuladas que mais resistem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clnicas secas, so relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentrao aumentada de sal. No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condies sanitrias e das medidas de controle de infeco hospitalar, este microrganismo continua a ser um dos mais importantes patgenos para o homem. Indivduos sadios so colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentao, e podem albergar o microrganismo na nasofaringe, ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir destes stios, o S.aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infeces letais por conta dos fatores de virulncia ou atravs de resistncia aos antimicrobianos atualmente utilizados. J foram descritos no Brasil casos de infeces causadas por Staphylococcus aureus parcialmente resistentes aos antibiticos mais potentes como a Vancomicina, e relatos da capacidade que os Staphylococcus coagulase negativa tem de desenvolver resistncia, da a necessidade de identificao rpida e eficiente de todos os casos em que estes microrganismos se apresentam. Os estreptococos foram os maiores causadores de infeco hospitalar na era pr-antibitica, causando surtos de infeco e morte de purperas. Apesar de no serem importante causa de infeco hospitalar nos dias de hoje, provocam, no entanto doenas muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes, sendo importante o rpido diagnstico deste agente. J os enterococos apresentam importncia crescente como causadores de infeco hospitalar, pelo aparecimento de resistncia quase total aos antibiticos tradicionalmente utilizados para tratamento destas infeces.

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Os Enterococos mais comumente isolados so: Enterococcus faecalis (90% dos casos) e Enterococcus faecium, com grande capacidade de colonizao de pacientes e de contaminarem superfcies ou equipamentos utilizados em hospitais. Possuem sensibilidade ou resistncia varivel aos antibiticos chamados glicopeptdios como a vancomicina e teicoplanina. Existem, atualmente, cepas comensais naturalmente resistentes a vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porm no sendo ainda capazes de causar surtos, mas que devem ser corretamente identificadas. 2. IDENTIFICAO PRELIMINAR: A identificao dos estreptococos e estafilococos baseada na morfologia que apresentam em meios lquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados. A identificao presuntiva comea com a inoculao primaria na placa de gar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tenso de CO (mtodo da vela ou estufa de CO2). As colnias de estafilococos so geralmente maiores, convexas, de colorao variando do branco porcelana a amarelo podendo apresentar hemlise ou no. Note-se que o desenvolvimento da cor amarelada no S. aureus ocorre somente aps incubao prolongada (72h), temperatura ambiente. As colnias de estreptococos tendem a ser menores (puntiformes), e com halos de hemlise total ou parcial (beta e alfa hemlise). A diferenciao entre os estreptococos e os estafilococos se d, seguramente, pela prova da catalase. 2.1. Prova da Catalase Com a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregao uma gota de gua oxigenada a 3 % e observar a formao de bolhas. Para a famlia Microccocacea (estafilococos) a prova geralmente positiva, enquanto para a famlia Streptococcacea (estreptococos) negativa.

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Tabela 1 - Diviso dos cocos Gram positivo pela prova da catalase

Catalase positivos Staphylococcus spp Micrococcus spp Planococcus spp Stomatococcus spp Catalase negativos Enterococcus spp Streptococcus spp Aerococcus spp Gemella spp, Leuconostoc spp. Lactococcus spp, Stomatococcus spp

Ao coletar a colnia no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode acarretar resultados falso positivos porque o sangue do meio contm catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reao positiva (fazer Gram e ver disposio em cadeia curtas ou aos pares). Tabela 2 - Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica
Gnero Staphylococcus Planococcus Micrococcus Enterococcus Streptococcus Aerococcus Stomatococcus* Catalase + + + neg. neg. neg. varivel Motilidade neg. + neg. varivel neg. neg. neg. NaCl 5% + + + + V + neg. Oxidase neg. neg. + neg. neg. neg. neg. Aerbio estrito No + Varivel No No No No Ttrade varivel varivel varivel no no + varivel

Legenda: neg. = negativo

*aderente ao meio

Tabela 3 - Cocos Gram positivo, Catalase negativos, Motilidade Negativos 1

Gnero Enterococcus Streptococcus Aerococcus Leuconostoc Pediococcus Gemella Stomatococcus Legenda:
1 2

NaCl 6,5% + neg. + V V neg. neg.

Vancomicina V S S R R S S

PYR + neg V neg. neg. + +

2

Bile Esculina + neg V V pos.+ neg. +

3

Ttrade no no V no V no varivel

E casseliflavus e E. gallinarum so + S = sensvel + = positivo S. pyogenes + R = resistente neg = negativo 3 alguns S. viridans podem ser + V = varivel

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3. IDENTIFICAO DE ESTAFILOCOCOS O teste mais importante na identificao da famlia Micrococcaceae a prova da catalase, e esta famlia composta de quatro gneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus. O gnero Staphylococcus apresenta 32 espcies, 14 sub-espcies, sendo que somente 15 espcies so encontradas em amostras humanas, e de uma maneira prtica os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase. Tabela 4 Provas diferenciais dos generos Catalase positivos
Gnero Staphylococcus Planococcus Micrococcus Stomatococcus * Motilidad e neg. + neg. neg. NaCl 5% + + + neg. Oxidase neg. neg. + neg. Aerbio estrito no + + no Ttrade varivel varivel + varivel

Tabela 5 - Identificao das espcies de Staphylococcus de maior importncia clnica

Espcie S. aureus S. epidermidis S. lugdunensis S. haemolyticus S. saprophyticus S. schleiferi S. intermedius S. hyicus DNAse + neg neg neg neg neg + + PYR neg neg + + neg + + neg Novob. S S S S R S S S Uria varivel + varivel neg + neg + varivel Polimixi na R R varivel S S S S R ornitina pos. ornitina neg. Isolado em urina sacarose neg. Outras pig. amarelo

Existem cerca de 31 espcies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais freqentes so: Staphylococcus epidermidis, causador de infeces de cateteres e prteses e o mais freqente microrganismo encontrado em hemoculturas. Staphylococcus saprophyticus, causador de infeco urinria em mulheres jovens.

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Staphylococcus haemolyticus, importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, alm da hemlise que apresenta na placa de gar sangue de carneiro podendo ser confundido com o S. aureus

3.1. Teste da resistncia a Novobiocina A cepa semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5g. As amostras resistentes mostram zonas de inibio de 6 a 12 mm, enquanto susceptveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus so resistentes. Tabela 6 - Testes da Trealose, Urease e Novobiocina
Espcies S. epidermidis S. haemolyticus S. saprophyticus Trealose Negativa Positiva Positiva Urease Positiva Negativa Positiva Novobiocina Sensvel Sensvel Resistente

3.2. Identificao dos Staphylococcus aureus. A forma mais simples de identifica o Staphylococcus aureus a prova da coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lamina. a) Teste da coagulase em lmina - A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante ) clumping factor na superfcie da parede celular, que reage com o fibrinognio do plasma causando a coagulao do mesmo. Coloca-se 2 gotas de salina em uma lmina e emulsiona-se uma colnia isolada a ser testada, a seguir coloca se uma gota de plasma e misturase com um palito de plstico ou madeira, observando se h aglutinao em 10 segundos. No se pode executar este teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como gar manitol. b) Teste da coagulase em tubo - Este teste baseia-se na presena da coagulase livre que reage com um fator plasmtico formando um complexo que atua sobre o fibrinognio formando a fibrina. O teste melhor efetuado se adicionarmos 0,1 mL

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de caldo BHI incubado por uma noite com a colnia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 mL de plasma e incubado a 4 horas a 35C em estufa ou banho maria. A formao do cogulo observada pela inclinao suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. Um mtodo alternativo a emulsificao desta mesma colnia suspeita em um 0,5 plasma e incubado da mesma forma. Qualquer cogulo indica uma prova positiva, porm no confundir com precipitados ou floculao. O melhor plasma a ser usado e o de coelho com EDTA, no devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue. c) Teste da DNASE o Staphylococcus aureus produz a enzima DNAse e a endonuclease termoestvel. Este teste consiste na inoculao de colnias em meio contendo DNA, (DNAse test gar) obtido comercialmente. A evidenciao da positividade pode ser feita pela utilizao do meio original adicionado de azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%. O meio adquire uma colorao azul intensa e o aparecimento de uma colorao rsea caracterstica, ao redor das colnias produtoras de DNAse, indica a positividade da prova, aps incubao de 24 horas a 35C. O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e
permite o repique da amostra positiva para teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne placa original onde nem sempre as colnias esto bem isoladas.

O teste da endonuclease termoestvel efetuado no mesmo meio de DNA, mas colocando se gotas de caldo de cultura turvo com a colnia suspeita e que foi fervido por 15 minutos. Fazer pequenos orifcios no meio (em placa) utilizando-se canudos de refrigerante. A leitura do teste semelhante ao da DNAse. Note-se que este mtodo pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em que foi observado o crescimento de cocos Gram positivos agrupados. d) Outras provas que diferenciam o Staphylococcus aureus Aglutinao em ltex ou em hemcias de carneiro - sorologia Estes testes geralmente detectam a coagulase livre e alguns apresentam tambm uma imunoglobulina antiprotena A presente da parede do Staphylococcus aureus. Como so disponveis comercialmente, deve-se seguir as instrues do fabricante. Teste do crescimento em agar manitol

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O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de cloreto de sdio, denominado gar manitol salgado ou Meio de Chapman, e o indicador de pH o vermelho de fenol, que indica uma reao positiva quando o meio ao redor das colnias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado. e) Identificao de outros gneros - A diferenciao entre Micrococcus sp e os Staphylococcus sp se d pela colorao de Gram, em que os Micrococcus aparecem em ttradesdas, ou pela pigmentao de suas colnias (amarelas, rseas ou alaranjadas). Alguns no apresentam pigmentos e podem ser diferenciados pela sensibilidade a Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificao de Streptococcus pyogenes, mas utilizando-se a inoculao em gar Mueller Hinton. 4. IDENTIFICAO DOS ESTREPTOCOCOS Os Estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparncia na placa de gar sangue aps incubao a 35C em presena de 5% de CO, podendo apresentar: hemlise total (Beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). A identificao de espcie de estreptococos beta hemolticos feita atravs de aglutinao com soros especficos contra os antgenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rpida, porm no acessvel a todos os laboratrios em virtude do elevado custo. 4.1. Teste da Bacitracina - importante notar que as identificaes devem ser feitas em gar sangue sem tenso de CO ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de gar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma. Coloca-se se o disco de Bacitracina 0,004 U como indicado e incuba-se por uma noite a 35 C sem CO e observa-se qualquer zona de inibio como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) assim rapidamente identificado.

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4.2. Teste do Sulfametoxazol Trimetoprim (SXT) Adiciona-se na mesma placa de agar sangue o disco de SXT e incuba-se por uma noite a 35C sem CO . A sensibilidade a esta droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo no pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield. Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim esquerda. Havendo necessidade, na mesma placa pode ser feito o teste de CAMP, conforme desenho abaixo.

Bacitracina

2 1

Sulfazotrim

S. aureus Camp test Cepas teste

1 - Disco de bacitracina
2 - Disco de sulfametoxazol-trimetoprima 3 - Camp Test linha vertical:estria com cepa beta hemoltica de Staphylococcus aureus (ATCC 25923) linhas horizontais: cepas teste

4.3. Teste de Camp (na mesma placa)

Inocula-se uma estria nica de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de gar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. Esta linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque. Inoculam-se as amostras a serem testadas em estrias formando um ngulo reto com a linha de inoculao da amostra teste de estafilococo. As estrias no devem se tocar, ficando a 1mm de distncia, e deste modo vrias amostras podem ser testadas em uma

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mesma placa de gar sangue. A maneira de inocular fundamental para a observao do efeito esperado. Incuba-se a placa a 35-37C durante um perodo de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flexa caracterstica, na rea de interseco entre as duas estrias.

4.4. Teste do PYR Este teste determina a atividade do PYR tambm chamado pyrrolidonylaminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e tambm pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colnias puras para o teste ou podem surgir resultados errneos. Seguir as instrues do fabricante, j que disponvel comercialmente.
Esse teste tecnicamente, equivalente prova da hidrlise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificao clssica dos enterococos, e mais especfico que o teste da Bacitracina na caracterizao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo "A", tendo a vantagem de ser mais rpido. Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos ou, na impossibilidade da realizao de testes sorolgicos de confirmao, reforar o valor dos testes presuntivos clssicos de identificao do Streptococcus pyogenes.

4.5. Teste da bile esculina e do NaCl 6,5 % Semear tambm as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5% e incubar da mesma forma. O teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve mostrar turvao para ser considerado positivo. Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D no enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerncia ao NaCl a 6,5% somente os Enterococos so positivos. Tabela 7 - Identificao de estreptococos beta hemolticos

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Identificao S. pyogenes S. agalactiae Enterococcus sp Estreptococo No A, B ou D.

Sensibilidade a Bacitracina S R R R

CAMP / Hidrlise de hipurato Negativo Positivo Negativo Negativo

Sensibilidade a SXT negativo negativo negativo positivo

Bile Esculina e Tolerncia a NaCl 6,5% negativos negativos positivos negativos

4.6. Teste da hidrlise do hipurato Os Streptococcus agalactiae (grupo B) so tambm capazes de hidrolisar o hipurato em seus componentes: glicina e cido benzico. Identificao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, B e D.

4.7. Identificao dos estreptococos no beta hemolticos Somente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e D (Enterococcus spp e Streptococcus bovis) podem no apresentar nenhuma hemlise, a denominada gama hemlise. Tabela 8 - Identificao de estreptococos gama hemolticos ou sem hemlise
Identificao Streptococcus agalactiae Enterococo S. bovis CAMP e hidrlise do hipurato Positivo Negativo Negativo Bile esculina Negativo Positivo Positivo Tolerncia a NaCl 6,5% Negativo Positivo Negativo

4.8. Identificao dos estreptococos Estreptococos alfa hemolticos A identificao deste grupo no deve ser feita por mtodos sorolgicos, pois que a maioria no possui os antgenos de Lancefield.

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Tabela 7 - Identificao dos estreptococos alfa hemolticos

Identificao Pneumococo Enterococos Grupo viridans Streptococcus Bovis Optoquina e Bile solubilidade Positivo Negativo negativo Negativo Bile esculina Negativo Positivo Negativo Positivo Tolerncia a NaCl 6,5% Negativo Positivo negativo Negativo

4.9. Teste da optoquina Semear um quarto de uma placa de gar sangue com a cepa alfa hemoltica a ser testada e aplicar um disco de optoquina e incubar a 350C em tenso aumentada de CO, mtodo da vela. Uma zona de inibio de 14 mm ou mais volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae. 4.10. Teste da bile solubilidade O teste da bile solubilidade tambm identifica o Streptococcus pneumoniae. Pode ser executado em placa ou em caldo. Tomando se um caldo turvo aps 3 horas de incubao a 35C inocula se uma suspenso de desoxicolato a 10%. O clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo prova. O teste em placa consiste de inoculao de gotas de desoxicolato de Sdio a 2% sobre as colnias suspeitas e incubao a 35C por 30 minutos. As colnias positivas iro desaparecer por lise bacteriana. Suspeitar da presena de variante nutricional de Streptococcus destes microrganismos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias que no crescem no subcultivo em gar sangue. Semear o repique em gar sangue e fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificao presuntiva de Haemophilus influenzae e incubar a 35C em atmosfera com CO.

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Tabela 8 Identificao dos enterococos mais importantes clinicamente

Espcie E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum Arabinos e Negativo Positivo Positivo Positivo Sorbitol Positivo Varivel Varivel Negativo Crescimento Telurito 0,04% positivo Negativo Negativo Negativo Motilidade Negativa Negativo Positiva Positiva Pigment o Negativo Negativo Positivo Negativo Vancomicina Varivel (S) Varivel Resistente Resistente

5. BIBLIOGRAFIA 1. KONEMAN, E.W., ALLEN, S.D., JANDA, W.M., SCHRECKENBERGER, P.C., WINN Jr, W.C. Staphylococci and related organisms in: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th ed., Lippincot, 1997. 121-170. 2. ________ Streptococci and Streptococcus Like Bacteria. in: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Cap 9. 5th ed., Lippincot, 1997. 121170. 3. MAYHALL, C.G. Staphylococcus aureus. In: Hospital Epidemiology and Infection Control. Cap. 17. Williams & Williams, 1996. 4. ________ Streptococci and Enterococcus species. In : Hospital Epidemiology and Infection Control. Captulo 20/21. Williams & Williams, 1996.. 5. MURRAY, P. R. et alli. Staphylococcus and Micrococcus . In: Manual of Clinical Microbiology. Cap. 16. American Society for Microbiology. 7th ed. Washington. DC, 1999. 6. ________ Idem captulo 17 Streptococcus. In: Manual of Clinical Microbiology. Cap. 17. American Society for Microbiology. 7th ed. Washington. DC, 1999.

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Captulo 3 - NEISSERIAS

1. INTRODUO: As espcies de Neisseria tem como caracterstica morfolgica serem diplococos Gram negativos mais achatadas nas laterais, dando a forma de rins ou dois gros de feijo unidos por uma ponte. Apenas a espcie elongata difere desta morfologia, sendo diplobacilos ou diplo-cocobacilo. Todas Neisserias so oxidase positivas e catalase positivas exceto Neisseria elongata e Kingella denitrificans. Todas utilizam carbohidratos por via oxidativa e no fermentativa, sendo baixa a acidez, de modo que podem acontecer reaes duvidosas com o meio CTA (Cistyne Tripticase gar) com indicador vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina. As diferentes espcies de Neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, so analisadas junto com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp, Acinetobacter spp, Kingella spp e Alcaligenes spp pelas caractersticas morfolgicas de serem cocos ou cocides ao Gram e pela possibilidade de haver confuso na sua identificao. Quanto sua importncia clnica, a maioria das neisserias comensal vivendo em mucosas de humanos e animais. Tabela 1 - Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gram negativo
Bactria Morfologia Oxi Cat OF Gli CTA Gli DNAse Cres AS MOT

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria spp Moraxella catharralis Kingella spp Moraxella spp Acinetobacter spp Alcaligenes faecalis

diplococo diplococo diplococo/ bacilo diplococo cocobacilo cocobacilo cocobacilo Cocobacilo/ bacilo

+ + + + + + neg +

+ + v + neg + + +

no cresce no cresce v (oxidativo) inerte fermentador inerte v (oxidativo) inerte

+ + v neg + neg v neg

neg neg neg + neg neg neg neg.

+ neg + + + + + +

neg neg neg neg V neg neg +

Legenda: Oxi = oxidase, Cat=catalase, OFGli=OF Glicose,CTAGli= utilizao da glicose em base Cistina tripticase agar, Cres AS = cescimento em gar Sangue, + = positivo, neg = negativo v = varivel, Mot = motilidade

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a)

Neisseria gonorrhoeae - sempre considerada patognica, de

transmisso sexual ou pelo parto e indicativa de tratamento. No homem causa uretrite, sendo at 50% assintomtica e est relacionada a complicaes como epididimite, prostatite e estenose uretral. Na mulher causa corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, abscessos vestibular, salpingo-ooforite e doena inflamatria plvica. Pode ser isolada tambm na mucosa oral e anal, e em rcem-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum. A doena sistmica disseminada pode ocorrer em 1 a 3% dos pacientes infectados, principalmente em assintomticos e caracterizada por febre, tremores, leses cutneas, artrite de extremidades. As leses cutneas so do tipo mculopustulares ou hemorrgicas, com centro de necrose. Raramente ocorre artrite sptica com 50% de positividade de isolamento. Pode ocorrer meningite e endocardite. b) Neisseria meningitidis - pode causar meningite, infeco sistmica grave com coagulao intravascular disseminada (CIVD) e elevada mortalidade, podendo causar em associao outras infeces (conjuntivite, artrite, sinusite e pneumonia). Em mucosas pode ser isolada em portadores sos em 5 a 15 % dos indivduos e por perodos de semanas a meses. A transmisso se faz por vias areas. c) Moraxella (Branhamella) catarrhalis - potencial patgeno de vias areas, principalmente em crianas e adultos jovens. Causa com maior freqencia otite, sinusite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite e meningite. Em idosos, aps o Haemophylus. influenzae e o Pneumococo, constitui a terceira causa de pneumonia em pacientes com doena pulmonar obstrutiva crnica. Em adultos, raramente, isolada em pacientes assintomticos. Cerca de 80% das cepas so produtoras de beta-lactamase, e so detectadas atravs do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromognica). Outras espcies de Neisseria raramente so isoladas em casos de endocardite. 2. ISOLAMENTO:

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2.1. Neisseria gonorrhoeae - Material clnico para isolamento (escolha depende dos sintomas): Uretral, Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas), Retal (colher secreo mucosa e no fezes, utilizando meio seletivo tipo Thayer Martin), Orofaringe, Conjuntiva, Glndula de Bartholin, Trompas, Endomtrio, Lquido sinovial, Leses de pele, Sangue. Recomenda-se: a) utilizar swab com algodo atxico ou swab de Rayon ou Dacron. b) Semear o mais rpido possvel nos meios slidos, e usar placas aquecidas prviamente em estufa c) Urina pode ser utilizada, aps centrifugao rpida e semeadura do sedimento em meio seletivo. Deve-se, no entanto, preferir outros materiais com maior chance de isolamento. d) Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS que inibidor para as N. gonorrhoeae (Ex: Caldo BHI com 1% de gelatina). e) Em leses de pele preferir a bipsia que o swab. f) Incubar em jarra com umidade e vela g) Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram 2.2. Neisseria meningitidis - Materiais clnicos para isolamento, de acordo com aspectos clnicos: LCR, Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anticoagulante), Aspirado de petquias, sufuses hemorrgicas ou bipsias, Liqudo sinovial, Swab de conjuntiva, Aspirado traqueal, ou trans traqueal ou escarro, Swab de nasofaringe (prefervel a swab de orofaringe). 2.3. Moraxella (Branhamella ) catarrhalis - Material clnico adequado para isolamento de acordo com o quadro clnico: a) Otite mdia timpanocentese (miringotomia) quando indicado. Secreo colhida com swab em geral revela flora contaminante, exceto se rompimento expontneo muito recente e sem uso prvio de antimicrobianos. b) Sinusite aspirado de seios da face comprometidos, quando indicado.

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c) Infeces do trato respiratrio inferior/pneumonia - Escarro, aspirado traqueal, transtraqueal podem ser teis ou BAL, quando indicado e comparados com bacterioscopia.

3. TRANSPORTE E SEMEADURA DO MATERIAL O ideal semear imediatamente aps a coleta em meio slido, levar para a estufa 36oC em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade. O uso de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser considerada uma alternativa de risco. Para M. catarrhalis os meios de transporte so adequados. 3.1. N. gonorrhoeae - sensvel a variaes de temperatura acima de 37oC ou abaixo de 35oC, de modo que a amostra no pode ser refrigerada. a) recomenda-se gar chocolate enriquecido com suplemento com l-cistena, NAD e vitaminas (Isovitalex ou similar), embora seja possvel obter crescimento de algumas cepas em gar sangue. b) incubar em jarra com umidade (bola de algodo e gua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2) c) Secreo retal, swab de orofaringe, ou outros materiais com maior microbiota contaminante ou menor expectativa de isolamento semear alm do meio rico em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) (NYC). 3.2. N. meningitidis - um pouco mais tolerante a variaes de temperatura, mas recomenda-se para transporte ambientes com CO2. a) cresce bem em gar sangue, mas por precauo deve-se semear tambm em gar chocolate. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e agua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2) b) materiais com maior flora contaminante ou menor expectativa de isolamento semear alm do meio rico em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM)( ou meio New York City (NYC) ou meio New York City

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Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactrias, a maioria das outras espcies de Neisserias (7,5g/mL de colistina), Gram positivos (Vancomicina 3 g/mL) e fungos(13,5g/mL de nistatina) e contm suplementos para suportar crescimento das Neisserias meningitidis e N. gonorrhoeae. 3.3. Moraxella catharralis - tolera temperatura ambiente e cresce bem em gar sangue. Material estril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, bipsia, conjuntiva, nasofaringe) pode-se usar meio no seletivo 4. BACTERIOSCOPIA E IDENTIFICAO 4.1. Bacterioscopia A partir das amostras genitais, LCR, bipsia, etc., deve-se sempre reservar material para a bacterioscopia, fazendo o esfregao no momento da coleta, ou colhendo dois swabs, ou material suficiente para a semeadura e bacterioscopia. Quando o swab nico, no caso das Neisserias d-se preferncia semeadura imediata e posteriormente ressuspender o swab em 1mL de salina, agitar no Vortex, centrifugar e fazer um esfregao do sedimento. Relatar a bacterioscopia: de modo a quantificar no material analisado a presena ou ausncia de diplococos Gram negativos com caractersticas de neisserias em: raros (+), poucos (++), moderados (+++) e muitos (++++), descrevendo se os microrganismos so extra-celulares ou intra-celulares, quantidade de neutrfilos e de clulas epiteliais. importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do paciente, como quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual fundamental o isolamento e identificao completa, considerando-se que neisserias saprfitas ou mesmo Acinetobacter spp podem ser diagnosticados erroneamente como N. gonorrhoeae. 4.2 Identificao - N. gonorrhoeae crescem em gar chocolate formando colnias pequenas, sendo em geral menores que as de neisserias saprfitas, que apresentam maior tamanho. A cor pode variar de cinza a amarelo. A colnia da M. catarrhalis de cor cinza rseo-acinzentado, sendo comumente frivel, saindo inteira quando

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removida com a ala bacteriolgica. As colnias de N. meningitidis A e C capsuladas apresentam-se mucides. Testes imunolgicos - No substituem a cultura e a bacterioscopia, e para o diagnstico da gonorria existem no comrcio recursos do tipo ELISA, sondas genticas de acido nuclico, PCR e suas variantes, de elevado custo e indicado em levantamentos epidemiolgicos, ou quando no se dispe dos recursos tradicionais. Para LCR e outros fludos estreis e mesmo urina, a caracterizao de Neisseria meningitidis pode ser feita pela tcnica de aglutinao com partculas de ltex que rpida, com boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. O teste pode ser positivo nos casos de cultura negativa por uso prvio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo elevado. Para o tipo B alguns produtos oferecem testes para afastar reao cruzada com E. coli. A reao negativa no exclui o diagnstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a cultura. 4.3. Bacteriologia - A identificao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser feita em dois nveis: presuntivo e confirmatrio. Em servios de Sade Pblica (DST) onde a prevalncia da gonorria significativa, para fins prticos de tratamento pode-se fazer o diagnstico utilizando-se aspectos clnicos associados bacterioscopia positiva (Diplococos Gram negativos intra-celulares) em pacientes de risco. Deve-se, no entanto, sempre colher material para cultura, possibilitando a confirmao e monitoramento da resistncia destas bactrias. Na ocorrncia de surtos de meningite meningoccica, o diagnstico presuntivo para fins de tratamento, tambm pode basear-se na clnica e na bacterioscopia do LCR ou de leses (petquias e prpuras). As culturas devem sempre ser colhidas para confirmao, identificao de sorotipo e sensibilidade aos antimicrobianos. Atravs dos seguintes procedimentos: a) Fazer bacterioscopia das colonias isoladas para confirmar a presena de diplococos Gram negativos com forma de dois feijes. b) Fazer o teste de oxidase das colonias sugestivas.

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c) Deve-se procurar afastar outros gneros de bactrias como Acinetobacter spp, Kingella spp e Moraxella spp que so morfolgicamente parecidos. d) Um recurso prtico para evitar erros de identificao de Acinetobacter spp e Kingella spp como Neisserias semear o agente suspeito em gar chocolate e colocar um disco de penicilina de 10UI. Aps 24h fazer um Gram das colnias que crescerem prximas a zona de inibio. Se permanecerem cocides com aspecto de neisserias confirma-se o isolamento; caso tenham adquirido a forma de bacilos longos, o isolado no de Neisseria. e) Outro passo importante verificar a capacidade de crescimento em meios pobres como o gar nutriente ou a necessidade de crescimento em meio rico (gar chocolate suplementado). f) A identificao das espcies de neisseria baseia-se na utilizao de acares: glicose, maltose, lactose, sacarose e frutose. Como as neisserias utilizam carbohidratos por via oxidativa, a base Cistina Tripticase agar (CTA) adicionada de 1% de cada um dos aucares e com indicador vermelho de fenol tem sido utilizado. No entanto, reaes duvidosas podem ocorrer, por falha na deteco da acidez produzida pela bacteria, dificultando a identificao. Recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao Laboratrio de Referncia para confirmao. Tabela 2.- Provas de rotina para diferenciar Neisserias patognicas
Bactria N. gonorrhoeae N. meningitidis Outras neisserias M. catharralis Kingella spp AC 220C neg neg + + v A. Nut. 350C. neg v + + + DNAse neg neg neg + neg Gli + + v neg + Mal neg + v neg neg Lac neg neg v neg neg Sac neg neg v neg neg Fru neg neg v neg neg

Legenda: AC = agar chocolate; A. nut. = gar nutriente ; GLI = glicose; Mal = maltose; Lac = lactose; Sac = sacarose; Fru = frutose

5. REFERNCIAS

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1. ESCHENBACH, D.A.,POLLOCK, H.M., SCHACHTER, J. CUMITECH 17. Laboratory

diagnosis of female genital tract infection. Coord. Ed. S.J. Rubin. ASM. Washington, D.C., 1983.

2. EVANGELISTA, E.T.,BEILSTEIN, H.R. CUMITECH 4A . Laboratory diagnosis of gonorrhoea. Coord. Ed. C. Abramson. ASM. Washington, D.C. 1993. 3. FORBES, B.A.; SAHM, D.F.; WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 10th Ed. St. Louis. Mosby, 1998. 4. KONEMAN, E.W., ALEN, S.D., JANDA, W.M., SCHRENKENBERGER, P.C.,; WINN Jr., W.C. Diagnostic Microbiology. Color Atlas and Textbook. 5th Ed. Lippincott, 1997. 5. THAYER, J.D., MARTIN, J.E. Jr. A seletive medium for the cultivation of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis. Public Health Rep., 79: 49 - 57, 1964.

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Captulo 4 - ENTEROBACTRIAS:

1. INTRODUO: a maior e mais heterognea famlia de bactrias Gram negativas de importncia mdica. So considerados atualmente: 27 gneros / 102 espcies / 08 grupos indefinidos. Independente da complexidade, mais de 95% das amostras implicadas em caso clnicos so colocadas em 25 espcies, sendo possivel o isolamento de enterobactrias de qualquer amostra clnica.

1.1. Caracterizao da famlia Enterobacteriaceae: so bacilos Gram negativos, no esporulados, com motilidade varivel, oxidase negativos, e que crescem em meios bsicos (caldo peptona), meios ricos (gar sangue, gar chocolate e CLED), meios seletivos (Mc Conkey, EMB). Outras caractersticas: so anaerbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem produo de gs, so catalase positivos, reduzem nitrato a nitrito. So divididos atravs de diferentes provas em 11 principais gneros, tendo sido descritos nos ltimos anos outros 16 gneros e algumas espcies, mas ainda consideradas de pouca ou nenhuma importncia clnica. 1.2. Importncia clnica: a) A maioria das enterobactrias encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal, na gua, solo e vegetais. b) Alguns tambm so considerados enteropatgenos por causarem preferencialmente infeces gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras salmonellas, Shigella spp, Yersinia enterocolitica e vrios sorotipos de Escherichia coli, embora possam tambm causar infeco em outros locais. c) As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importncia clnica isolados na rotina microbiolgica, d) so responsveis por de cerca de 70% das infeces urinrias e septicemias. 50% das

34 1.3. Infeces na comunidade e hospitalares a) Nas infeces da comunidade destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp, Proteus spp, Salmonella spp, Shigella spp. b) Nas infeces hospitalares as enterobactrias que atualmente predominam: Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp. Principais gneros das enterobactrias (cerca de 99% dos isolamentos de enterobactrias de importncia clnica): Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp, Proteus spp, Providencia spp, Morganella spp, Citrobacter spp, Salmonella spp, Shigella spp, Serratia spp. As enterobactrias menos isoladas so: Edwarsiella spp, Hafnia spp, Yersinia spp. Baseado em dados de prevalncia e importncia clnica, considera-se necessrio que os laboratrios de microbiologia utilizem metodologia que permita discriminar com 80% de acerto os gneros e espcies considerados abaixo:
- Escherichia coli - Shigella spp - Salmonella typhi - Salmonella spp - Citrobacter freundii - Proteus mirabilis - Citrobacter koseri - Klebsiella pneumoniae - Klebsiella oxytoca - Providencia spp - Serratia spp - Proteus vulgaris - Enterobacter aerogenes - Enterobacter cloacae - Enterobacter cloacae - Enterobacter agglomerans - Yersinia enterocolitica - Morganella morganii

Tabela 1 - Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica:

fermentao da glicose fermentao da lactose motilidade utilizao de citrato descarboxilao da lisina produo de sulfeto de hidrognio (H2S) produo de gs (CO2) oxidase produo de indol produo de urease produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase produo de gelatinase ou opo DNAse

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Tabela 2 - Provas complementares de Identificao
- fermentao de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. - utilizao de aminocidos: arginina e ornitina - hidrlise da Esculina, etc. - ONPG - utilizao de acetato - Provas teis mas pouco utilizadas: vermelho de metila, Voges-Proskauer, crescimento em KCN, tartarato de Jordan, lipase

Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie, baseado em alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao, custo, rapidez para leitura, etc. 2. TIPOS DE TESTES UTILIZADOS a) Podem ser utilizados testes preparados no laboratrio, desde que submetidos a controle de qualidade. b) Adquiridos no comrcio em testes isolados ou em kits acompanhados dos respectivos esquemas de identificao. c) Mtodos automatizados em geral utilizam estas mesmas provas e ampliam o nmero de testes podendo caracterizar com maior segurana e melhor poder de discriminao gneros e espcies no comuns. d) Mtodos rpidos em geral utilizam substratos cromognicos para deteco de enzimas produzidas pelas bactrias e que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao. Na rotina bacteriolgica, existem vrias alternativas e, com base em conjuntos ou sistemas simplificados de provas bioqumicas, possvel realizar a triagem e identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico. Desse modo, das enterobactrias isoladas de amostras clnicas, cerca de 90% podem ser perfeitamente identificadas atravs desses esquemas, podendo o resultado ser entregue dentro de um espao de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas.

36 2.1. Principais Meios Bioqumicos Utilizados na Rotina 2.1.1. Meio IAL (Instituto Adolfo Lutz) este meio foi elaborado para triagem de enterobactrias e consiste de 9 provas em apenas um tubo de ensaio, que consistem em: indol(tampa), fermentao da sacarose e glicose e produo de gs, fenilalanina, uria, H2S, Lisina, Motilidade. Baseado nestas provas possvel identificar as seguintes bactrias: E. coli, Shigella (indol positiva), Shigella (indol negativa), Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp (sacarose negativa), Enterobacter cloacae, Providencia spp (uria positiva) ou Morganella morganii, Providencia spp (uria negativa), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella spp, Salmonella typhi, Citrobacter freundii,

Serratia marcescens (necessita provas complementares), Vibrio cholerae, Vibrio spp, Bactrias no fermentadoras. a) Vantagens e limitaes O meio IAL tem a vantagem de ser prtico para inoculao e de baixo custo. Sua desvantagem a dificuldade de interpretao de tantas provas, exigindo muita experincia prvia com o meio. Este meio identifica os principais gneros de enterobactrias, indicando a presena de bactrias no fermentadoras e Vibrios. Para caracterizar corretamente as espcies de Enterobacter, gnero Serratia, gnero e espcies de Pseudomonas h necessidade de realizar provas complementares. Pelas limitaes do poder discriminatrio de gneros e espcies de enterobactrias no se recomenda este meio, como nica opo, na identificao de bactrias envolvidas em infeces hospitalares. Uma alternativa seria utilizar os resultados obtidos do meio IAL como triagem e adicionar o testes complementares, como Citrato e a fermentao da lactose verificada nocrescimento em gar Mc Conkey. b) Variantes do meio IAL : Tubo 1 - meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentao da glicose, gs, H 2 S, uria Tubo 2 MIO (Motilidade Indol Ornitina) Tubo 3 lisina

37 Tubo 4 citrato Tubo 5 rhamnose 2.1.2. Conjunto EPM / MiLi / Citrato - Trata-se praticamente da mesma combinao de reaes do meio IAL ou Rugai & Arajo (modificado por Pessoa & Silva),

separados em 2 tubos, passando a verificao do indol da tampa do IAL, para o meio MILi aps adio do reativo de Kovacs. a) Tubo EPM: fermentao da glicose, produo de gs, H2S, uria, fenilalanina inocular picando at o fundo e semear na superfcie, incubar com a tampa frouxa 24hs/35oC.

Tabela 3 Interpretao do Meio EPM Produo de gs Base Produo de H2S Hidrlise da Uria Superfcie Desaminao do Triptofano Formao de bolhas ou rachaduras no meio Presena de pigmento negro de qualquer intensidade Colorao azul esverdeada (fraca) na base indica prova positiva Reao positiva verde escuro ou acastanhado Reao negativa superfcie inalterada

b) Tubo MILi - Fazer picada central apenas incubar 24hs/35oC Motilidade bactrias mveis crescem alm da picada turvando o meio, enquanto as imveis crescem apenas na linha de picada. descarboxilao da lisina - lisina positivo o meio torna-se roxo, na prova negativa o meio permanece amarelado nos 2/3 inferiores. Aps a leitura da lisina adicionar 3 gotas de reativo de Kovacs para o teste de indol a formao de um anel rosa na superfcie do meio indica positividade para o indol. c) Citrato inocular a superfcie e incubar 24hs/35oC A prova positiva evidenciada pelo aparecimento de colorao azul na superfcie.

38 2.1.3. Meio Trplice Aucar Ferro (TSI) - Considerado o mais clssico dos sistemas de identificao, necessita de provas adicionais, mas tem a vantagem de ser de mais fcil interpretao. Abaixo ser descrito em detalhes e ser a base da identificao de enterobactrias. Acurcia da identificao - qualquer sistema de testes existentes no comercio, com leitura manual ou automatizada tem limitaes no nmero de provas e de discriminao dos diferentes gneros e espcies de enterobactrias, de modo que a maioria dos esquemas trabalha com um mximo de 80% de acerto. Os esquemas de identificao de enterobactrias podem utilizar uma ampla gama de recursos, variando desde nove reaes como meio IAL ou Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva, at dez testes propostos neste manual, ou sistemas como API 32E que pode identificar enterobactrias e alguns no fermentadores, utilizando 32 testes. importante destacar que nenhum sistema oferece 100% de acerto para a caracterizao das espcies de enterobactrias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura. A fonte de informao mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1991) contando com 47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para 28 diferentes gneros e 121 espcies de enterobactrias. Os principais gneros e espcies de importncia clnica podem ser caracterizados com >95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espcies dos gneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminao, sendo a identificao feita pelo maior percentual de probabilidade. necessrio destacar que padres no usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar atento para analisar cepas que possam ter importncia clnica e epidemiolgica ou encaminh-las a Laboratrios de Referncia. Antes, no entanto, deve certificar-se que a anlise no esta sendo feita com cultura mista de bactrias. O meio de TSI inclinado em bico de flauta, de cor vermelho cereja e deve ser inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC.

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Tabela 4 Provas do Meio de TSI

1. Prpura/amarelo ( pice prpura e base amarela) =fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos) 2. Amarelo/amarelo (pice e base amarelas)= fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 aucares) 3. Presena de gs (CO2) = bolhas ou meio fragmentado 4. H2S positivo= presena de precipitado negro

Tabela 5 - Interpretao do resultado das reaes encontradas no TSI

pice Vermelho Vermelho Amarelo Vermelho Amarelo Amarelo
Neg = negativo

Base Vermelho Vermelho Vermelho Amarelo Amarelo Amarelo

v= varivel

H2S Neg Neg Neg Neg Neg Pos

Gs Neg Neg Neg V V V

Interpretao mais provvel Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Enterobactria Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter

Obs. A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio acido (Ex: Salmonella typhi)

3. ETAPAS DA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS a. Anlise do crescimento nos meios ricos e seletivos A identificao de uma enterobactria comea com a anlise do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secrees: agar sangue e Mac Conkey Lquidos nobres e bipsias: Agar chocolate e Mac Conkey Fezes: Mac Conkey e SS.

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Urina: CLED ou agar sangue e Mac Conkey, etc. Devemos considerar que : A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (agar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: agar Mac Conkey e SS. Os Gram positivos como regra no crescem em agar Mac Conkey e SS, exceto os enterococos que podem crescer. No agar Mac Conkey e SS, alm das enterobactrias e dos enterococos, podem crescer bactrias no fermentadoras e Candida. Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela esta presente em todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros microrganismos no muito exigentes como no fermentadores, enterococos e Candida spp. Recomenda-se a seguir realizar: b. Gram da colnia isolada Recomenda-se sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativoe e leveduras). c. Prova da oxidase - indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que tambm so fermentadores. d. Prova do metabolismo fermentador - triagem utilizando os meios de OFglicose(quando suspeitar de no fermentador), TSI (Trplice Aucar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactrias. e. Srie bioqumica complementar sempre necessria para caracterizar gnero e espcie. O nmero de provas vai permitir maior ou menor discriminao(vide a seguir nvel de complexidade de provas).

As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos Gram negativos, fermentadores da glicose, com ou sem produo de gs, oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e que crescem bem no meio de Mc Conkey ou EMB. Como modelo de triagem na identificao bacteriana tem sido utilizado o meio de TSI (Triplice Aucar erro), que permite avaliar a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao de lactose e/ou sacarose e produo de H2S.

41 O TSI constitui o meio de identificao preliminar mais utilizado no mundo, sendo necessrio, no entanto, necessrio adicionar algumas provas, para completar a identificao e classificadas em dois nveis de complexidade: Nvel de complexidade 1: Motilidade, indol, lisina, uria, citrato, lactose (Mac Conkey), fenilalanina, DNAse e oxidase. Nvel de complexidade 2 - realizar as provas do nvel 1 mais: Ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato, esculina e PYR.

3.1. Descrio das Principais Provas Bioqumicas a) Motilidade / H2S / Indol - Semear por picada at o fundo, e incubar 24hs/35oC.

Motilidade - Para testar motilidade pode-se utilizar os meios de Motilidade/indol com resazurina; SIM (motilidade, indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina) Crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa Crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva H2S Produo de gs sulfdrico, verificado no TSI ou SIM H2S positivo = meio enegrecido H2S negativo = cor inalterada do meio Indol - Aps 24h de incubao, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfcie do meio presena de cor prpura = indol positivo cor do reagente = indol negativo

b) Uria de Christensen - inoculado apenas na superfcie e incubar 24h/35oC Urease positivo = cor vermelha (Proteus apresenta reao mais intensa) Urease negativo = mantm cor amarelada do meio

c) Citrato de Simmons - inocular na superfcie e incubar 24h/35oC Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio

42 Citrato negativo = cor verde (inalterado)

d) Fenilalanina - Inocular a superfcie do meio (inclinado) e Incubar 24h/35oC, aps crescimento pingar na superfcie 5 gotas do reagente cloreto frrico a 10% FA positivo = cor verde escuro na superfcie FA negativo = mantm a cor do meio inalterada 4. IDENTIFICAO DAS ENTEROBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA 4.1. - Consideraes a) valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio, para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral b) PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal #). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrncia)= 92%. c) Quando o PB baixo significa ter outro padro mais frequente. d) Os padres bioqumicos pouco freqentes, tero menor probabilidade de isolamento. e) No aplicado quando se considera gnero pois envolve vrias espcies com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp). f) Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (-) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas so lisina positivas; g) V = valores >20% e <80% de reaes positivas ou negativas;estas provas podem ser teis para diferenciar duas espcies ou dois gneros quando a reao s ocorre para uma delas. Ex.: uria em relao a E. coli e Citrobacter. E. coli negativa e Citrobacter varivel. Se a reao encontrada for positiva, exclui-se E. coli. h) Pela importncia clnica e epidemiolgica, padres no comuns de Yersinia e Salmonella spp foram considerados, pois na prtica a motilidade pode ser duvidosa e o H2S pode ser falso negativo.

43 i) As provas destacadas com fundo cinza tm a finalidade de facilitar a busca de provas-chave na diferenciao bacteriana. j) Recomenda-se de rotina utilizar as provas do nvel 1 que, para a maioria das

bactrias da rotina, permite uma caracterizao adequada. Quando houver necessidade usar as de nvel 2. Tabela 5 Identificao Bioqumica Simplificada das Principais Enterobactrias NVEL DE COMPLEXIDADE 1
5.1 - H2S (gs sulfdrico) positivo, Fenilalanina positivo #
Indol + Indol neg Proteus vulgaris Proteus mirabilis PB# 92% PB# 94%

5.2 - H2S negativo , Fenilalanina positivo #

Indol + Citrato + Citrato neg Indol neg Citrato neg Citrato v Uria v Uria + Uria + Uria neg Providencia spp Morganella morganii P. penneri Enterobacter spp PB# 88% PB#72% PB# 69% PB# <16%

5.3 - H2S positivo, Fenilalanina negativo #

a) Indol positivo # Bactrias / Provas Citrobacter freundii Edwarsiella tarda citrato 78%+ neg Motilidade 89%+ + urease v neg lisina neg + lac (MC) + neg PB# 25% 99%

Lac MC= lactose em Mc Conkey

b) Indol negativo #
Bactria/ Provas Salmonella spp S. typhi S. gallinarum/ S. pullorum C. freundii urease Neg Neg Neg V citrato + neg neg + lisina + + + Neg motilidade + + neg + gs + neg v + sorotipagem + + + Neg 97% 90% 52% PB#

44
5.4 - H2S negativo , FA negativo , Indol positivo, motilidade negativa #
Bactria/Provas Y. enterocolitica Shigella spp Klebsiella oxytoca E.coli inativa (rara)
1

citrato Neg Neg + Neg

urease 75%+ Neg + Neg

Lisina Neg Neg + V

0

lactose Neg Neg + 75%Neg

gs Neg Neg + Neg

sorotipagem + Yersinia +Shigella No Invasora

2

PB# 50% 50% 99% 80%

1 - positivo temperatura ambiente e negativa a 37 C 2 - em coprocultura testar p/ E. coli invasora

5.5 - H2S negativo , FA negativo , Indol positivo, Motilidade positiva #

Bactrias/Provas E. coli Citrobacter spp Aeromonas spp
1

citrato Neg + V

Urease Neg V Neg

lisina + Neg +

lactose + V Neg
2

gs + + v

PB# 97%

1 - oxidase positiva (verificar Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio)

Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas Dnase negativa 2 - Aeromonas caviae: lisina neg e lactose positiva

5.6 - H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa #

Provas / Bactrias Shigella spp (colnia pequena) Klebsiella pneumoniae
1

urease neg pos

2

citrato neg pos neg V

lisina neg pos neg neg

gs neg pos neg neg

lactose neg pos neg V

comentrio sorotipagem Colonia mucide sorotipagem 15% mot neg

PB# 50% 100% 50% 9,6%

Yersinia enterocolitica E. agglomerans

3

75%+ Neg

1- cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser uria negativas e
bioquimicamente pouco ativas (citrato V, lisina V), denominadas K.ozaenae e K.rhinoscleromatis 2 - motilidade(+) temperatura ambiente 3 - pode ocorrer falsa motilidade negativa em meio semi-solido e positiva em caldo

5.7- H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo #
Bact/Provas Hafnia alvei Salmonella choleraesuis Salmonella paratyphi A E. agglomerans lisina + + Neg Neg Lactose Neg Neg Neg V sorotipagem Negativa + + Negativa PB# 76% 37% 90% 25%

45

5.8 - H2S negativo , FA neg., Indol neg., Motilidade positiva, Citrato positivo #
a) DNAse /gelatinase negativos Provas/bactrias Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Salmonellla typhi lisina pos neg pos urease neg v neg Lactose Pos Pos Neg gs ++ ++ neg Sorotip. neg neg + PB# 95% 95% 12%

b) DNAse /gelatinase positivos= Serratia spp#

Provas/bactrias Serratia marcescens Serratia liquefaciens Serratia rubidae1
1 raramente isolada

lisina pos pos 55% Pos

urease 85% neg neg neg

Lactose Neg 90% neg Pos

gs 55% pos 75% pos 70% neg

pig. verm. V neg V

PB# 95% 76% 85%

Tabela 6 Identificao Bioqumica Simplificada das Principais Enterobactrias NVEL DE COMPLEXIDADE 2

6.1- H2S positivo, Fenilalanina positivo #
Indol positivos# Bactrias / Provas Proteus vulgaris Morganella morganii Indol negativos # Proteus mirabilis Proteus penneri ornitina + neg Citrato V (65%+) Neg PB# 94% 30% ornitina neg + Sacarose + Neg PB# 92% 20%

6.2- H2S negativo, Fenilalanina positivo

a) Indol negativo Bactria / Provas Proteus penneri Morganella morganii Enterobacter agglomerans Enterobacter sakazaki b) Indol positivo Bactria / Provas Morganella morganii Providencia spp citrato neg + urease + + neg neg citrato neg neg + + Sacarose + neg 75%+ + ornitina neg + neg +

46
6.3 - H2S positivo, Fenilalanina negativo
a) Indol positivo Bactria / Provas Citrobacter freundii Edwarsiella tarda citrato 78% + neg urease 44% + neg Lisina Neg + ornitina neg + lactose 78 %+ neg sacaros e 89%+ neg

b) Indol negativo
Bactrias/ Provas Salmonella spp S. typhi S. choleraesuis S. paratyphi A S. gallinarum S. pullorum Outras Salmonellas C. freundii Uria neg neg neg neg neg neg neg 44+ Citrato Lisina Ornitina + neg 25%+ neg neg neg + 78%+ + + + neg + + + neg + neg + + neg + + neg Motilidade + + + + Neg Neg + 89%+ arabinos e + neg neg + + + + + Gs + neg + + neg + + 89% + Sorotip. + + + + + + + neg

Triagem rpida para principais bactrias H2S+

Bactria/prova Salmonella spp Citrobacter spp Proteus spp PYR neg + neg Fenilalanina neg neg +

6.4 - H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol positivo, Motilidade negativa

Bactria / Provas Y. enterocolitica Shigella spp Klebsiella oxytoca E. coli inativa (rara) citrato neg neg + neg urease 75% + neg + neg lisina Neg neg + 40%+ ornitina + neg neg 20%+ lactose neg neg + 25%+ gs neg neg ++ Neg sorotip. + + NI Invasora2 PB# 50% 50% 99% 80%

1- positiva temperatura ambiente e negativa a 37C 2- em coprocultura testar p/ E.coli invasora

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6.5 - H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol positivo, motilidade positiva #
Bactrias / Provas E. coli C. diversus (koseri)
1 1

citrato neg + + neg 50%+ V

urease neg 75%+ 85%+ 75%+ 20%+ neg

lisina 90%+ neg neg neg neg +

4

ornitina 65 + + + + neg +

lactose + 50%+ 35%+ neg 40%+ neg

gs + + + neg 20%+ v

PB# 97% 97% 97%

Citrobacter amalonaticus Yersinia enterocolitica

3 2

Enterobacter agglomerans Aeromonas spp

16%

1 - C. koseri = malonato+, C. amalonaticus= malonato negativo o 2 - motilidade negativa a 35 C e positiva temperatura ambiente 3 - oxidase positiva: Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas shigelloides Dnase negativa 4 - Aeromonas caviae lisina negativa e lactose positiva

6.6 - H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol negativo, Motilidade negativa #

Provas / bactrias Shigella spp (colnia pequena) Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp
1

urease citrato

lisina

gs

lactose

comentrio Sorotipagem positiva Colnia Mucide Mucide 11% motilidade negativa Sorotipagem positiva 15% motilidade negativa

PB# >50% 100%

neg + neg V 75%+ neg

neg + V 78%+ neg V

neg + V neg neg neg

neg + V + neg neg

neg + V 78%+ neg V

Citrobacter freundii Yersinia enterocoltica 2 E. agglomerans

3

16% 50% 9,6%

1- cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser uria negativas e
bioquimicamente pouco ativas (citrato V, lisina V), denominadas K.ozaenae e K.rhinoscleromatis 2 - motilidade(+) temperatura ambiente 3 - pode ocorrer falsa motilidade (negativa em meio semi-slido e positiva em caldo)

6.7 - H2S negativo, Fenilalanina neg, Indol negativo, Motilidade +, Citrato neg#
Bactria / Provas Hafnia alvei Salmonella typhi Y. enterocolitica S. choleraesuis S. paratyphi A E. agglomerans
1 2

Lisina + + neg + neg neg

Ornitina + neg + + + neg

Lactose Urease neg neg neg neg neg 40%+ Neg Neg 75%+ Neg Neg 20%+

Arabinos e + neg + neg + +

o

Sorologia neg + + + + neg

o

PB# 76%

25%

1- H2S pode ser positivo no TSI com 48h

2- motilidade negativa a 35 C e positiva a 25 C

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6.8 a - H2S negativo, FA negativo, Indol neg., Motilidade negativa, Citrato positivo #
Dnase e Gelatina negativos Bactrias/ Provas C. freundii E. aerogenes E.cloacae E. agglomerans E. gergoviae E. sakazakii Uria 44%+ 2%+ 65%+ 20%+ 93%+ 1%+ Fenil Lisina Arginina Ornitina Malonato 0 0 0 20%+ 0 50%+ 0 98%+ 0 0 90%+ 0 67%+ 0 97%+ 0 0 99%+ 0 98%+ 96%+ 0 100%+ 91%+ 11%+ 95%+ 75%+ 65%+ 96 18 Gs 89%+ 100%+ 100%+ 20%+ 98%+ 98%+ Lactose Esculina 78%+ 95%+ 93%+ 40%+ 55%+ 99%+ 0 98%+ 30%+ 60%+ 97%+ 100%+

6.8 b verso simplificada para interpretao das provas da tabela 8a

Lisina negativa Ornitina negativa Citrobacter freundii E.agglomerans Ornitina positiva Enterobacter cloacae Enterobacter sakazaki Lisina positiva E. aerogenes Enterobacter gergoviae urease neg urease pos Lactose positivo Lactose varivel urease 65%+ urease neg FA neg FA50%+ Malonato 75% + Malonato 18% + esculina 30% + esculina + Gas + Esculina neg Esculina v

Arginina v Arginina neg

Gs neg

+ comum raro

6.9 - H2S neg., Fenilalanina neg., Indol neg., Motilidade positivo, Citrato positivo #
Dnase e Gelatina (positivas) Bactrias / Provas Serratia marcescens S. marcescens biog Serratia liquefaciens Serratia rubidae
1

Lisina 99% + 55% + 95% + 55% +

Ornitina 99% + 65% + 95% + neg

L-arabinose Malonato Neg Neg Pos Pos neg neg neg pos

Motilidade Pos Neg Pos Pos

Lactose Neg Neg Neg pos

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Tabela 7a - Caracterizao geral das principais enterobactrias de importncia clnica (%)
Bactrias\provas
Citrobacter freundii Citrobacter diversus (koseri) Citrobacter amalonaticus Edwarsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio ! Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica

Indol
33 99 100 99 0 0 20 0 11 98 80 45 50 25 0 0 0 99 0 0 95 2 98 0 99 98 99 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 50

Citrato
78 99 95 1 95 100 50 99 99 1 1 0 0 0 0 10 98 95 30 0 0 65 15 0 95 93 98 95 0 25 0 0 0 90 98 30 90 95 0

H2S
78 0 5 100 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 98 95 30 0 0 0 95 97 50 10 100 90 100 0 0 0 0 0

Uria
44 75 85 0 2 65 20 93 1 1 1 0 0 0 0 4 95 90 10 0 95 98 95 100 98 30 0 1 0 0 0 0 0 0 15 0 3 2 75

Fenilala
0 0 0 0 0 0 20 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 95 98 99 99 98 95 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Lisina
0 0 0 100 98 0 0 90 0 90 40 0 0 0 0 100 98 99 40 0 v 0 0 0 0 0 0 98 98 95 0 90 100 99 99 55 95 55 0

Arginina Ornitina
67 80 85 0 0 97 0 0 99 17 3 2 5 18 2 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 70 3 55 15 10 10 70 0 4 0 0 0 0 99 95 100 98 96 0 100 91 65 20 0 0 2 98 98 0 0 3 0 95 99 0 0 0 0 0 97 0 100 95 1 95 99 99 65 95 0 95

Motil.
89 95 95 98 97 95 85 90 96 95 5 0 0 0 0 85 0 0 0 0 v 95 95 85 94 85 96 95 97 95 95 0 0 99 97 17 95 85 2

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Tabela 7a - Caracterizao geral das principais enterobactrias de importncia clnica (%)
Bacterias\provas Citrobacter freundii Citrobacter diversus (koseri) Citrobacter amalonaticus Edwarsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio ! Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica gelatina 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 91 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 90 30 90 90 0 Malonato 11 95 1 0 95 75 65 96 18 0 0 0 0 0 0 50 93 98 3 95 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V 3 0 2 94 0 Gs glicose 89 98 97 100 100 100 20 98 98 95 5 0 3 0 0 98 97 97 50 0 90 96 85 45 10 0 85 96 0 95 99 0 90 100 55 0 75 30 5 lactose 78 50 35 0 95 93 40 55 99 95 25 0 1 1 2 5 98 100 30 0 1 2 2 1 5 2 0 1 1 0 0 0 0 v 2 4 10 100 5 sacarose 89 40 9 0 100 97 75 98 100 50 15 0 1 0 1 10 99 100 20 75 0 15 97 100 15 50 15 1 0 0 0 0 0 1 99 100 98 99 95 esculina 0 1 5 0 98 30 60 97 100 35 5 0 0 0 0 7 99 100 80 30 0 0 50 0 35 0 0 5 0 0 0 0 0 0 ou 15 95 96 97 94 25 DNAse 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 80 40 0 10 0 2 0 0 0 10 0 1 98 82 85 99 5

51 5. IDENTIFICAO SOROLGICA Dentro da famlia Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de amostras bacterianas bioquimicamente, homogneas e, sorologicamente, relacionadas, que constituem os gneros e, segundo alguns critrios, podem dividir-se em espcies. As amostras relacionadas bioquimicamente so divididas em subgrupos ou tipos, por critrio sorolgico, de acordo com a presena dos antgenos somtico (O), flagelar (H) e de envoltrio ou cpsula (K). Desse modo, os sorotipos so divises baseadas no relacionamento antignico, enquanto os biotipos so amostras do mesmo sorotipo que diferem em caractersticas bioqumicas. Em atividades de rotina de Bacteriologia Clnica, a identificao ou confirmao sorolgica feita apenas com germes comprovadamente patognicos e de importncia epidemiolgica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli

Yersina enterocolitica e mesmo assim utilizando-se esquemas simplificados, atravs do seguinte procedimento tcnico: a) Preparar uma suspenso bastante densa (aspecto leitoso), da bactria a ser testada, utilizando-se soluo salina a 0,85%. A massa bacteriana proveniente do Agar TSI usado na identificao bioqumica ou, de preferncia, em agar nutriente inclinado aps repique para obteno de massa de germes. Coloca-se a salina sobre o crescimento bacteriano ocorrido na superfcie inclinada do meio, e aps alguns minutos, agitar o tubo de modo a obter a suspenso bacteriana. Bactrias em fase rugosa tendem a se auto aglutinar, e no devem ser utilizadas na classificao sorolgica. b) Sobre uma lmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspenso bacteriana a ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura bastante homognea continuando o movimento durante um ou no mximo dois minutos. O aparecimento de aglutinao, nesse intervalo de tempo, indica positividade da reao. c) Algumas vezes, necessrio o aquecimento da suspenso bacteriana em banhomaria fervente, durante 15 minutos, com finalidade de eliminar estruturas mais externas da clula que tm ao interferente na reao. Aps resfriamento da suspenso repetese o teste. Caso ocorra a aglutinao, confirma-se a prova.

52 5.1 Identificao de Salmonella: No gnero Salmonella existe uma grande quantidade de sorotipos, que no so mais considerados como espcies, e sua identificao sorolgica completa e detalhada uma tarefa restrita aos denominados Laboratrios de Referncia. Para identificao rotineira no laboratrio clnico, utiliza-se basicamente trs antisoros: a) Anti-Salmonella polivalente somtico (Grupos A,B,C,D,E) b) Anti-Salmonella somtico, Grupo D (S. typhi) c) Anti-Salmonella, anti Vi Quando o denominado antgeno de virulncia (Vi) est presente, poder bloquear a aglutinao do antgeno somtico do grupo D (Salmonella typhi). Desse modo, a suspenso dever ser aquecida em banho-maria fervente e testada novamente com os trs anti-soros citados, dando o resultado abaixo no caso de Salmonella typhi. A partir de uma reao positiva feita apenas com o antgeno somtico polivalente, existe condio de confirmar a amostra como sendo do gnero Salmonella, sem especificar o sorotipo ou sorovar.

Antisoros Anti-soro poli somtico Grupo D somtico Anti Vi

Antgeno vivo + +

Antgeno aquecido + + -

Aps a identificao bioqumica e aglutinao com soro polivalente, as amostras podero ser testadas com os soros A,B,C,D,E monovalentes. A bactria pertencer ao sorogrupo em cujo soro houver aglutinao. Se a reao for negativa deve-se aquecer a metade da suspenso em banho-maria fervente e repetir o teste. A metade no aquecida dever ser utilizada para determinao de antgenos flagelares. A identificao at sorotipos poder ser feita com auxlio dos soros flagelares (a,b,c,d,i,1,2,5), e atravs de sua utilizao possvel identificar as seguintes amostras:

53
Grupo Sorolgico Grupo O2 (A) Grupo O4 (B) Grupo O7 (C1) GrupoO5 (D1) Espcie Bacteriana Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B e S. typhimurium Salmonella paratyphi C e S. cholerae suis Salmonella typhi

5.2 Identificao de Shigella: O gnero Shigella est constitudo de apenas quatro sorogrupos, que so identificados sorologicamente, de maneira simplificada, com a utilizao de anti-soros polivalentes. Excepcionalmente, utiliza-se apenas o antisoro monovalente de Shigella dysenteriae tipo 1 (bacilo de Shiga), por ser o mais patognico.

Grupo Sorolgico - Grupo A - Grupo B - Grupo C - Grupo D

Espcie Bacteriana Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei

Sorotipos 13 sorotipos 06 sorotipos 18 sorotipos 01 sorotipo

As culturas suspeitas devero ser testadas, primeiro com os soros contra Shigella flexneri e Shigella sonnei, que representam mais de 95% das amostras de Shigella isoladas em nosso meio. Caso no haja aglutinao, prosseguir com os outros soros. No ocorrendo aglutinao, possvel que a cultura seja rica em antgenos de superfcie que geralmente impedem o contato do soro com o antgeno somtico O. Estes antgenos devem ser destrudos pelo aquecimento da suspenso bacteriana por 15 minutos em banho-maria fervente, procedimento que pode ser adotado como de rotina na sorologia desse gnero.

5.3 Identificao de Escherichia coli: As amostras de Escherichia coli que causam diarria pertencem a trs grupos principais: Enteropatognicas (EPEC), Enterotoxignicas (ETEC) e Enteroinvasoras (EIEC). No existe nenhuma prova bioqumica que possa, seguramente, distingu-las entre si ou de outros tipos de E. coli pertencentes flora normal do intestino. As

54 amostras EPEC e EIEC so identificadas por provas de sorotipificao rotineira, enquanto as amostras ETEC so identificadas apenas mediante provas especiais de produo de toxinas, realizadas somente em laboratrios de referncia ou de pesquisa.
Soro Anti E. coli Enteropatognica Clssica (EPEC) - Polivalente A: anti 026, 055, 0111, 0119 - Polivalente B: anti 0114, 0125, 0142,0158 - Polivalente C: anti 086, 0126, 0127, 0128

A sorotipificao pode ser feita, utilizando-se a mesma tcnica descrita para outras enterobactrias. Um melhor resultado obtido, repicando-se cerca de cinco colnias caractersticas a partir do Agar BEM ou Mc Conkey, para um tubo contendo Agar Nutriente Inclinado, com finalidade de obter massa de germes. feita ento uma suspenso bacteriana em soluo salina, a qual ser testada utilizando-se anti-soros polivalentes, abrangendo os sorotipos mais prevalentes na populao.
Soro Anti E. coli Enteroinvasora (EIEC) - Polivalente A: anti 028ac, 029, 0136, 0144, 0152 Polivalente B: anti 0112ac, 0124, 0143, 0164, 0167 Soro Anti E. coli O 157 (EHEC) utilizar o soro para O157:H7.

Observaes importantes: 1. Bactrias isoladas com o mesmo padro de provas de materiais nobres em surtos de infeco hospitalar ou isoladas de infeces da comunidade que possam suspeitar de um surto, ou pela gravidade da doena, ou por um padro no esperado de resistncia, devem ser remetidas ao Laboratrio de Referncia (LACEN/Adolfo Lutz) para melhor caracterizao. 2. Bactrias que no se enquadram nos padres definidos acima, recorrer a testes suplementares como os descritos abaixo ou usar kits com maior nmero de provas ou em caso de importncia clnica (descritos acima) enviar a Laboratrio de Referncia.

55

56 6. REFERENCIAS : 1. BARON, E.J., FINEGOLD, S.M. - Bailey and Scotts. Diagnostic Microbiology. 8th Ed. St. Louis, Mosby,1990. 2. CHRISTENSEN, W.B. - Ureia decomposition as means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. J. Bacteriol, 52: 461-466, 1946. 3. FARMER III, J.J., KELLY, M.T. - Enterobacteriaceae. IN: Balows A.; Hausler, W.J. Jr.; Herrmann, K.L.; Isenberg, H.D. & Shadomy, H.J.(Eds.) Manual of Clinical Microbiology. 5th Ed. ASM. Washington, D.C.,1991. 4. FORBES, B.A., SAHM, D.F., WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 10th Ed. St.Louis. Mosby, 1998. 5. KONEMAN, E.W., ALEN, S.D., JANDA, W.M., SCHRENKENBERGER, P.C., WINN Jr., W.C. Diagnostic Microbiology Color Atlas and Textbook. 5th Ed. Lippincott, 1997. 6. Mc FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. Ed. William & Wilkins Co., 1980. 7. MURRAY, P. R. et al. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology 7th ed. Washington DC.1999. 8. OPLUSTIL, C.P., ZOCCOLI, C.M., TOBOUTI, N.R., SINTO, S.I. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica, Sarvier, 2000 So Paulo Brasil,254p. 9. RHODEN, R.A., HERMANN, G.J. Isolation and identification of Enterobacteriaceae in the clinical laboratory. U.S. DHEW. Center for Disease Control. Atlanta Ga., 1974. 10. SACK, R.B., TILTON, R.C., WEISFELD, A.S. CUMITECH 12. Laboratory diagnosis of bacterial diarrhea. Coord. Ed. S.J. Rubin. American Society for Microbiology. Washington, D.C., 1980. 11. TOLEDO. M.R.F., FONTES, C.F.,TRABULSI, L.R. EPM Modificao DO MEIO DE Rugai e Arajo para a realizao simultnea dos testes de produo de gs a partir da glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol. 13(04): 309 315, 1982. 12. TOLEDO. M.R.F., FONTES, C.F.,TRABULSI, L.R. MILi Um meio para a realizao dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol. 13(04): 230 - 235, 1982.

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Captulo 5 - BASTONETES NO FERMENTADORES

1. INTRODUO: Os bacilos Gram negativos classificados como no fermentadores (BNFs) so microrganismos aerbios, no esporulados, que se caracterizam pelo fato de serem incapazes de utilizar carbohidratos como fonte de energia atravs de fermentao, degradando-os pela via oxidativa. A identificao dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratrios de rotina em microbiologia, considerando que a maioria deles no realiza este tipo de identificao, ou o faz de maneira elementar em virtude da pouca incidncia em amostras ambulatoriais, assim como pela complexidade e elevado custo dos esquemas completos de identificao. A caracterizao deste grupo de bactrias de grande importncia nos casos de infeco hospitalar. Embora a sua incidncia, mesmo em hospitais, seja pequena quando comparada a outros agentes etiolgicos, geralmente, eles apresentam resistncia elevada a vrios antibiticos e so capazes de causar infeces graves. Estas bactrias colonizam e causam infeces, em especial, em pacientes graves oriundos de CTI e submetidos procedimentos

invasivos, da a importncia de classific-los at o nvel de gnero e espcie. O nmero de bactrias no fermentadoras conhecidas muito grande; foram selecionadas aquelas consideradas na atualidade de maior importncia clnica (*) e as demais para diagnstico diferencial entre si. Quadro 1 - BNFs de importncia clnica consideradas neste captulo*:
Acinetobacter spp* Achromobacter spp Burkholderia cepacia* Methylobacterium spp Pseudomonas aeruginosa* P. luteola P. putida Ps pseudomallei* Stenotrophomonas spp* Sphingobacterium spp Alcaligenes spp * Bordetella bronchyseptica Chryseobacterium (Flavobacterium) spp* Moraxella spp* P. fluorescens P. oryzihabitans Pseudomonas stutzeri Roseomonas spp Shewanella spp Sphingomonas paucimobilis

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Quadro 2 - Testes necessrios para a identificao de rotina dos BNFs

tubo de OFGlicose (com vaselina) tubo de OFGlicose (sem vaselina) tubo com lisina tubo controle de aminocidos tubo agar citrato tubo agar uria tubo com agar esculina tubo com TSI tubo com gelatina tubo com caldo NaCl6,5% disco de oxidase disco de PYR tubo com arginina caldo TSB para motilidade em lmina caldo TSB crescimento 42oC tubo de caldo indol disco de polimixina placa de Mac Conkey placa de DNAse

1.1. SEMEADURA DOS TESTES DE IDENTIFICAO: a partir de colnias isoladas em cultura pura com 24 horas de crescimento, nos meios de inoculao primria, proceder a realizao das tcnicas de identificao e diferenciao dos BNFs: a) disco de oxidase - com ala retirar 2-3 colnias e esfregar sobre a fita ou disco teste (pode-se umedecer o papel com 1 gota de salina estril) b) tubo de OF Glicose (com vaselina) - picar com agulha at o fundo do tubo c) tubo de OF Glicose (sem vaselina) - picar com agulha at o fundo do tubo d) tubo com pedao de filme com gelatina - inocular 2-3 colnias na salina e deixar o fragmento imerso e) placa de DNAse - semear 2 a 3 colnias em spot (crculo de 1 cm de dimetro) f) tubo com lisina - usar inculo denso e pode-se adicionar 2 ml de vaselina lquida g) tubo com arginina - usar inculo denso (igual lisina) h) tubo controle de aminocidos - (igual lisina) i) uria - semear com agulha inculo denso na superfcie do meio j) citrato - semear com agulha na superfcie do meio k) caldo TSB crescimento 42oC - semear 2 colnias no caldo

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l) caldo TSB motilidade - semear 2 colnias no caldo m) tubo com caldo NaCl 6,5% - semear 2 a 3 colnias no caldo n) tubo com agar esculina - semear 2 a 3 colnias na superfcie do meio o) tubo de caldo indol - inocular 2 colnias no caldo p) disco de polimixina - fazer antibiograma em Mueller Hinton e colocar o disco q) disco de PYR - colocar o disco sobre colnias de crescimento recente ou fazer suspenso densa e depositar 3 a 4 gotas sobre o disco de PYR e incubar durante 4 horas numa placa vazia com umidade. r) placa de Mac Conkey - semear com ala 1 colnia isolada s) TSI - Semear com agulha picando at o fundo do tubo e na superfcie do agar inclinado.

1.2. a)

LEITURA E INTERPRETAO DAS PROVAS: disco de oxidase - a leitura feita em 15 a 20 segundos. A cor violeta forte aparece rapidamente. Aps este intervalo, cores violeta plido so falso positivos. A Burkholderia cepacia pode dar reao fraca.

b)

tubo de OF Glicose (com vaselina) / tubo de OF Glicose (sem vaselina): - OF Glicose Fermentador - dois tubos ficam amarelos (cido) - OF Glicose Oxidativo - tubo sem vaselina amarelo, tubo com vaselina verde - OF Glicose inerte ou alcalino - dois tubos no mudam de cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado (alcalino). Aguardar, no mnimo, 72h para definir como inerte pois pode ocorre a oxidao tardia ou lenta.

c)

tubo com gelatina - incubar 30oC, se negativo aguardar no mnimo 72h. Se positivo ocorre precipitado cinza no fundo do tubo.

d)

placa de DNAse - adicionar cido clordrico e aguardar 5 minutos. Observar a presena de halo transparente em volta do inoculo positivo enquanto o restante do meio fica leitoso. Se negativo repetir o teste com leitura em 72h.

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e)

tubo com lisina / tubo com arginina / tubo controle de aminocidos - comparar os tubos testes dos aminocidos com o controle negativo. O tubo controle negativo deve ficar azul esverdeado plido e as provas positivas ficam de cor prpura. Se negativo aguardar at 5 dias.

f) g)

disco de polimixina - qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade tubo agar uria - a cor rosa forte aparece em todo o meio aps 24 a 72 h de incubao, ligeira mudana de cor rsea no pice, que no progride com maior tempo de incubao, considerado negativo. Bordetella bronchiseptica pode dar reao positiva em 4 h.

h)

tubo agar citrato - a cor azul forte aparece no pico, e com maior incubao extende-se a todo o meio.

i)

caldo TSB crescimento 42oC - ocorre turbidez no meio ou ntido o aumento da densidade bacteriana. Ideal comparar com controle mantido a temperatura ambiente.

j)

caldo TSB para motilidade - agitar o tubo e com uma pipeta com ponteira estril ou ala bacteriolgica estril retirar uma gota e depositar sobre uma lmina. Cobrir a gota com uma lamnula e levar ao microscpio. Observar com aumento de 400 vezes (ocular 10x e objetiva 40). A presena de bactrias cruzando o campo em diferentes direes significativo de motilidade positiva. Movimentos vibratrios fracos = negativo (movimento browniano). Quando o movimento de todas as bactrias numa mesma direo, provavelmente o movimento do lquido entre a lmina e a lamnula. Verificar a motilidade em temperaturas de 37oC e 20oC (ambiente).

k)

tubo com caldo NaCl 6,5% - a presena de turbidez e mudana de cor indicam crescimento.

l)

tubo com agar esculina - ocorre precipitado negro intenso nas provas positivas a partir de 6 horas de incubao at 48 h. Cor castanho escuro prova negativa.

m) tubo de caldo indol - colocar 5 gotas de xilol e agitar vigorosamente o tubo. Adicionar 5 gotas do reagente de Erlich ou Kovacs. Observar a presena de anel prpura plido ou intenso que revelam prova positiva.

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n)

disco de PYR colocar o disco teste em contato com o crescimento bacteriano, em seguida coloc-lo sobre uma lmina e depositar uma gota do reagente que acompanha o teste. A presena de cor alaranjada prova positiva. Mantendo a cor amarela prova negativa. Recomenda-se testar controles positivo e negativo.

o) p)

placa de Mac Conkey - crescimento deve ocorrer entre 1 a 3 dias. TSI - Verificar padro fermentador (presena de cor amarela apenas na base ou no pice e na base), com ou sem H2S e gs (precipitado preto e bolhas). No fermentador permanece vermelho (alcalino) no pice e na base.

2. PROCEDIMENTOS PARA A IDENTIFICAO: No caso de isolar uma bactria que no foi ainda comprovada como no fermentadora da glicose seguir as seguintes etapas, com a colnia isolada: Gram, Oxidase. Observar se h pigmento da colnia crescida (amarelo, rseo, cor metlica).

2.1. RESULTADO DO GRAM E OXIDASE: a) Gram Positivo: procurar a identificao de cocos e bacilos Gram positivos b) Gram negativo: - Coco Gram negativo, oxidase positivo, identificar como Neisseria spp ou seguir para a Tabela 3.2. - Coco Gram negativo, oxidase negativo, seguir para Tabela 3.1 c) Bacilo Gram negativo, oxidase negativo, semear: - TSI, MILi, Fenilalanina, Citrato, Uria (ou EPM MILi ou IAL) - OF glicose e Caldo motilidade seguir 2.2.1 d) Bacilo Gram negativo, oxidase positivo, semear: - OF Glicose e Caldo motilidade seguir 2.2.2

60

2.2. 2.2.1.

RESULTADO DO OF: -bacilo (cocobacilo) Gram negativo oxidase negativo

a) OF Glicose fermentador - fazer a identificao com as provas realizadas visto ser uma enterobactria. Vide captulo enterobactrias para interpretao dos resultados. b) OF no fermentador: motilidade negativa: Tabela 3.1 motilidade positiva: Tabela 3.3 2.2.2. Bacilo Gram negativo oxidase positiva:

OF Glicose fermentador - pesquisar Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio OF Glicose no fermentador: se pigmento rosa segue Tabela 3.7 - motilidade negativa e pigmento amarelo, segue Tabela 3.4 - motilidade positiva:se TSI com H2S segue Tabela 3.5 a e 3.5 b se OF glicose Oxidativo segue Tabela 3.5 se OF glicose Inerte segue Tabela 3.6 3. TABELAS DE IDENTIFICAO DOS BNFS
Tabela 3.1a - Coco-bacilos ou cocos Gram negativo, oxidase neg. e motilidade neg.
Microrganismos A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus A. lwoffii OF glicose O O I /O I Cresc. 42C Citrato Gelatina neg neg

+
neg neg neg
neg = negativo

+ + +
neg
pos + positivo

+
Neg

Legenda: I = inerte O = oxidativo

Tabela 3.1b - Prova opcional

Microrganismos A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus A. lwoffii
*hemlise em agar sangue

Hemlise* neg neg pos neg

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Tabela 3.2 - Cocos Gram negativo, oxidase positivo, motilidade neg., OF-Gli Inerte
Microrganismos / Provas Moraxella(B). catarrhalis Moraxella canis M. fenilpiruvica/ureolytica Moraxella lacunata Moraxella spp* Urease Neg Neg Pos Neg Neg Gelatina Neg Neg Neg Pos Neg Dnase Pos Pos Neg Neg Neg MacConkey Neg Pos Pos Neg Var

Moraxella spp: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis

Tabela 3.3 - Bacilos Gram negativo, oxidase negativa, motilidade positiva, OFGli Oxidativo ou Inerte
Microrganismos / Provas Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans B. cepacia S. maltophilia
* Fazer antibiograma com polimixina

Arginina Pos Neg (14+) Neg Neg

Dnase Neg Neg Neg Pos

Lisina Neg Neg 80%+ 93%+

Polimixina * S S R S

Provas opcionais
Microrganismos / Provas Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans B. cepacia S. maltophilia
* Fazer antibiograma com imipenem

Esculina Pos Neg Var Var

PYR Neg Neg Pos pos

Imipenem* S S Var R

Tabela 3.4 - Oxidase positiva, Motilidade negativa e OFG Oxidativo, Bacilos c/ pigmento amarelo e Crescimento em MC varivel
Microrganismos / Provas Chryseobacterium meningosepticum C. indologenes Sphingomonas paucimobilis Indol Pos Pos Neg Dnase Pos Neg Neg Polimixina R R S Uria Neg Neg Neg

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Sphingobacterium spp*
*S. multivorum, S. spiritivorum

Neg

Varivel

Pos

Tabela 3.5a - Bacilos Gram negativo, oxidase positiva, motilidade positiva, OF GLI Oxidativo - vide fluxograma para facilitar interpretao
Microrganismos A. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri B. pseudomallei B. cepacia S. paucimobilis* Shewanella spp POL S S S S S R R S S LIS Neg Neg Neg Neg Neg Neg 80%+ Neg Neg ARG Neg pos pos pos Neg pos Neg Neg Neg V Pos NaCl 6,5% Neg GEL Neg 82 Pos Neg Neg +79% 20%+ Pos V 42C Pos (86) Pos Neg Neg v pos 83%+ Neg v Pigm.Amarelo Seca Pigmento Caracterstica

* Mot += Temperatura ambiente

Provas complementares 1, 2
Microrganismos A. x. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri B. pseudomallei B. cepacia Sphingomonas paucimobilis Shewanella spp Esculina* Neg neg Neg Neg neg V V pos neg PYR* Pos V V Neg Neg Neg Neg 25+ Pos

Provas da esculina e PYR teis apenas para diferenciar as bactrias lisina e arginina negativas

Tabela 3.5.b - Bacilos Gram negativos no fermentadores oxidase positiva, motilidade positiva, com H2S no TSI, OF Glicose Varivel, DNAse positivos
Bactria/prova Shewanella putrefaciens Shewanella alga Cresc. 42oC Neg Pos Cresc NaCl 6,5% Neg Pos

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FLUXOGRAMA AUXILIAR PARA TABELA 5

Lisina

positiva

Burkholderia cepacia
Polimixina R

negativa

negativa

Arginina

positiva

polimixina

polimixina

S crescimento a 42oC

B. cepacia
positivo

esculina

B. pseudomallei

negativo

positivo

negativo

S. paucimobilis

NaCl 6,5%

P. aeruginosa Gelatina

negativo

positivo

negativo

positivo

DNAse

P.stutzeri
negativo

P. putida

P. fluorescens

positivo

S. putrefaciens

Achr. Xylosoxidans

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Tabela 3.6 - Bacilos oxidase (+), Motilidade (+) OFG Alcalino - incubar 72h.
Microrganismos A x. denitrificans Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica S. malthophilia *
*raramente pode ser oxidase +

Uria Varivel Neg Pos++ Neg

NaCl 6,5% Neg Pos Neg 78%neg

DNAse neg Neg Neg Pos

Prova complementar 2
Microrganismos A. denitrificans Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica S. malthophilia PYR positivo negativo negativo negativo

Tabela 3.7- Bacilos e coco-bacilos Gram negativos, No fermentadores, oxidase positiva, OF glicose varivel, com pigmento rseo(1)
Microrganismos Methylobacterium spp Roseomonas spp Motil. pos Var Morfologia B CB Urease Pos Pos Mc Conkey Neg Pos 42 C neg pos
o

Observao colnia seca coral colnias mucides rosadas

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4. TABELA GERAL DE CONSULTA PARA IDENTIFICAO DE NO FERMENTADORES Tabela 4.1 - Oxidase e motilidade negativos
Microrganismos A. baumannii A. calcoaceticus A. haemolyticus A. lwoffii Acinetobacter spp OXI Neg Neg Neg Neg Neg MOT Neg Neg Neg Neg Neg M C C C C C OF G O O I/O I I/O 42C Pos Neg Neg Neg Neg CIT Pos Pos Pos Neg Pos MALO Pos Pos Neg Neg Var GEL Neg Neg Pos Neg Var HEM Neg Neg Pos Neg Var

Tabela 4.2 - Oxidase negativo e motilidade positiva

Microrganismos P. luteola P.oryzihabitans S. maltophilia B. cepacia OXI Neg Neg Neg MOT Pos Pos Pos M B B B B OF g O O 85%O O IMP S S R S ESC Pos Neg 39%+ 63%+ Dnas e Neg Neg Pos Neg LIS Neg Neg Pos 80%+ ARG Pos 14%+ neg neg MC Pos Pos Pos Pos 42oC 94%+ 33%+ 48%+ 83%+

14%neg pos

Tabela 4.3 - Oxidase positiva e motilidade negativa OFG oxidativo

Microrganismos C. meningosepticum C. indologenes S. paucimobilis* Sphingobacterium spp OXI Pos pos pos pos MOT Neg neg neg37 C Neg
o

M B B

OF G O lento O lento O O

URE neg neg neg V

IND Pos pos neg neg

Dnase Pos neg neg V

MC Var var var V

polimi x R R S R

B B

* pode ser motilidade positiva a 20 C

Tabela 4.4 - Oxidase positiva, motilidade negativa, OFGlicose inerte e cocide

Microrganismos M. catarrhalis M. canis M. fenilpiruvica / ureolytica M. lacunata Moraxella spp*raras OXI Pos Pos Pos Pos Pos MOT Neg Neg Neg Neg Neg Morf C C C C C OF G I I I I I URE Neg Neg Pos Neg Neg GEL Neg Neg Neg Pos Neg Dnase Pos Pos Neg Neg Neg MC Neg Pos Pos Neg Var

* Moraxella spp: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis

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Tabela 4.5 - oxidase positiva, motilidade positiva e OF Glicose inerte ou alcalino

Microrganismos OXI MOT M OF G MC URE CIT Nat\ito Nit/g 42 C s A x. denitrificans A. piechaudii Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica Comamonas spp P. pseudoalcaligenes P. alcaligenes Pos pos Pos Pos pos pos Pos Pos pos Pos Pos pos pos Pos B B B CB B B B ALC ALC ALC ALC Inerte Inerte Inerte pos Pos Pos Pos pos pos Pos NT neg Neg Pos++ neg neg Neg Pos Var var pos pos neg pos pos Pos 54+ Pos Neg Pos Neg neg Neg neg Var Pos Neg
o

Tabela 4.6 - oxidase positiva, motilidade positiva e OFGlicose oxidativo

Microrganismos A. x. xilosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. mendocina (rara) P. putida P. stutzeri S. paucimobilis B. cepacia B pseudomallei S. putrefaciens OXI Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos MOT Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos M B B B B B B B B B B OF G 42C GEL O O O O O O O O O O NT NT ESC Neg POL S S S S S S S R R S MC Pos Pos Pos Pos Pos Pos var LIS NT Neg Neg Neg Neg Neg NT Arg var pos pos pos pos neg neg

Pos 82%+ Neg Neg Pos Neg 69 NT Pos Neg Neg Neg NT Neg Neg Neg Neg Pos

86%+ Pos pos pos pos pos

83%+ 20%+ 63%+ pos Var 79%+ 59%+ Var neg

Pos 80%+ neg Pos pos neg neg Pos Neg

Tabela 4.7 - Bactrias no fermentadoras com pigmento rosa

Microrganismos Methylobacterium spp Roseomonas spp OXI pos pos MOT pos Var M B CB OF g URE Var var pos pos MC neg pos 42oC neg pos Obs. Colnia seca coral , bacilos com vacolos Colnias mucides rosadas cocobacilos

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5. REFERNCIAS
1.

AUGUST, M.J., HINDLER, J.A., HUBER, T.W., SEWEL, D.L. CUMITECH 3A. Quality control and quality assurance practices in clinical microbiology. Coord. Ed. A.S. Wessfeld. American Society for Microbiology. Washington, D.C., 1990. FORBES, B.A., SAHM, D.F., WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 10th Ed. St.Louis. Mosby Inc., 1998.

2.

3. KONEMAN, E.W., ALEN, S.D., JANDA, W.M.; SCHRENKENBERGER, P.C.; WINN Jr., W.C. Nonfermentative gram-negative Bacili, Chapter 5. IN: Diagnostic Microbiology -- Color Atlas and Textbook. 5th Ed. Lippincott, 1997. 4. LAFFINEUR, K., JANSSENS, M., CHARLIER, J. et al. Biochemical and susceptibility tests useful for identification of nonfermenting Gram-negative rods. J. Clin. Microbiol. 40(3):1085-1087, 2002. 5. Mc FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd. Ed. William & Wilkins Co., Baltimore, 2000. 6. MURRAY, P. R. et alli. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology 7th ed. Washington DC.1999. 7. OPLUSTIL, C.P., ZOCCOLI, C.M., TOBOUTI, N.R., SINTO, S.I. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. Sarvier, So Paulo Brasil, 2000. 254p 8. SCHRENKENBERGER, P.C. Practical approach to the identification of glucose non fermenting Gram-negative bacilii - a guide to identification. 2nd Ed. University of Illinois, College of Medicine at Chicago. CACMLE, 1996.

68

Abreviaturas do captulo de No fermentadores:

42oC = crescimento a temperatura de 42oC ALC = reao alcalina no meio OFG ARG = arginina B = bacilo C = coco CIT = citrato EPM = meio Escola Paulista de Medicina GEL= gelatina HEM= hemlise em agar sangue H2S = cido sulfdrico I = meio OF Glicose Inerte IAL= meio Adolfo Lutz IND= prova de indol IMP= Imipenem teste com disco de LIS = lisina M = morfologia da bactria(C=coco, B=bacilo e CB=coco-bacilo) MALO = utilizao do malonato MILi = meio motilidade Indol Lisina MOT = prova da motilidade em lmina NaCl6,5% = crescimento em caldo com NaCl6,5% Neg = prova negativa NT = no testado (no citado na literatura) O = meio OF Glicose oxidativo OFG = meio de oxidao fermentao da glicose de Leifson POL = polimixina Pos = prova positiva R = resistente S = sensvel TSI = trplice aucar ferro URE= uria VAR = reao varivel

69

Captulo 6 - BACILOS CURVOS OU ESPIRALADOS

1. INTRODUO: Este captulo apresenta os principais bacilos curvos ou espiralados de importncia clnica, relacionados s principais patologias, fontes de infeco e recursos diagnsticos para sua caracterizao. Por se tratar de agentes raros, com exceo dos Campylobacter spp, no sero abordados em profundidade, devendo o microbiologista encaminhar a cepa isolada para Laboratrio de Referncia ou consult-lo sobre recursos disponveis para tentativa de isolamento.

Tabela 1 - Principais Bactrias Curvas ou Espiraladas

Agente Arcobacter spp Borrelia burgdoferi Borrelia recurrentis Campylobacter coli/ jejuni Campylobacter fetus Helicobacter pylori Helicobacter spp Leptospira spp Treponema pallidum Vibrio spp Doena Bacteremia, gastroenterite Doena de Lime Febre recurrente epidmica Gastroenterite Bacteremia, infeco extra-intestinal Gastrite, lcera pptica Gastroenterite, bacteremia, etc. Leptospirose Sfilis Gastroenterite Reservatrio Gado, humanos Roedores Humanos Alimentos contaminados Humanos Humanos, macacos, gatos Animais domsticos Ces, gatos, porcos, ratos Humanos Alimentos, gua Transmisso Alimentos
1

Carrapatos Sarna (P.humanus) Alimentos Fecal-oral Fecal-oral Fecal-oral, alimentos Alimentos-gua Sexual Alimentos
1 2 1

1 Ingesto de alimentos e gua contaminados 2 Alimentos ou gua contaminados com urina de animal infectado

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Tabela 2 - Recursos diagnsticos

Agente Arcobacter spp Testes* - Microscopia: bacilos Gram negativos curvos ou helicoidais o - Cultura: cresce entre 15 a 30 C em ambiente especfico de combinao de gases em CAMPY-CVA. - Sorologia: No disponvel - Microscopia: espiroquetas coradas por colorao de prata de WarthinStarry ou anticorpos marcados por fluorescena em tecidos o - Cultura: meio BSK II em microaerofilia entre 30-37 C por 6 semanas - Sorologia; Imunofluorescncia e ELISA - Microscopia: espiroquetas coradas pelo Giemsa, Wright de amostras de sangue - Cultura igual de B. burgdorferi - Microscopia:bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram. - Cultura: cresce a 37 e 42oC em em ambiente especfico de cambinao de gases em Campy-CVA

Borrelia burgdorferi (doena de Lyme)

Borrelia spp

Campylobacter coli e C. jejuni

- Microscopia:bacilo fino e curvo, Gram negativo, mas mal corado pelo Gram Campylobacter fetus - Cultura: cresce em agar sangue a 37oC, mas no a 42oC em ambiente especfico de cambinao de gases - Microscopia:bipsia gstrica corada por H&E, Giemsa ou colorao pela prata de Warthin-Starry. - Recurso rpido; teste da urease em bipsia gstrica (sensibilidade>90%) o - Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37 C por 5-7dias - Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio - Pesquisa no sangue, LCR e urina:microscopia em campo escuro (baixa sensibilidade) ou por imunofluorescncia direta os - Cultura: 1 . 10 dias de doena: LCR e sangue colhido com heparina em meio de Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena. - Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos

Helicobacter pylori

Leptospira spp

- Linfa de leses observadas em campo escuro ou colorao pela prata (Fontana); presena de espiroquetas. Imunofluorescncia direta mais Treponema pallidum sensvel . - Sorologia: VDRL ou FTA-abs so muito teis para diagnstico
* Recursos no citados: no teis ou no disponveis BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina

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2. Campylobacter Material: em gastroenterite colher fezes e enviar rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior freqncia infeces extra-intestinais. Microscopia: a colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos, mas a ausncia no contra-indica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade. Tabela 3 - Principais espcies de Campylobacter e Arcobacter
Bactria C. jejuni C. coli C. fetus Campylobacter spp Arcobacter
* C. lari = R

Catalase + + + V +

H2S TSI neg neg neg + neg

Cresc. 0 15 C neg neg neg neg +

Cresc. 0 25 C neg neg + neg +

Cresc. 0 42 C + + neg + V

MC + + + V V

Ac.
Nalidixico

Cefaloti na R R S S* V

S ou R S S ou R S ou R S

Isolamento: a maioria das espcies de Campilobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de CO2, 10% de CO2 e 85% de N2 (microaerofilia), obtidos com geradores especficos e no apenas com vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das fezes em filtro de acetato de celulose >0,45m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos sendo na atualidade os mais recomendados o gar carvo desoxicolato cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona , Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos). Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC

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(todos crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento. As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel a presena de qualquer tamanho de halo. 3. Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas Como suspeitar da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas? Duas so as principais evidncias: a) Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva. b) Materiais clnicos que podem, eventualmente, serem associados com maior freqncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas:
Tabela 4- Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes quadros clnicos:
Bactria/ Material clnico Vibrio cholerae V. parahaemolyticus Plesiomonas shigeloides A. hydrophila A. caviae A. veronii Diarria freqente freqente freqente freqente freqente Infeces partes moles pouco comum raro frequente raro raro Sepse raro freqente * freqente freqente freqente Outros raro raro freqente freqente freqente

*associado meningite em recm-natos

3.1. Vibrio As espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos, anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gs, oxidase positivos. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10 espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias. A clera, causada pelo V. cholerae produtor de toxina (dois biotipos: clssica e El Tor), responsvel por diarria secretria disseminada por via fecal-oral (gua, alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas a falta de

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condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar de assintomtico a diarria aguda com morte em 5 horas por desidratao e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos. A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de transporte de Cary & Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico. Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. gar sangue e Mc Conkey permitem o crescimento da maioria das espcies, e neste ltimo meio as colnias so semelhantes a de bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas. So oxidase positivos, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl 6%. 3. 2. Aeromonas e Plesiomonas Vivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante s diferentes condies. Aeromonas tem sido isoladas em carnes, meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e pssaros. Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso ps picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarria, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps acidentes

(corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose negativa. As principais caractersticas das Aeromonas so: Lactose negativas, H2S negativo, fenilalanina negativo, indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos (Mc Conkey e SS).

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Tabela 5 - Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp, E.coli e Citrobacter spp
Bactrias/Provas E. coli Citrobacter spp Aeromonas spp
1

Citrato Neg + Var

uria Neg Var Neg

lisina + Neg +

H2S Neg Var neg

Lactose + Var Neg

1

Gs + + Var

Aeromonas caviae: lisina negativo e lactose positiva

Tabela 6 - Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio
Provas Cresce sem NaCl
1

V. cholerae +
1

Outros vibrios Neg + + +

2

Aeromonas spp Plesiomonas spp + Neg + + + Neg + Neg

Cresce com 6% NaCl Oxidase DNAse

1

+ + +
2

Crescimento em caldo nutriente

exceto V. mimicus

Tabela 7 - Provas para diferenciar as principais espcies de Aeromonas e Plesiomonas

Bactria A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. jandaei A. schubertii Plesiomonas shigelloides Indol + + + + + Neg + Lis /arg /orn + + neg arabinose + + neg neg neg Neg neg Lactose neg + neg neg neg Neg neg sacarose esculina + + + + neg Neg neg + + neg + neg Neg Neg hemlise* + neg + + + Var neg

neg + neg + + + + + + neg

neg + + + + neg neg +

* sangue carneiro

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4. REFERNCIAS 1. MURRAY, P.R. Algorithms for identification of curved and spiral-shaped Gram negative rods. Manual of Clinical Microbiology, ASM, 7th ed. 1999. 712 715. 2. NACHAMKIN, I. Campylobacter and Arcobacter, in: Murray, P. R. et alli. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology 7th. Ed. 1999, 716726.

75

Captulo 7 - BACILOS GRAM POSITIVOS

1. INTRODUO: Este captulo aborda os aspectos prticos para identificao dos principais bacilos Gram positivos de importncia clnica. Bactrias consideradas: a) Corineformes: Arcanobacterium spp, Corynebacterium spp, G. vaginalis, Oerskovia spp, Rhotia spp b) Bacilos Gram positivos regulares: Erisipelotrix spp, Listeria spp, Kurthia spp c) Esporulados: Bacillus spp d) Bacilos ramificados (Actinomycetos): Nocardia spp, Rhodococcus spp, Streptomyces spp Bactrias Gram positivas que so citadas no texto para fins de diagnstico diferencial, mas que foram abordadas em outros captulos so: Actinomyces spp (anaerbios), Clostridium spp (anaerbios), Lactobacillus spp (anaerbios), Mycobacterium spp (micobactrias), Outros anaerbios: Mobiluncus spp, Propionibacterium spp, Eubacterium, Bifidobacterium spp. Os Actinomyces spp e alguns Propionibacterium spp embora anaerbios, podem ser aerotolerantese, e crescer em aerobiose. 2. ORIENTAO GERAL NA IDENTIFICAO DE BGPs: Para triagem inicial dos Bacilos/cocobacilos Gram positivos algumas

observaes e provas so fundamentais: a) Colher material com antissepsia rigorosa para evitar contaminao. b) Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso pede-se a coleta de no mnimo duas hemoculturas. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a hiptese de ser agente infeccioso. c) Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos

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d) Procurar sempre ter bacterioscopia do material clnico onde foi isolado o Bacilo Gram Positivo (BGP) e verificar se h predomnio do agente em questo, relevante o achado dentro de macrfagos/neutrfilos. e) Valorizar materiais nobres (sangue, LCR, pericrdico, etc.), bipsias, aspirados de abscessos, LBA, etc desde que bacterioscopia e o quadro clnico sejam compatveis; f) Cuidado com contaminao por bactrias da flora de mucosas. g) Em caso de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento de >104 ufc/mL h) Em urina sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem >105 ufc/mL. i) Observar caractersticas da colnia: cor, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise, etc. j) Testar em quais meios cresce o BGP e suas condies de incubao. k) Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a colnia envelhecer ou crescer em meios pobres. l) sempre interessante semear em meio slido e em caldo para observar variao morfolgica. Observar ramificaes em diferentes condies e meios de cultivo m) Fazer colorao de Ziehl ou de Kinyoum para pesquisa de lcool-cido resistentes. n) Lembrar que este grupo de bactrias pode variar muito nas caractersticas morfolgicas quando observado no material clnico, culturas jovens, culturas velhas, meios slido ou lquido, meio rico ou pobre, etc. sem que represente contaminao ou cultura mista. No entanto, algumas destas bactrias so habitantes de mucosas e podem causar infeco mista associada ou no com anaerbios estritos. 3. CORINEFORMES So classificados como corineformes as seguintes bactrias:
- Corynebacterium spp - Arthrobacter spp - Brevibacterium spp - Curtobacterium spp - Exiguobacterium spp

- Arcanobacterium spp
- Microbacterium spp - Aureobacterium spp - Cellulomonas spp - Turicella spp

Dermabacter spp Gardnerella spp Rothia spp

Entre os corineformes foram selecionados aqueles de maior importncia clnica, sendo recomendvel a caracterizao e provas diferenciais apenas dos gneros: Corynebacterium spp, Arcanobacterium spp, Gardnerella spp, Rothia spp

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Tabela 1 - Principais doenas associadas aos bacilos Gram positivos

Bactria Actinomyces spp, A. israelii, A. naeslundii, A.viscosus, A. odontolyticus e outros Arcanobacterium spp, A.nhaemolyticum Bacillus sp, B. anthracis, B. cereus C diphtheriae, C. ulcerans C. jeikeium C. pseudotuberculosis Erysipelotrix sp Gardnerella spp Lactobacillus spp Listeria spp Nocardia spp Oerskovia spp Rhodococcus spp Rothia spp, R. dentocariosa Streptomyces spp Quadro clnico Actinomicose - doena granulomatosa predominante cervico-facial faringite, infeco de partes moles,endocardite, etc Antraz, intoxio alimentar, sepse e pneumonia em imunossuprimidos e neutropnicos difteria endocardite, bacteremia Zoonose, linfadenite e abscessos celulite em veterinrios e zona rural vaginose, endometrite, ps-parto flora oro-intestinal e vaginal, rarssimo patgeno meningite, sepses, aborto abscesso cerebral, abscesso imunocomprometidos pulmonar, etc em

bacteremia, infeco associada a corpo estranho pneumonia, abscessos, etc em imunocomprometidos endocardite, bacteremia, infeces respiratrias Oportunista, infeces de partes moles, etc.

Tabela 2 Triagem inicial para Bacilos e Cocobacilos Gram positivos

Bactria Actinomyces spp Arcanobacterium spp Bacillus spp Clostridium spp Corinebacterium spp Erisipelotrix rhustiopathie Gardnerella vaginalis Lactobacillus spp Mobiluncus spp Listeria spp Mycobacterium spp Nocardia spp Oerskovia spp Ppropionibacterium spp Rhodococcus spp Rhotia dentocariosa Streptomyces spp esporo anaerbio AAR* ramificado neg + + neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg + neg neg + neg neg neg + + neg neg neg neg + neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg + + neg neg V neg neg + Raro/curto neg neg neg neg neg neg neg neg V + V + V + + hemlise neg beta V V neg alfa Beta/coelho neg neg beta neg neg neg neg neg neg neg catalase V neg + neg neg neg V neg + + + + V + + + Col. coral pleomrfico Raro, hifas

Obs:
pleomrfico

paliada H2S + Gram lbil mvel mvel Cresc. lento Col. laranja Col. amarela

* AAR = alcool-cido resistente

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importante destacar que os corineformes correspondem a um grupo no homogneo de bactrias com poucas caractersticas em comum sendo tambm morfologicamente muito distintos: 3.1. Corynebacterium spp O gnero Corynebacterium compreende cerca de 50 espcies, sendo cerca de 30 de algum interesse mdico. Estas espcies podem ser diferenciadas por provas como: OF glicose, reduo de nitrato, urease, utilizao de diferentes carbohidratos e reao de CAMP. Principais caractersticas: No se ramificam e no so alcool acido resistentes Em geral so catalase positivos, imveis, esculina e gelatina negativos Morfologia: Variam muito na morfologia das diferentes espcies, e mesmo mesmas culturas em diferentes condies de cultivo. So bacilos Gram positivos, retos ou ligeiramente curvos, com extremidades em geral arredondadas, com a forma de clava, podendo apresentar arranjos caractersticos em paliada ou letras chinesas, podendo ou no apresentar grnulos metacromticos, que so melhor visualizados atravs da colorao de Albert-Laybourn, e que caracterizam as bactrias conhecidas como difterides. As corinebactrias de maior importncia clnica so catalase positivas,

imveis podendo ser fermentadoras ou no. So muitas as corinebactrias que pode-se isolar em material clnico, entretanto, de pouco interesse aprofundar na caracterizao destas espcies, exceto para fins de pesquisa ou epidemiolgicos. Corinebacterias de importncia clnica: Considera-se fundamental o laboratrio de microbiologia poder caracterizar ou afastar a possibilidade de isolamento das espcies de C. diphtheriae e C. ulcerans que podem pproduzir a toxina diftrica. Outra espcie de importncia em infeces hospitalares e freqentemente isolada em material clnico a C. jeikeium. Difteria: em virtude da vainao compulsria, a difteria na atualidade uma doena rara em pacientes imunizados, mas de importncia epidemiolgica quando detectada. A infeco caracteriza-se por processo infeccioso localizado em trato respiratrio e manifestaes txicas em corao e nervos perifricos. Quadro clnico: Ocorre dor de garganta, dificuldade de deglutio, presena de pseudomembrana purulenta, dor no corpo, cefalia, nuseas e febre. A morte pode

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ocorrer por obstruo respiratria ou por miocardite. Pode ocorrer difteria cutnea com leses necrticas e, eventualmente, presena de pseudomembrana. O laboratrio deve processar o material semeando em meios no especficos como gar sangue e gar chocolate para pesquisa do Streptococcus pyogenes e outros patgenos eventuais, e encaminhar outro swab em meio de transporte para o laboratrio de referncia. Os meios especficos para a pesquisa de bacilo diftrico so os meios de enriquecimento de Loeffler e o meio seletivo e diferencial gar sangue-cistina-telurito. Coleta de material para diagnstico da difteria: O material de orofaringe ou nasofaringe deve ser colhido das bordas, abaixo da pseudomembrana purulenta. Bacterioscopia: A bacterioscopia do esfregado do material, bem como do crescimento no meio de Loeffler, aps colorao de Gram pode ser sugestiva caso sejam visualizados bacilos difterides, melhor caracterizados pela colorao de Albert-Laybourn. A identificao bioqumica das Corynebactrias potencialmente produtoras de toxina difcil em laboratrio no especializado. Recomenda-se, nestes casos, encaminhar o material ou contactar o Laboratrio de Referncia para orientao. 3.2. C. pseudotuberculosis: deve ser lembrado nos casos de veterinrios ou trabalhadores de zona rural com quadro de linfadenite, linfangite ulcerativa ou abscesso relacionado a manuseio de aborto de gado. Esta espcie pode ser produtora de toxina diftrica. As colnias so pequenas, branco-amareladas, urease positiva, CAMP reverso positivo (inibe a beta-hemlise do S. aureus em gar sangue com hemcias de carneiro).

Tabela 3 - Provas diferenciais para os corineformes

Bactria / Prova Arcanobacterium spp C. diphteriae C. jeikeium C. ulcerans/pseudot.* Corinebacterium spp Gardnerella vaginalis Oerskovia spp Rhotia spp
1

Catalase neg + + + + Neg + var

O/F F F O F F F F F
2

Motilidade neg neg neg neg var neg var neg

Uria neg neg neg + var neg neg neg

*

Esculina neg neg neg neg neg neg + +

CAMP reverso + neg neg + neg neg neg neg

Hemlis e beta neg neg neg neg Beta neg neg

2

Base CTA (cystine tripticase agar O = oxidativo e F = fermentador

gar sangue de coelho

Pseudotuberculosis

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Algumas caractersticas importantes de alguns corineformes: C. jeikeium: colnia pequena cinza ou translcida, bacterioscopia um pequeno cocobacilo gram positivo, resistente a vrios antibiticos (beta-lactmicos, gentamicina, etc). Associada a septicemia, endocardite, infeces de pele e tecido subcutneo. Infeces mais severas podem ocorrer em imunossuprimidos, como meningite, pneumonia e peritonite ou associada a prteses e procedimentos invasivos. Apresenta metabolismo oxidativo na base CTA, enquanto a maioria das Corynebacterium spp de importncia clnica so fermentadoras. Cresce em BHI com 1% de Tween 80, sendo lipoflica e no em caldo BHI sem Tween 80. Oxida a glicose, uria negativa, esculina negativa, PYR positiva.

3.3. Rothia spp - So pleomrficos podendo apresentar-se tanto na forma cocide como de bacilos. So catalase positiva, imvel e fermentador. Rhotia denticariosa: pertence microbiota da cavidade oral, e est raramente associada endocardite. So bacilos Gram positivo retos, sendo alguns ramificados. As colnias so brancas salientes e s vezes rugosas. So fermentadores da glicose e esculina positivo. 3.4. Arcanobacterium spp So bacilos Gram positivos irregulares, catalase negativa, imveis e fermentadores. Espcies: A. haemolyticum, A. pyogenes e A. bernardiae. So hemolticos, tm a hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e crescem melhor em CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de CAMP reverso (inibio da hemlise). Crescem em 24-48h como colnias pequenas e hemolticas. So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e ramificaes rudimentares. Colnias mais velhas tendem a adquirir a forma de cocobacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos. Importncia clnica: Arcanobacterium haemolyticum tem sido considerado juntamente com S. pyogenes como agentes patogenicos em orofaringe, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est associado com infeces de partes moles, faringite em jovens e raros casos de septicemia, endocardite e osteomielite.

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3.5. Gardnerella spp so pequenos bacilos ou cocobacilos irregulares, que se coram irregularmente pela violeta. A principal espcie a Gardnerella vaginalis, que tem uma classificao taxonmica incerta, para fins didticos estudada com os coryneformes. pleomrfica, Gram varivel (ora Gram negativa ora parcialmente e fracamente Gram positiva), imvel, sem cpsula. um anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e oxidase negativos. Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta, mas sem hemlise no agar sangue de carneiro. So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou no Gram pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. Importncia clnica: Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituio ao Lactobacillus de Doderlein. A vaginose bacteriana e a presena de Gardnerella esto associadas tambm ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Esta bactria comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e ps-aborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em adultos. 3.6. Oerskovia spp - So microrganismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de miclios, apresentam ramificao, hifas vegetativas, sem hifas areas e penetrao no gar. Catalase positivo, motilidade varivel e fermentadores. Oerskovia turbata e O. xanthineolytica, so bactrias do meio ambiente ou solo, com pouca importncia clinica, com raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses. Cresce bem em gar sangue de carneiro e no agar chocolate. Cresce mal no meio de Sabouraud dextrose. O crescimento, quando ocorre, visvel aps 24-48h em anaerobiose ou 5% CO2. Apresentam colnias amareladas, catalase positiva em aerobiose, oxidase negativa. Fermentador da glicose, sacarose e lactose, hidrolisa gelatina, amido e esculina. 4. BACILOS GRAM POSITIVO 4.1. Listeria - So bacilos Gram positivos pequenos, uniformes, no ramificados, apresentando-se s ou em pequenas cadeias. A nica espcie importante para o homem entre as sete espcies conhecidas a L. monocytogenes. Mvel a temperatura ambiente

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(25 a 28oC) e imvel a 37oC. Crescem em gar sangue, gar Chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e agar Mueller Hinton, mas no em Mc Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30 a 37oC, e crescem tambm temperatura ambiente e a 4oC em trs a quatro dias. um anaerbio facultativo, catalase positivo, oxidase negativo, que produz cido de glicose e CAMP positivo. Alm disso, verificada prova da esculina rapidamente positiva, assim como uria, gelatina, indol e H2S negativas. Importncia clnica: Encontrada na natureza no solo, em matria orgnica em decomposio, gua, leite e derivados, carne, etc. Sendp encontrada como microbiota de diversos mamferos, aves, peixes, e insetos. Tem Importncia clnica particularmente para idosos e imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Na grvida a infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Pode ocorrer em surtos, em geral relacionados a contaminao de alimentos. Isolamento: a partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos, gua, etc. Semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas. Identificao: bacilo Gram positivo, hemlise beta em gar sangue de carneiro, CAMP teste positivo, motilidade positiva temperatura ambiente, hidrlise da esculina positiva e NaCl6,5%+. 4.2. Erysipelotrix rhusiopathiae - Bacilo Gram positivo curto, de extremidades arredondadas anaerbio facultativo, no esporulado, no alcool cido resistente, ocorre s, cadeias curtas ou longas, sem ramificar. Existe na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais. Vive em animais, peixes e pssaros e causa erisipela em porcos. No homem causa uma zoonose (doena ocupacional de veterinrios e manuseadores de carne e animais) caracterizada por celulite que aparece no local da inoculao aps 2 a 7 dias. Caractersticas clnicas: A leso costuma ser violcea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite podem

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ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave. Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou mses, com possibilidade de recada. Coleta do material: material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swab da leso em geral negativa, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida. Isolamento: cresce em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a 35oC aerobiose ou 5% de CO2. No agar sangue cresce em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer, bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram positivos, s vezes corandose mal pelo Gram Identificao: catalase negativo, imvel, cresce entre 5 a 42oC e em caldo NaCL6,5%, esculina negativa, fermenta lentamente a glicose sem produzir gs, uria e indol negativos, mas caracteriza-se por crescer no TSI produzindo H2S, lactose positivo, sacarose negativo.

Tabela 4 - Principais diferenas entre bacilos e cocobacilos Gram positivos

Motil. o 25 C Mvel CAMP NaCl 6,5% test Esculina

Bactria/Prova Listeria monocytogenes Enterococcus spp Streptococcus beta hemolticos Lactobacillus spp

Gram Bacilo curto ou cocobacilo regular e largo Cocos ou cocobacilos em cadeias Cocos em cadeias Cocobacilos e cadeias longas Bacilo grande, cadeias, cocide em cultura velha Bacilos e cocobacilos pleomrficos cocobacilo ou filamentos longos

Catalase

Hemlise

Obs.

+
neg

beta alfa beta gama beta

+
neg

+/+ +/+
neg / neg

neg

neg

neg

Neg *

neg

neg

no

neg

neg / neg No usa glicose

Kurthia spp Corynebacterium spp Erysipelotrix rhusiopathiae

+ +
neg

Mvel

no

neg

neg / neg

Neg

neg

V / neg

neg

alfa

neg

neg / neg

H2S+

* S S.agalactiae (beta do grupoB) positivo

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4.3. Kurthia - So bacilos Gram positivos grandes em cadeias ou em paralelo, ou filamentos no ramificados e em culturas velhas tendem a ficar cocides ou bacilos curtos. So aerbios estritos, no esporulados, no alcool cido resistentes; so mveis, catalase positivo e no fermentadores. Crescem em gar sangue como colnias de cor creme no hemolticas, podendo ser confundidas com Bacillus spp. Habitat e importncia: vivem no meio ambiente, na gua, solo, animais, sua carne e seus derivados. Seu papel clnico questionado, pois no h relatos recentes de isolamento em casos significativos. Bacilos Gram positivos anaerbios que devem ser diferenciados: Lactobacillus spp - Flora da boca, intestino e flora vaginal (Bacilo de Doderlein). So anerbios estritos mas crescem em gar sangue e gar chocolate como colnias muito pequenas. So imveis e catalase negativa. Sem valor patognico. Mobilluncus spp - bacilos Gram positivos anaerbios estritos, curvos, mveis que vivem na trato genital humano e reto. Encontra-se aumentado nos casos de vaginose, juntamente com a Gardnerella. Propionibacterium spp, Eubacterium spp e Bifidobacterium spp anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios.

5 - BACILOS ESPORULADOS AERBIOS E ANAERBIOS FACULTATIVOS: 5.1. Genero Bacillus: compreende cerca de 50 espcies de bacilos anaerbios facultativos que podem exibir a forma esporulada, corando-se mal pela violeta, quando em colnia mais velhas. As formas vegetativas so retas largas, podendo ser grandes, isolados ou em cadeias. A forma e localizao dos endosporos so teis para sua classificao: podem ser cilndricos, ovais, redondos, e eventualmente com forma de feijo posio central, sub-terminal, terminal dilatando ou no a clula me Todos so mveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides e a maioria catalase positiva. Na presena de on bicarbonato (HCO3-) e em anaerobiose ou CO2 os B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium apresentam cpsula polipeptdica.

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Habitat e importncia clnica - Os Bacillus spp encontram-se basicamente no solo, gua, materia orgnica animal e vegetal nas condies mais variadas de temperatura, umidade, pH, etc.As duas espcies mais importantes e que devem ser reconhecidas pelo laboratrio de microbiologia so o B. antrhacis e B. cereus. Tabela 5 - Principais espcies de Bacillus relacionadas infeco
Espcie de Bacillus Quadro clnico Antrhax cutneo Anthrax intestinal Anthrax pulmonar Necrose ou gangrena em partes moles Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Infeces pulmonares,endocardite, meningite, osteomielite e endoftalmite Infeces de partes moles, abscessos bacteremia e sepse Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Intoxicao alimentar Bacteremia, sepse, endocardite e infeces respiratrias Frequncia de relatos Bastante frequente Raro Raro Bastante frequente frequente Muito frequente frequente frequente Pouco frequente frequente Muito frequente raro

Antrhacis

Cereus

Circulans Licheniformis Subtilis

5.2. Bacillus cereus - pode apresentar dois tipos de intoxicao: a) caracterizado por diarria, dor abdominal, que aparecem 8 a 16h aps a ingesto do alimento contaminado (carnes, vegetais, leite, molhos, massas, doces, bolos). b) Caracterizado por nuseas e vmitos que aparecem 1 a 5 horas aps a ingesto do alimento contaminado, principalmente arroz, mas pode ser os mesmos alimentos acima. 5.3. Bacillus anthracis - o passado era causa importante de mortalidade no gado, sendo os herbvoros altamente suscetveis, sendo reduzida pela vacinao e melhores condies de higiene. O homem pode adquirir a doena em contato com animais doentes (trabalhadores rea rural e veterinrios), no manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais e de forma eventual, sendo a forma cutnea quase a totalidade dos casos, com raros episdios intestinais pela ingesto de carne contaminada. Potencial risco elevado na comunidade quando usado em guerra biolgica.

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Quadro clnico: A forma cutnea no tratada pode ser fatal (menos de 20% dos casos), principalmente quando a leso prxima a cabea ou pescoo. As formas pulmonares e intestinais so mais graves pela dificuldade de diagnstico. No local de inoculao da forma cutnea aparece aps 2 a 3 dias uma pequena mancha ou ppula, seguida no dia seguinte de um anel de vesculas em torno da ppula, que ulcera, seca, escurece formando uma escara caracterstica que cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante, mas tem a caracterstica de ser indolor e sem pus. A forma intestinal semelhante forma cutnea atingindo a mucosa com leses e eventualmente gastroenterite. No antraz pulmonar o esporo inalado transportado pelos macrfagos do pulmo para o sistema linftico onde os esporos germinam e causam septicemia que fatal. Chama ateno que a evoluo nos casos fatais inicialmente caracterizada por sintomas leves como fadiga, mal-estar e febre baixa, ou s vezes at sem sintomas, quando repentinamente se instala dispnia, cianose, febre elevada, desorientao, falncia circulatria, choque, coma e morte em poucas horas. Em geral a bacteremia importante. Coleta de material: swab do exudato de leses podem ser teis; na escara, remover a crosta e colher material com swab ou com tubo capilar, usando luvas. Na forma intestinal fezes podem ser colhidas. Ps-mortem, sangue venoso ou de sangramento de mucosas (sangue no coagula) pode evidenciar o bacilo na bacterioscopia. No antraz pulmonar a hemocultura til nos casos graves, mas o material pulmonar oferece menor chance de isolamento. Isolamento: em casos clnicos os Bacillus esto na forma vegetativa, mas em alimentos, produtos secos de animais(ossos, crina,pelo) o Bacillus dever estar em forma esporulada e haver necessidade de ativ-los a 62,5oC por 15 minutos (choque trmico). Os Bacillus crescem com facilidade em meios pobres ou ricos. Dependendo do material (ex: fezes) poder haver necessidade de usar meio seletivo com adio de polimixina (100.000U/L). Colnias grandes de cor creme crescem no gar sangue. Tabela 6 - Diferenas entre Bacillus spp e Clostridium spp
Bacillus spp Clostridium spp Endosporos em aerobiose Endosporos em anaerobiose Catalase positivos Catalase negativos

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Tabela 7 - Diferenas entre B. cereus, B. anthracis e espcies relacionadas

Espcies B. cereus B. anthracis B. thurigiensis B. cereus subsp. mycoides Col. no gar sangue Esverdeado claro Branco acinzentado Esverdeado claro Rizoides / espalhando Motilidade Hemlise Penicilina Citrato Lecitinase Res Sem Res Res

+
neg

+
neg

+
var var

+
Fraco +

+
neg

+
Fraco +

+ +

* agar sangue de carneiro

O B. antrhacis virulento pode ser testado para produo de cpsula semeandose em gar nutriente com 0,7% de bicarbonato de sdio em jarra com vela. O crescimento ser mucide e a cpsula poder ser evidenciada com a tinta da china. 6. ACTINOMICETOS Grupo de bactrias Gram positivo que apresentam como caractersticas em comum a produo de filamentos ou hifas vegetativas, sendo que alguns tambm apresentam hifas areas, semelhanas de composio de parede e padro de cidos graxos celulares. Neste grupo sero abordados os seguintes gneros: Nocardia spp,

Rhodococcus spp, Streptomyces spp. O gnero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas analisado juntamente com os corineformes. Outros actinomicetos raros ou de menor importncia clnica no considerados so: Gordona spp, Tsukamurella spp, Actinomadura spp, Nocardiopsis spp.

Informaes importantes sobre Actinomicetos: Para a adequada caracterizao dos Actinomicetos, que apresentam alguma semelhana morfolgica com os fungos, importante considerar: a) a origem do material, valorizando os abscessos, b) a quantidade de microrganismos isolados e correlao com a bacterioscopia do material c) possibilidade de contaminao com bactrias da mucosa oral, d) pigmento da colnia, e) anlise morfolgica da bactria pelo microcultivo em lmina idntico ao utilizado na seco de Micologia, empregando gar fub sem dextrose a 25oC.

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Tabela 5 - Identificao presuntiva de actinomicetos

Gnero Nocardia Rhodococcus Oerskovia Rhotia Miclio areo Condio Metabolismo glicose oxidativo neg neg neg oxidativo Fermentativo fermentativo

+
neg neg neg

6.1. Nocardia spp - So bacilos Gram positivo ramificados e filamentosos, aerbios estritos, catalase positivo, imveis, que se fragmenta em bacilos e cocos irregulares. Produz hifas areas medida que o cultivo envelhece. Existem 12 espcies sendo as mais importantes N. asteroides e N. brasiliensis. Importncia - Est associada ao solo e vegetais. As formas clnicas podem ser bem distintas: pulmonar (abscessos), extra-pulmonar localizada, sistmica, sistema

nervoso central (abscessos), partes moles e micetoma. considerada uma bactria oportunista pois a maioria dos casos no cutneos e micetomas ocorrem em pacientes imunocomprometidos. Coleta - Quando colhido o material por puno, bipsia ou mesmo swab da leso profunda, ele deve ser processado rapidamente e existe uma caracterstica do material descrita como grnulos de enxofre, especialmente nos micetomas. Bacterioscopia e Histologia - A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificaes e parcialmente ou fracamente lcool-cido resistentes pelo Ziehl ou colorao de Kinyoun. Cortes histolgicos corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grnulos, mas no os filamentos da bactria. O Gram ou a colorao de metenamina prata de Gomori so teis. Isolamento e Identificao - No bactria exigente, crescendo em gar sangue, agar chocolate, gar Sabouraud dextrose, gar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen. Cresce entre 72h a 14 dias. Com exceo da N. asteroides, a maioria das nocardias apresentam beta-hemlise em gar sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte nica de carbono), juntamente com Rhodococcus e algumas micobactrias. Em microcultivo possvel visualizar as hifas ramificando-se em angulo reto, podendo apresentar ramificaes secundrias, bem como hifas areas. Em cultura mais velhas em gar tornam-se visveis as hifas areas nas colnias rugosas. As micobactrias

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de crescimento rpido podem apresentar ramificaes bem curtas em angulo agudo e sem ramificaes secundrias. Uma caracterstica importante a cor das colnias em Sabourad dextrose gar ou mesmo em outros meios: salmo ou laranja claro N. asteroides laranja escuro N. brasiliensis A Nocardia brasiliensis uria positivo, citrato positivo e gelatina positiva. A Nocardia asteroides uria positivo, citrato varivel e gelatina negativa. 6.2. Rhodococcus spp - Importncia das nove espcies conhecidas. O R. equi uma bactria oportunista, causando pneumonia em imunocomprometidos, apresentando uma evoluo lenta e granulomatosa, com infiltrados que evoluem para cavitao. Pode

causar tambm abscessos no sistema nervoso central, tecido subcutneo, linfadenite, etc. Diagnstico clnico diferencial deve ser feito com micobactrias, fungos, nocardia e actinomyces. Hemoculturas com elevada freqncia podem ser positivas. Material para diagnstico: Lavado bronco-alveolar (LBA), bipsias,

hemocultura e mesmo escarro. Em material clnico o Rhodococcus pode ser visualizado no interior de macrfagos e extra-celular, na forma de cocos ou coco-bacilos. Em hemoculturas, LBA e escarro eventualmente pode ser observado na forma filamentosa. Identificao - Em microcultivo o R. equi cresce de forma tpica como cocobacilo ou bacilo em zig-zag. Em Heart Infusion gar (HIA) cresce em 6 horas a 35oC como bacilo Gram positivo e em 24 horas apresenta-se cocide. A forma de ramificaes rudimentares a partir dos filamentos pode ocorrer em culturas jovens em meio lquido. A colorao pelo Ziehl ou Kinyoun pode revelar a fraca alcool-cido resistncia. Em HIA cresce entre 28 e 35oC, entre 2 a 4 dias, mas no a 45oC. Pode crescer na forma de colnias rugosas (com hifas areas) ou lisas ou mucides. Pode apresentar a cor coral ou rosa plido que so mais freqentes, mas pode ser amarela ou incolor. 6.3. Streptomyces spp Alguns milhares de espcies de Streptomyces j foram caracterizados, sendo na quase totalidade saprfitas. O Streptomyces somaliensis responsvel pelo micetoma de cabea e pescoo. Outras espcies foram identificadas em casos de pericardite crnica e infeces de partes moles ps-traumticas (S. griseus).

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Caracterizao: O abscesso pode revelar a presena de grnulos duros. O Gram vai revelar uma massa de bacilos Gram positivo finos. No fastidioso, cresce em Sabouraud dextrose melhor incubado a temperatura ambiente entre 4 a 10 dias. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificaes, hifas areas e condios (via assexuada de propagao com forma arredondada como contas de colar). No alcool-cido resistente, e apenas os condios podem apresentar esta ppropriedade; metaboliza a glicose por oxidao e cresce a 50oC. As colnias so mais secas com, diferentes pigmentos (creme, marron, preto, etc) e presena ou no de hifas areas. Uma caracterstica importante das colnias o cheiro de terra molhada.

7. REFERNCIAS:

1. Mc NEIL, M.M., BROWN, J.M. Actinomycetes: epidemiology and microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 7(3): 357- 417, 1994.

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Captulo 8 - FASTIDIOSOS

1. CARACTERSTICAS GERAIS DOS FASTIDIOSOS Este grupo heterogneo de bactrias apresenta como caracterstica comum exigncias especiais de condies de cultivo, em relao s enterobactrias e a maioria dos no fermentadores. Estas condies variam para cada microrganismo, podendo ser necessidade de CO2, crescimento lento podendo necessitar at 30 dias de incubao (brucella), adio de fatores especiais de crescimento, etc. Pontos-chave para classificao: so bactrias Gram negativas ou Gram lbeis (coram-se de forma tnue pela safranina). muitos mas no todos MacConkey. para teste de fermentao de carbohidratos exigem uma base mais rica como o CTA (vide meios de cultura), o inculo deve ser bem denso e muitas vezes necessrio a adio de 2 ou 3 gotas de soro de coelho ou cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas bioqumicos. Exceto as Capnocytophaga spp que crescem formando colnias grandes e com aparncia de vu em torno da colnia, os demais fastidiosos crescem lentamente e exigem 48 a 72 horas para as colnias ficarem bem visveis, embora diminutas. Alguns destes potenciais patgenos esto associados a sndromes clnicas bem definidas, embora no frequentes como a brucelose, tularemia, etc. importante nestes casos obter informaes adicionais com o mdico assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de identificao microbiolgica. Sempre valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrer em mais de uma amostra, ou materiais de bom valor preditivo de infeco como o LCR, lquidos pleural, pericrdico, sinovial, BAL, etc. Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemoculturas e a bacterioscopia pode ser aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactria como pela m colorao pela safranina. so coco-bacilos e oxidase positivos, no crescem em

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A topografia da fonte de isolamento uma pista importante, pois diferentes espcies de Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium podem ser encontrados em pele e mucosas, a Gardnerella e Cardiobacterium no trato genital, etc. Como a alguns exigem tratamento com drogas no habituais, extremamente importante chegar a definio de gnero ou encaminhar a Laboratrio de Referncia. Outro motivo relevante para a correta identificao a importncia epidemiolgica que o agente possa ter em surtos ou mesmo em casos isolados, como o caso da brucelose, legionelose e Bordetella pertussis. A Pasteurella spp embora includa neste grupo, cresce com facilidade em gar Sangue, gar Chocolate, comportando-se no TSI MacConkey e oxidase positivo. Alguns dos fastidiosos esto relacionados a contato com saliva, sangue, fezes, atravs de acidente perfuro-cortante ou mordida de animais domsticos ou silvestres (Pasteurella, Bartonella, Francisella e Brucella). Destaca-se ainda a necessidade de precaues especiais no manuseio de alguns destes agentes pelo potencial patognico (Brucella e Francisella). Com base na importncia clnica e epidemiolgica este grupo de bactrias ser dividido em dois grupos: Grupo A e Grupo B
Quadro 1 - Grupo A (maior interesse clnico e epidemiolgico)
Bactria Bordetella pertussis /parapertussis Bartonella spp Brucella spp Francisella spp Haemophilus spp Legionella spp Pasteurella spp Hospedeiro principal Homem Via de transmisso Secrees de vias areas

como fermentador, mas no cresce em

Gatos. Humanos com a Mordida ou arranho de gato doena. Outros desconhecidos. Picada de piolho infectado Leite e derivados, carne , sangue Mamferos domsticos secrees de animais doentes Picada de carrapato ou mosquito Animais silvestres infectado em zona endmica Homem Meio ambiente/gua Animais domsticos/selvagens Secrees de vias areas Inalao de gua contaminada Mordida e secrees de animais domsticos e selvagens

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Tabela 1- Principais provas diferenciais entre os fastidiosos

Bactrias / Provas Actinobacillus actinomycetemcomitans Bartonella spp Bordetella pertussis Brucella spp Capnocytophaga spp Cardiobacterium hominis Chromobacterium spp Eikenella corrodens Francisella tularensis Haemophylus influenzae Kingella spp Legionella spp Pasteurella spp Streptobacillus spp
pos f* = positivo fraco pos = positivo

Oxidase neg/+f* neg pos pos neg pos var pos neg pos f* pos pos f pos neg
neg = negativo

catalase pos neg var pos neg neg pos neg pos f pos neg pos f pos neg

Motil. neg var neg neg neg neg pos neg neg neg neg pos f neg neg
AS = A. sangue

AS pos pos neg pos pos pos pos pos neg neg pos neg pos

ACH pos pos neg pos pos pos pos pos pos pos pos neg pos

var = varivel

ACH = A. chocolate

Tabela 2 - Principais fastidiosos, material clnico para diagnstico, meio especfico para isolamento e tempo para crescimento da colnia
Bactria Bordetella pertussis Bartonella spp Brucella spp Francisella spp Haemophilus spp Legionella spp Pasteurella spp Material clnico Swab nasofaringe Sangue, gnglios, bipsias Sangue/aspirado de medula Gnglios, bipsias Sangue, LCR, etc. Secrees ou aspirados de trato respiratrio inferior Sangue, LCR, leses Meio especfico Meio de Bordet & Gengou gar chocolate, gar sangue carneiro. Rotina de hemocultura ou meio de Castaeda gar chocolate enriquecido gar chocolate de cavalo Meio especfico BCYE* gar sangue, gar chocolate Iincubao 7 dias 5 a 15d At 30d 7 dias 48-72h at 7d 7 a 14 d 24 a 72h

*agar extrato de levedura, carvo, com pirofosfato frrico e alfa-cetoglutarato.

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2. Bartonella A classificao taxonmica dos membros do genero Bartonella ainda no definitiva e agrupa as espcies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis. B. bacilliformis - o agente etiolgico da verruga peruana (febre de Oroya), doena restrita aos Andes, caracterizada por profunda anemia, trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delrio, coma e alta mortalidade. B quintana - causa de doena febril que atacou soldados na I Gerra Mundial, conhecida como febre das trincheiras e relacionado a picada de piolhos e baixa higiene. Caracterizada por febre e bacteremia com durao varivel e ainda no bem conhecida.Casos associados infeco por HIV foram relatados. B. henselea pode apresentar quadro de bacteremia principalmente em

imunossuprimidos bem como relacionada doena da arranhadura do gato. O quadro de bacteremia caracteriza-se de forma insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de peso e com febre progressiva . A doena da arranhadura do gato manifesta-se inicialmente com uma ppula ou pstula cerca de uma semana no local de contato com animal (gato ou co novo que arranha ou morde) Aps 1 a 7 semanas aprece adenopatia regional1/3 dos pacientes apresentam febre e em 1/6 ocorre supurao do gnglio, sendo que a maioria evolui sem outros sintomas. A cura espontanea ocorre entre 2 a 4 meses. B. quintanae B. henselae podem causar quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferao neovascular envolvendo pele, gnglios e fgado. B. elizabethae ainda pouco conhecida. Afipia felis - foi considerada h alguns anos como o agente etiologico da doena da arranhadura do gato, que hoje atribuida B. henselae. Seu papel patognico no est bem esclarecido. 2.1. Isolamento - As bartonellas podem ser isoladas de hemoculturas, leses cutneas bipsias e gnglios.O SPS (polianetol sulfonato) que o anticoagulante usado nas hemoculturas inibidor das Bartonellas, porisso deve-se usar outro anticoagulante. Quando h suspeita clinica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, at 40 dias. Vrios meios enriquecidos podem permitir o crescimento das Bartonellas. O caldo infuso

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corao de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo so adequados, como tambm o agar chocolate. No Bactec pode crescer mas no aciona o alarme de CO2.Exigem umidade a 35-37oC por 3 a 4 semanas. B. bacilliformis e Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30oC. 2.2. Identificao - Colnias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material.So bacilos Gram negativos pequenos, as vezes curvos. As espcies quintana e henselae, que so mais isoladas so caracterizados pelas seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lmina presente e que no devida a flagelos (no tem), mas a fmbrias, percebendo-se a agitao da clula. O perodo de incubao que longo (> que sete dias) e a B henselae bem aderente ao meio. Tabela 3 - Provas para diferenciao de espcies de Bartonella e de A.felis
Prova Catalase Oxidase Uria Flagelo motilidade baciliformis + neg neg + + neg neg +* quitanae neg neg neg neg +* henselae elizabetae neg neg neg neg neg + + + + A. felis

Motilidade por fmbrias

3. Bordetella O genero Bordetella compreende as espcies B. pertussis, responsvel pela coqueluche ou tosse comprida, B. parapertussis, com quadro clnico semelhante a coqueluche, mas em geral menos severo. Ambas so patgenos exclusivos dos humanos. A B. bronchiseptica e B. avium so bactrias comensais de mamferos e aves, causando a primeira infeces em ces (tosse dos canis) e a B. avium rinotraquete em perus. So patgenos oportunistas para humanos que entram em contato com estes animais. Foram classificadas mais recentemente para o Genero Bordetella as espcies holmesii e hinzii. 3.1. Identificao - as Bordetellas so, cocobacilos Gram negativos pequenos e aerbios estritos. A safranina deve ser corada pelo Gram durante 2 minutos para melhorar a

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colorao. Para B. pertussis e parapertussis os Laboratrios de Referncia devem dispor de identificao sorolgica para acelerar a identificao. 3.2. Clnica da coqueluche - A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianas no vacinadas, com clnica bastante caracterstica: Perodo prodrmico, que inicia 5 a 10 dias aps a aquisio do agente, com sintomas semelhantes a um resfriado ou gripe. Fase altamente contagiosa e com sintomas inespecficos. Segue-se o perodo paroxstico com quadro de tosse convulsiva, persistente e caracterstica seguida de inspirao ruidosa. Podem ser acompanhadas de cianose e vmito e vrias complicaes como convulses, insuficincia respiratria, encefalopatia, infeces secundrias, etc. A convalescena ocorre cerca de quatro semanas aps inicio dos primeiros sintomas. Tabela 4 - Provas diferenciais para espcies de Bordetella
Provas/espcies Oxidase Motilidade Uria Crescimento em AS e ACH Cresc em B&G ou Regan-Lowe Crescimento em SS pertussis + neg neg neg + 3-6d neg para pertussis neg neg + em 24horas + + 2-3d neg bronchiseptica + + + em 4horas + + 1-2d + avium + +* neg + +1-2d + holmesii neg neg neg + +1-2d + hinzii + + v + +1-2d +

B. pertussis necessita de meio especfico: Bordet&Gengou (infuso de batata + glicerol + sangue de carneiro) o ou Regan Lowe. * mais evidente a 25 C AS = agar sangue ACH = agar chocolate

3.3. Material clnico / Semeadura e identificao - So adequados o swab ou aspirado de nasofaringe e semeadura imediata em meios especficos e em gar sangue para afastar B. pertussis. Na atualidade no se justifica dispor de meio de Bordet & Gengou ou outro, mas em caso de suspeita solicitar auxlio de Laboratrio de Referncia. Para frmula de meios de cultura vide manuais de fabricantes de meios de cultura. A prova de imunofluorescncia deve ser utilizada em material de nasofaringe juntamente com a cultura que mais especfica. 4. Brucella A brucelose uma doena de sintomas vagos, que cursa de forma insidiosa com febre baixa, calafrios, sudorese noturna, cefalia, mialgia e artralgia. Pode ser

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acompanhada na forma crnica de alteraes hematolgicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia, anemia hemoltica, etc. Est associado ingesto de leite e derivados e carne de mamferos, de modo que veterinrios, aougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue destes animais e acidentes em laboratrios. A hemocultura exige tempo superior a rotina de 5-7 dias de incubao. importante a informao mdica de suspeita clnica para orientar o laboratrio na pesquisa e caracterizao do agente. 4.1. Materiais clnicos - Sangue, aspirado de medula, aspirado e bipsia de gnglios, fgado, bao, LCR, etc. A partir do segundo dia de febre as hemoculturas podem ser positivas, ocorrendo tambm hemoculturas positivas em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o isolamento o mtodo de lise-centrifugao: a) Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de sdio a 4% b) Adicionar cerca de 40mL de gua destilada estril c) Centrifugar 2.000g por 30 minutos d) Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de gar sangue e semear Pode-se fazer o mesmo com LCR e aspirado de medula. Incubar 35oC em estufa entre 5 a 10% de CO2 (com gerador de CO2 ou estufa apropriada). 4.2. Isolamento e Identificao - As brucellas crescem bem em gar sangue, gar chocolate, Tripticase Soy Agar e Brucella agar. O crescimento visvel com 48 a 72 horas. Colnias so pequenas, brancas a creme, e ao Gram visualiza-se cocobacilos bem finos e pequenos. So aerbio OF oxidativos, crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, gar sangue, gar chococolate, mas no no Mc Conkey. Espcies mais importantes so: melitensis, abortus, suis e canis uria positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h) no meio uria de Christensen H2S com tira de acetato (+) = B.abortus e de B.suis (biotipo 1) Necessidade de CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis

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Tabela 5- Provas diferenciais entre cocobacilos Gram negativos

Teste/ Bactria Brucella spp Bordetella bronchiseptica Acinetobacter spp Moraxella phenylpyruvica Pasteurella spp* Haemophilus influenzae

Oxidase Motilidade Uria Crescimento em AS MC

+ neg + + neg

+ + + + Neg

neg neg Var + +

+ neg + + +

+ neg Var + neg

+ neg var neg neg

cresce no TSI como fermentador acidificando pice e base sem gs.

Considerando que a Brucella de dificil caracterizao em laboratrio no especializado, encaminhar a laboratrio de referncia para confirmao. Suspeitar quando houver quadro clnico sugestivo, obtendo-se isolado de sangue ou medula, crescimento de cocobacilos finos pouco corados, oxidase e catalase positivos, que crescem lentamente em gar sangue ou chocolate. Soroaglutinao util como elemento da caracterizao.

5. Francisella tularensis
um coco-bacilo pequeno, Gram negativo, imvel e pleomrfico, aerbio estrito e capsulado. Apresenta grande resistncia no meio ambiente, sobrevivendo semanas em meios midos, carcaas de animais, gua, lama, etc. Constitui o agente da tularemia, uma doena de animais selvagens e com vrios vetores hematfagos. transmitida principalmente por carrapatos, mas tambm por mosquitos e nos Estados Unidos prevalece o biovar A que mais grave. No hemisfrio sul prevalece o biovar B que apresenta forma clnica mais leve, sendo pouco diagnosticada principalmente por desconhecimento do agente. 5.1. Fontes e transmisso direta - Centenas de animais selvagens e incluindo alguns domsticos (incluindo ces, gatos e pssaros) podem ser portadores deste agente. Cerca de uma dezena de diferentes insetos servem de vetores. A transmisso pode ocorrer tambm em contato direto com animais pela mordida, sangue, carne contaminada e eventualmente gua e inalao de aerossis.

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5.2. Quadro clnico - extremamente infectante, devendo ser manipulado em cabine de segurana nivel 2 para material clnico e nvel 3 para culturas positivas. Bastam 10 microrganismos injetados por via subcutnea ou 25 inaladas para causar a doena. Logo aps a penetrao do agente, em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes a gripe: febre, tremores, cefalia e dor generalizada. Aps perodo de incubao de 2 a 10 dias forma-se uma lcera no local de penetrao, que pode durar meses. Os gnglios regionais aumentam e ocorre necrose. Se ocorrer invaso sangunea, o quadro de endotoxemia tpico se manifesta. Estes casos so pouco freqentes e ocorrem quando h grande inoculao ou paciente imunocomprometido. A mortalidade alcana 60%, ocorrendo toxemia, cefalia intensa, febre elevada e contnua, com delirios, prostrao e choque. A forma ulcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A lcera endurada, eritematosa, que no cicatriza. Outras formas relatadas so oculoganglionar, em orofaringe, ganglionar sem lcera,, pleuropulmonar e gastrointestinal. 5.3. Material para isolamento - Os materiais que oferecem maior chance de positividade so a partir de raspados de lceras, biopsiase escarro. A Francisella cresce em agar chocolate suplementado com Isovitalex . Laboratrio de Referncia deve ser consultado sobre recursos disponveis ou encaminhamento de cepas suspeitas. 5.4. Diagnstico microbiolgico - A bacterioscopia de material clnico de leses ou bipsias raramente ajuda, pois o microrganismo muito pequeno e cora-se mal pelo mtodo de Gram. Este agente deve ser lembrado sempre que houver doena associada a picada de carrapato e formao de lcera com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diagnstico microbiolgico difcil, sendo na maioria das vezes feito com base em testes de aglutinao em amostras pareadas colhidas com intervalo de 2 a 3 semanas e congeladas a -20oC.

6. Haemophylus
6.1. Importncia clnica - Diferentes espcies pertencentes ao genero Haemophilus podem ser encontradas como flora normal da nasofaringe e orofaringe, chegando a 50% da populao geralmente cepas no capsuladas, embora tambm cepas do H. influenzae b possam apenas representar colonizao(rara nos adultos e cerca de 5% nas crianas).

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Para considerar o isolamento de Haemophilus papel patognico fundamental associar clinica . Vrias so as infeces causadas por H. influenzae, sendo por H. influenzae do tipo b as cepas mais virulentas, entretanto a partir da dcada passada, com a disponibilidade de vacinao, houve uma drstica reduo na importncia desta bactria nas populaes vacinadas. Doenas causadas pelo H. influenzae b principalmente na infncia: Meningite, Epiglotite, Pericardite, Pneumonia, Artrite sptica, Osteomielite, Celulite facial, Raramente: peritonite e infeco urinria em crianas menores que cinco anos. Doenas causadas por cepas no b e no tipveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doena de base predisponente como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC, etc.): Traqueobronquite e pneumonia, Bacteremia, Conjuntivite, Ootite (2a causa depois do pneumococo), Sinusite. 6.2. Haemophilus aphrophilus - Importncia clnica Microbiota do trato respiratrio superior, especialmente em placas dentrias e sulco gengival. Endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia esto associados a este agente, particularmente em pacientes com comprometimento imunolgico. No necessariamente a endocardite est relacionada leso valvular prvia, mas a associao com embolia arterial freqente nestes casos. Existem relatos tambm de isolamento em otites, sinusites e epiglotites, etc. 6.3. Haemophilus ducrey - o agente do cancro mole, sendo na atualidade raramente isolado, pela menor incidncia da doena, contaminao das leses com flora genital e frequente uso prvio de antibiticos. Colhido de ulceras genitais, removendo-se previamente a secreo superficial ou lavando com salina estril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer esfregao a ser corado pelo Gram. Em geral de difcil cultivo. Emprega-se gar chocolate de cavalo com base GC ou Mueller Hinton. A colocao de um disco de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram positivas. bacterioscopia aparecem cocobacilos Gram lbeis agrupados e cadeias como cardumes.

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Identificao de espcies de Haemophilus: Anaerbio facultativo No crescem no TSI e no OF-Glicose O melhor meio de cultura para Haemophilus influenzae o gar chocolate com sangue de cavalo. A base GC usada para Neisserias indicada, embora os hemfilos cresam com outras bases como Columbia e Mueller Hinton. H necessidade de umidade e CO2 entre 3 a 5% para o H. influenzae e H.aphrophilus. O gar chocolate suporta muito bem o crescimento dos Haemophilus, mas para outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de crescimento (vitox, isovitalex ). As diferentes espcies de haemfilos podem dar reao de oxidase positiva fraca e demorada (cerca de 25 a 20 segundos). Em amostras de LCR pode ser til a aglutinao com partculas de ltex, mas a confirmao bioqumica e sorolgica em laboratrio de referncia necessria. antibiograma realizado em meio padronizado HTM (vide meios de cultura). As provas para caracterizao dos hemfilos so: Tabela 6 - Principais provas para diferenciar algumas espcies de Haemophilus
Exige fator X Exige fator V

Haemophylus

hemlise

uria

Indol

Glic

Sac

Lac

catalase

influenzae haemolyticus parainfluenzae ducrey aphrophilus

+ + neg + neg

+ + + neg neg

neg + neg fraca neg

Var + var neg neg

var var var neg neg

neg + + neg +

neg neg + neg +

neg neg neg neg +

+ + var neg neg

Obs.: vide leitura de fatores X e V

Glic = glicose Sac = sacarose

Lac = lactose Var = varivel neg = negativo

Verificar hemlise em gar sangue de cavalo Fermentao de aucares com base CTA e 1% de aucar adicionado de fator X e V (vide meios de cultura)

Tcnica para testar fatores X e V: a) usar meio agar tripticase soja ou BHI agar b) discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e V=NAD ou coenzima I.

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c) semear a bactria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pina a uma distncia de 1,5cm um disco do outro. Flambar a pina antes e aps a retirada de cada disco. d) aps 24h de incubao em jarra com vela e umidade a 35oC, verificar crescimento prximo aos discos: Haemophilus influenzae - Crescimento entre os discos (exige X e V)

Haemophilus parainfluenzae Exige fator X

Haemophilus ducrey Exige fator V

Isolamento - No isolamento primrio no agar chocolate as colnias costumam ser pequenas de cor beje claro, com odor caracterstico. No agar sangue ocasionalmente pode-se detectar o crescimento em torno de colnias de Staphylococcus aureus , que produz o fator V e utilizada como prova alternativa utilizao dos discos e denominada prova do satelitismo. Prova do satelitismo: Tcnica - Semear com swab uma suspenso em salina cerca de 1 a 2 da escala Mac Farland no centro de uma placa de gar sangue de carneiro. Semear em uma nica estria um repique de S. aureus hemoltico (ATCC 23922). Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2. Verificar crescimento de colnias pequenas prximas a zona de hemlise do estafilococo. Encaminhar cepas isoladas de lquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericrdico) a Laboratrios de referncia para confirmao e sorotipagem.

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6.4 H. aphrophilus - Crescem bem em gar chocolate no isolamento primrio e em gar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigncia de fatores X e V, mas as colnias so muito pequenas de cor amarelada, cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualizao. Em caldo tem a caracterstica de aderir as paredes do tubo, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. No crescem em Mac Conkey. Para todos os hemfilos fazer o teste da beta-lactamase para verificar a resistncia penicilina

7. Legionella :
7.1. Importncia clnica - Pneumonia com ou sem sepsis a manifestao clinica mais importante, podendo ocorrer infeces de partes moles e sinusite. Est em geral associada a surtos cuja fonte a gua contaminada com este agente. Largamente distribuda na natureza em ambiente mido e gua potvel e ocasionalmente em chuveiros. Esta associada a presena de outras bactrias e amebas de vida livre na gua. A presena de bactrias do genero Legionella em material clnico humano est invariavelmente associado doena clnica. 7.2. Espcies e Manifestaes clnicas - Existem algumas dezenas de espcies de Legionella sendo a espcie mais importante a L. pneumophila, sorogrupos 1 e 6. A doena pode ser sub-clnica, forma no pulmonar, pneumonia e doena extra-pulmonar. A forma no pulmonar tem perodo de incubao curto (horas a dias), sendo auto-limitada e sem evidncias radiolgicas de comprometimento pulmonar. Sintomas: febre, mal-estar, mialgia e tosse. A pneumonia a forma mais freqente de manifestao da doena, acompanhada dos mesmos sintomas acima descritos para a forma no pulmonar e em geral com tosse no produtiva. A doena apresenta rpida progresso e nos casos graves a formao de abscessos so sugestivos da legionelose. Bacteremia comum e comprometimento dos mais variados orgos e tecidos j foram descritos. 7.3. Recursos diagnsticos mais utilizados - cultura, Imuno-fluorescncia e aglutinao pelo ltex. a) Cultura - Meio enriquecido: cresce em meio suplementado com extrato de levedura, lcisteina, sais de ferro e alfa-cetoglutarato em meio denominado BCYEa ou BCYE e seu

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crescimento favorecido pela incubao em 5% de CO2. Para materiais com microbiota, como para secreo traqueal e escarro, acidificar o meio por 15 minutos a pH2,0 com tampo cido(0,2M HCl e 0,2M KCl) e em seguida neutralizao a pH 7,0 com KOH 0,1N. b) Meio seletivo - recomenda-se uso de meio seletivo adicionando ao meio BCYE os antibiticos: polimixina B, cefamandol e anisomicina ou vancomicina, polimixina B e anfotericina B. Colnias azuladas ou esverdeadas c) meio diferencial BCYE - adicionado de glicina, vancomicina, prpura de bromocresol; e azul de bromotimol. Apresenta as seguintes caractersticas: L. pneumophila (branco esverdeado), L. micdadei (colnias azul claro ou acinzentadas), Outras legionelas (colnias verde bem claro). Crescem bem no frasco utilizado pelo BACTEC. d) Materiais recomendados: Escarro Aspirado traqueal e outros que neste caso especfico esto indicados como teis Lavado/escovado brocoalveolar Bipsia pulmonar ou outros tecidos e aqueles obtidos em autpsia. LCR e outros lquidos de derrame. Urina (pesquisa de antgenos) conservar a -20oC Para transporte: usar frasco estril com gua destilada estril mas no salina que pode inibir o cultivo. Sempre que possvel concentrar os materiais por centrifugao, evitando formar aerossis. 7.4. Identificao - So bacilos Gram negativos finos que se coram fracamente pela fucsina e safranina do Gram. Em repiques tornam-se filamentosos. Provas: Aerbio estrito No primo isolamento a l-cystena imprescindvel. No meio BCYEa o crescimento pode ser observado a partir do 3 ao 5 dia a 35oC. Semear o material em gar sangue como controle, e a Legionella no dever crescer. Aguardar 14 dias para descartar as culturas quando negativas.

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Tabela 7- Sensibilidade e especificidade de recursos diagnsticos para legionelose

Teste Cultura Aglutinao pelo ltex Imunofluorescncia indireta Sensibilidade 70% 55-90% 70-80% Especificidade 100% 85-99% >95% Util com cultura ou fins epidemiolgicos Observao Mtodo de escolha

7.5. Caractersticas da L. pneumophila - oxidase positiva fraca, catalase positiva, no sacaroltico (No oxida nem fermenta os aucares), motilidade (+), gelatinase (+) e

hidrlise do hipurato (+).Sensvel a macroldeos, rifampicina, sulfatrim e quinolonas. A identificao com base em testes difcil. O suspeita deve ser baseada na clnica, no aspecto da colnia, crescimento em meio BCYEa, dependncia da l-cysteina, ausncia de crescimento em gar sangue e agar chocolate no suplementados. A imunofluorescncia direta, com amostras clnicas utilizadas para cultura , um mtodo complementar para diagnstico da legionelose. Encaminhar cepas suspeitas a Laboratrio de referncia para confirmao

8. Pasteurella
A infeco pela Pasteurella constitui uma zoonose, pois trata-se de bactria microbiota de boca e trato respiratrio superior de mamferos e aves. As diferentes espcies esto associadas a infeces humanas relacionadas a mordida dos respectivos animais ou outros tipos de contato com sangue, carne, carcaa, etc. A P. multocida a espcie mais comumente isolada em material clnico humano, em geral associada a mordida ou arranhadura de ces e gatos. Caracterizam-se pela formao de abscessos ou celulite e eventualmente osteomielite. Infeces respiratrias podem ocorrer, incluindo pneumonia lobar, com ou sem derrame e empiema. Em pacientes imunocomprometidos, com cirrose, neoplasias, podem apresentar bacteremia e septicemia. 8.1. Diagnstico de zoonoses - Para facilitar o isolamento e identificao da Pasteurella muito importante a descrio clnica, pois na suspeita de zoonoses importante lembrar de: brucelose, pasteurella, micobacterioses, tularemia, leptospirose, yersiniose, etc.

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Tabela 8 - Principais espcies de Pasteurella e doenas relacionadas

Bactria P. multocida P. pneumotropica P. haemolytica P. aerogenes P. dagmatis (n. sp1) Doenas Relacionadas Microbiota do trato respiratrio de mamferos e aves (domsticos e silvestres, encontrado na boca de cerca de 50% dos ces e gatos). Pode causar infeces em mamferos e diarria em aves. Trato respiratrio de roedores, ces, gatos, etc Infeces pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos. Microbiota do trato intestinal de suinos Trato respiratrio de ces e gatos

8.2. Caracterizao microbiolgica: Cocobacilo Gram negativo ou bacilos podem ser capsulados Anaerbio facultativo (fermentador) TSI cido/cido Oxidase positiva - em colnias isoladas em gar sangue ou agar chocolate Catalase positiva; Motilidade (neg) Indol(+) Sacarose(+) Muitas espcies so ornitina positivas Tabela 9 - Provas diferenciais das espcies mais importantes de Pasteurella:
Pasteurella spp de importancia clnica
Espcie / Teste multocida pneumotropica haemolitica aerogenes dagmatis hemlise neg neg pos
1

M Conkey neg var var + neg

Indol + + neg neg +

Uria neg + neg + +

Ornitina + + var var +

OF Glicose F sem gs F g var F sem gs F sem gs F com gs

neg neg

Todas so oxidase +, catalase + , fermentadoras da glicose Obs: 1 = 72%

A P. multocida cresce bem em gar sangue de carneiro e gar chocolate, formando pequenas colnias acinzentadas. No cresce em gar Mc Conkey. Tem odor forte caracterstico e podem ser diferenciadas entre si por poucas provas (vide tabela acima), mas dependendo do animal fonte, outras espcies menos freqentes podem estar envolvidas.

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Quadro 2- Grupo B (casos clnicos espordicos / microbiota oral humana)

Bactria Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Capnocytophaga spp Chromobacterium violaceum Eikenella corrodens Kingella spp Streptobacillus spp Fonte Cavidade Oral humana Cavidade oral humana Cavidade oral humana gua e solo Cavidade oral humana Cavidade oral humana Boca de roedores

GRUPO B DE FASTIDIOSOS - As caractersticas deste grupo heterogeneo so: dificuldade ou ausncia de crescimento em meios ricos como AS e A. chocolate, exigncia de incubao em diferentes tenses de CO2, dificuldade em caracteriz-los pois exigem meios enriquecidos , crescimento lento e pouca importncia clnica, talvez pela dificuldade do seu

isolamento e caracterizao. Os generos Actinobacillus, Capnocytophaga e Eikenella tem em comum o fato de pertencerem microbiota da cavidade oral humana e estarem relacionados a doenas gengivais e a partir deste foco doenas sistmicas. Kingella e Cardiobacterium esto associadas ao trato respiratrio humano. Diferem deste grupo a Chromobacterium que encontrada na natureza em gua e solo e Streptobacillus na orofaringe e nasofaringe de camundongos selvagens e de laboratrio.

9. Actinobacillus
So habitantes das mucosas do trato respiratrio e urinrio de humanos e animais. As trs espcies mais importantes so: A. actinomycetemcomitans, A. urea e A. hominis. O primeiro est relacionado doena periodontal e particularmente periodontite juvenil localizada, bem como com endocardite e abscesso cerebral, oriundos da boca. A doena periodontal est associada endocardite pelos seguintes agentes: A. actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, E. corrodens e Kingella spp. As outras espcies de Actinobacillus so patgenos oportunistas e causam raramente infeces do trato respiratrio e bacteremia.

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9.1. Caracterizao - So cocobacilos Gram negativos ou pequenos bacilos que crescem em aerobiose, umidade e 5 a 10% de CO2 ou anaerobiose em ar sangue e gar chocolate. Recomenda-se adicionar suplementos com vitaminas e sangue lisado de carneiro ou cavalo ao gar chocolate. As colnias ficam bem visveis com 48 a 72 h de incubao, so branco acinzentadas, com um pregueamento no centro, fortemente aderentes ao meio e pegajosas no primo isolamento. Tabela 10 - Principais caractersticas das bactrias fastidiosas analisadas
Bactrias Actinobacilus Cardiobacterium Eikenella Kingella Capnocytophaga Streptobacillus Caractersticas Principais Cocobacilus a bacilos longos, anaerbios facultativos, colnias cinza, aderentes ao meio, com centro da colnia enrugado Bacilos que podem apresentar formas semelhantes gota dgua Cocobacilos com extremidades arredondadas, cheiro de gua clorada, colnias podem corroer o meio Pequenos cocobacilos Fusiforme e curvo, colnias crescem espalhadas Filamentos longos

Chromobacterium Pode ter forte pigmento violeta, cresce em Mc Conkey

Tabela 11 - Provas diferenciais entre os principais fastidiosos

Testes / Bactrias Oxidase Catalase CO2 MC uria Indol Glicose TSI motilidade Actino1 baci lus neg ou +f + + var neg neg + ac / ac neg Capnocitophaga neg * neg * + neg neg neg + n cresc.** neg Eikenella + neg + neg neg neg neg alcalino neg Kingella + neg + neg neg neg + alcalino neg Cardiobacterium + neg + neg neg + + ac / ac neg Streptobacilus neg neg + neg neg neg + n cresce neg Chromobacterium var + neg + neg neg + alc / ac +

+ ou - = 80% ou mais das provas positivas ou negativas ac = cido alc = alcalino 1 A. actinomycetemcomitans * Origem humana. As de origem animal so oxidade e catalase positivas. ** Pode acidificar lentamente var = varivel + = positivo neg = negativo

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10. Capnocytophaga
As espcies de Capnocytophaga gingivalis, granulosa, haemolitica, ochracea e sputigena fazem parte da mirobiota da cavidade oral humana, enquanto outras espcies podem ser encontradas na boca de animais domsticos. O isolamento de

Capnocytophaga

ocorre com maior freqncia em bacteremias nos pacientes

neutropnicos com mucosite mas esto tambm implicadas na doena periodontal juvenil (gengivalis e ochracea), periodontite em adultos (sputigena) e isoladas em placas dental supragengival em adultos (granulosa e haemolytica). As doenas localizadas (ceratites, abscessos e endoftalmites), bem como doenas sistmicas (septicemia, endocardite, osteomielite, etc.) ocorrem em pacientes imunocomprometidos ou no. 10.1. Morfologia e Cultivo - A morfologia da Capnocytophaga bem caracterstica, facilitando a sua suspeita, pois lembra um Fusobacterium aerotolerante. Tem as extremidades afiladas e o centro mais largo, podendo ser encurvada e eventualmente cocoide. Para cultivo, crescem melhor com 5 a 10% de CO2 e em anaerobiose, o que pode confundir com o anaerbio estrito, se no for feita aprova de crescimento em aerobiose com CO2. Chama a ateno o fato de crescer melhor em gar sangue de carneiro que no gar chocolate sem suplemento de vitaminas. No crescem em Mac Conkey. O crescimento pode ocorrer com 24 a 72hs, a colnia chata e sua borda irregular; com maior incubao nota-se o espalhamento em torno da colnia, semelhante ao Proteus, mas em escala muito reduzida, cerca de 2 a 4 mm de dimetro. A espcie haemolytica apresenta hemlise discreta, a espcie ochracea tem cheiro de amndoas. 10.2. Identificao - as Capnocytophaga de origem humana so oxidase e catalase negativas, produzem cido a partir da glicose em caldo enriquecido com soro de coelho e inculo denso. Motilidade negativa, indol negativo, lisina, ornitina e arginina negativos. A maioria esculina positivo (gengivalis varivel e granulosa negativo). A diferenciao das espcies dificil. As amostras de origem animal (C. canimorsus e cynodegmi ) so oxidase, catalase e arginina positivos).

11. Eikenella
Tambm bactria da microbiota da cavidade oral humana e atribui-se participao em infeces periodontais, sendo encontrada na placa bacteriana

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subgengival em adultos com periodontite. Isolada em material de trato respiratrio inferior, abscessos de partes moles, sangue e fludos estreis infectados em casos de infeces pleuro-pulmonares, infeces ps-cirrgicas de parede, artrite, meningite, endocardite e septicemia. 11.1. Cultivo, Bacterioscopia e Identificao - anaerbio facultativo, mas cresce melhor com 5% de CO2, em gar sangue e chocolate, mas no em Mc Conkey. O crescimento lento, necessitando de 2 a 4 dias para boa visualizao das colnias. Em cerca da metade das cepas pode-se observar a corroso do gar, que sua caracterstica marcante e origem do nome. Produz um pigmento amarelo claro e tem odor de hipoclorito no gar sangue e agar chocolate. Na bacterioscopia so observados bacilos delgados ou cocobacilos gram negativos com extremidades arredondadas. E bioquimicamente caracteriza-se por ser oxidase positiva, catalase negativa, motilidade negativa, ornitina positivo, provas negativas de utilizao de carbohidratos, uria, indol e esculina.

12. Kingella
Especies de Kingella fazem parte do trato respiratrio e genito-urinrio humanos. K. kingae a espcie mais importante e um patgeno oportunista responsvel por casos graves de endocardite, osteomielite, septicemia, com provvel porta de entrada em leses da mucosa da orofaringe. A doena valvular pode estar ou no associada a doena cardaca prvia.A osteomielite ocorre com maior frequncia em crianas menores de 5 anos. Os quadros spticos podem ser semelhantes doena meningoccica. 12.1. Cultivo, Bacterioscopia e Identificao - A K. kingae cresce em gar sangue e gar chocolate com 5% de CO2, aps pelo menos 48h de incubao, mas no em Mc Conkey. Tem como caracterstica ser beta-hemoltica no gar sangue de carneiro, mas sem hemlise intensa. Pode crescer numa mesma placa de isolamento como colnias lisas e convexas ou fazendo corroso, colnias espalhadas como se fossem mveis. So cocobacilos que ocorrem aos pares ou cadeias curtas, podendo ser confundida com Neisseria spp. e bioquimicamente apresentam-se oxidase positiva, motilidade e catalase negativas e acidificam a glicose lentamente.

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Tabela 12 - Provas diferenciais entre os fastidiosos oxidase positivos e catalase negativos

Fastidiosos oxidase positivos, catalase, uria e esculina negativos Provas / Bactrias Hemlise Indol Ornitina Glicose C. hominis neg pos neg pos E. corrodens neg neg pos neg K. kingae pos neg neg pos

13. Cardiobacterium hominis

Cardiobacterium flora do trato respiratrio humano e ocasionalmente do trato urogenital. Esta associado quase exclusivamente a quadros de endocardite, precedidos de manipulao dentria. 13.1. Cultivo, Bacterioscopia e Identificao - Cresce em 3 a 5 dias em hemoculturas, mas no causa alteraes no meio (turvao, hemlise, pelcula, grumos, etc.). Cresce em gar sangue e gar chocolate mas no em Mc Conkey, em 3 a 5 dias em 5 a 7% de CO2. As colnias so branco-amareladas e podem manifestar um pequeno espraiamento da colnia simulando motilidade no agar como o Proteus e eventualmente a corroso do gar. So bacilos Gram negativos, podendo apresentar pleomorfismo com extremidades dilatadas como bulbos que podem reter corante violeta e com arranjos caractersticos em agrupamentos de rosetas e formas isoladas como gota dgua ou alteres. Deve-se observar estas caractersticas para no confundir com bacilos Gram positivos. Uma prova fundamental a produo de indol, que deve ser feita em caldo triptona, com inculo denso ,incubao de 48h e extrao com xilol e uso do reagente de Ehrlich.

14. Chromobacterium violaceum

Encontrada na natureza no solo e na gua e a infeco em geral esta relacionada a leses cutneas com estes elementos. Leses localizadas ou formas septicmicas graves com mltiplos abscessos tem sido esporadicamente relatados.Mais raramente diarria e infeco urinria.

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14.1. Bacterioscopia e Cultivo - Bacilo Gram negativo anaerbio facultativo, reto ou ligeiramente curvo, com extremidades arredondadas, isolados ou em arranjos aos pares ou cadeias curtas. Diferente da maioria dos fastidiosos, cresce alm do gar sangue e chocolate, tambm em Mc Conkey. Caracterstica colnia convexa, lisa e de cor violeta forte, embora algumas variantes sem cor possam ocorrer. Algumas cepas podem ser levemente hemolticas no gar sangue.

15. Streptobacillus moniliformis

Encontrado na nasofaringe e orofaringe de ratos, camundongos e outros roedores domsticos como a cobaia e as infeces esto relacionadas a mordida destes roedores ou ingesto de leite ou alimentos contaminados. A febre por mordedura do rato apresenta clnica bem definida com perodo de incubao de cerca de 10 dias, incio abrupto, com febre elevada, tremores, cefalia intensa, vmitos e artralgia migratria. Rash semelhante ao sarampo erupes maculopapulares podendo ser pustulosa, com petquias ou prpuras ocorrer nas extremidades incluindo regio palmar e plantar. Complicaes graves podem ocorrer como endocardite, pericardite, septicemia, abscesso cerebral, etc. Sem tratamento pode evoluir favoravelmente em 2 semanas ou pode se tornar crnica e a mortalidade chega a 10%. 15.1. Bacterioscopia e Isolamento - um bacilo Gram negativo muito pleomrfico, podendo ter em culturas mais velhas de 1 a 150m de comprimento (habitualmente bactrias tem de 1 a 3m), com eventuais dilataes como um colar de prolas, sem apresentar ramificaes, quebrando em formas cocobacilares. Em culturas jovens pode ter morfologia mais uniforme. O isolamento feito de hemocultura, aspirado de derrames (devem ser centrifugados para concentr-los) e abscessos. 15.2. Meios de cultivo - Colher sangue para hemocultura com citrato. No se deve usar hemoculturas com SPS que inibidor do S. moniliformis. Cultivar em meio bifsico TSA/TSB ou gar infuso corao ou caldo infuso corao, suplementados com 10% de soro de cavalo ou 15% de soro de coelho, e 0,5% de extrato de levedura. Incubar em jarra de anaerobiose ou 10% CO2 a 35-36oC e umidade. Aps cerca de trs dias crescem colnias cinzas de 1-2mm de dimetro, consistncia butirosa podendo surgir colnias variantes com aparncia de ovo frito como micoplasmas. Em caldo de cultura crescem em 2 a 3 dias com aparncia de bolas de pelo.

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As provas bioqumicas exigem a adio de soro de cavalo ou coelho para suportar o crescimento. So oxidase, catalase, indol e uria negativos; e positivos para esculina, H2S com a prova da tira de acetato de chumbo e hidrlise da arginina. Acidifica lentamente a glicose em base CTA com 0,5% de soro de cavalo.

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Captulo 9 - BACTRIAS ANAERBIAS ESTRITAS

1. INTRODUO Existe um grupo de bactrias, que produzem patologia no ser humano, e que no tem capacidade de multiplicar-se em presena do oxignio atmosfrico. E mais, para muitas espcies destas bactrias o oxignio deletrio. Estas bactrias so chamadas de anaerbios estritos, para diferenciar dos chamados anaerbios facultativos, que tm a capacidade de desenvolver seus processos metablicos, tanto em presena como na ausncia do oxignio. A maior parte das bactrias patognicas do ser humano so anaerbios facultativos e as famlias: Micrococaceae, Streptococaceae,

Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, so exemplos destes microrganismos. Os anaerbios estritos esto constitudos por numerosas famlias, gneros e espcies com caracteres morfolgicos como H2O2 que se formam em presena de oxignio e que podem ser txicos;, bioqumicos e antignicos muito diferentes. So estudados em captulo separado porque a metodologia para seu isolamento e identificao laboratorial prpria deste grupo, e porque produzem alguns tipos especiais de processos patolgicos no ser humano. Existem vrias teorias que tentam explicar esta susceptibilidade dos anaerbios estritos ao oxignio. Entre elas pode-se citar as seguintes: - o oxignio seria um txico direto para a bactria anaerbia; - as bactrias anaerbias estritas no tm a enzima catalase que impede a formao de grandes quantidades de perxidos - o oxignio altera enzimas bacterianas importantes no metabolismo (oxida, por exemplo, enzimas que contm SH); - as bactrias anaerbias estritas no possuem a enzima superxido dismutase, capaz de transformar o radical o que altamente txico para a bactria. Existem vrios argumentos a favor ou contra estas teorias. Provavelmente mais de um destes fatores seja importante para explicar a ao deletria do oxignio nestas bactrias. Esta labilidade dos anaerbios estritos ao oxignio explica a dificuldade existente nos laboratrios para seu isolamento e estudo. Por este motivo tambm, boa parte das infeces provocadas por estes microorganismos no eram diagnosticadas at

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a dcada de 1970, quando foram desenvolvidos procedimentos prticos de laboratrios para criar atmosferas de anaerobiose. Assim, eram diagnosticadas com maior freqncia as infeces provocadas pelos microorganismos mais resistentes dentro deste grupo, os esporulados do gnero Clostridium. Hoje sabemos que as infeces por Clostridium so menos freqentes que as infeces provocadas por outros gneros de bactrias anaerbias. Um fato que tambm merece ser destacado, para explicar a freqncia com que estas bactrias provocam infeco, que os anaerbios estritos so habitantes normais do organismo humano, ultrapassando em nmero os aerbios e anaerbios facultativos. Assim, os anaerbios estritos esto em propores 5 a 1000 vezes maiores que os anaerbios facultativos na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato respiratrio superior e genital feminino. Quando existem fatores predisponentes estas bactrias provocam processos patolgicos em diferentes rgos e sistemas. Por este motivo, a maior parte das infeces provocadas pelas bactrias anaerbias estritas so infeces chamadas endgenas. a prpria microbiota bacteriana do doente que em determinado momento provoca o processo infeccioso, sendo este tipo de infeco pouco ou no contagioso. As infeces provocadas pelo gnero Clostridium so fundamentalmente adquiridas a partir do meio ambiente externo e por este motivo so chamadas de infeces exgenas. Nas mucosas, onde os anaerbios estritos formam parte da flora normal, existem condies locais de anaerobiose. Estas condies so provocadas por compostos orgnicos, enzimas, restos celulares e bactrias anaerbias facultativas que baixam o potencial redox nestes locais. Neste sentido devemos assinalar que estas bactrias toleram pequenas quantidades de oxignio. As mais estritas crescem em atmosferas com 0,5% de oxignio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas podem crescer ainda em concentraes de at 8% de oxignio. Como as bactrias anaerbias facultativas e aerbias favorecem a mutiplicao dos anaerbios, por consumirem o oxignio existente no local e talvez por produzirem alguns fatores de crescimento como substncias secundrias do seu metabolismo, a maior parte das infeces por bactrias anaerbias estritas so infeces mistas. Assim, so freqentes as infeces conjuntas com Enterobactrias, Pseudomonas e

Staphylococcus aureus. .

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Alguns aspectos clnicos fazem suspeitar uma infeco com envolvimento de bactrias anaerbias, sendo os principais estes abaixo relacionados: Secreo ftida Infeco nas proximidades de superfcie mucosa Tecido necrtico Presena de gs em tecidos ou secrees Tromboflebite sptica Colorao negra em secreo com sangue Infeco decorrente de mordida humana ou de animal Presena de grnulos de enxofre nas secrees Teraputica prvia com aminoglicosdeos Gangrena gasosa Uma leso com aspecto de um micetoma e a observao de grnulos de enxofre no pus obtido so caracterstica de uma infeco por Actinomyces. A infeco por anaerbios secundria a uma mordida de animal ou do ser humano explicada pela existncia de um grande nmero destas bactrias na cavidade oral destes hospedeiros. Associados a estes elementos clnicos, existem alguns outros, laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma infeco por anaerbios estritos: Ocorrncia de formas pleomrficas na colorao de Gram (como regra geral, os anaerbios so mais pleomrficos que os aerbios e anaerbios facultativos). Observao no material, de bacilos gram-positivos esporulados que fazem pensar em Clostridium. Presena de bactrias no Gram direto, que no crescem nos meios mantidos em atmosferas de aerobiose. Crescimento de bactrias somente na parte inferior de tubos com meios de cultura lquido ou semi-slido. 2. FATORES PREDISPONENTES Uma variedade de condies predispe um indivduo a desenvolver infeco por anaerbios. Podemos generalizar dizendo que todos os fatores que fazem diminuir a

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quantidade de oxignio nos tecidos, e, portanto o potencial de oxi-reduo dos mesmos, favorecem a infeco por anaerbios estritos. Entre estes fatores podemos assinalar como mais freqentes os seguintes: Diminuio do fluxo sangneo. Presena de reas necrticas. Corpos estranhos. Acmulo de sais endgenos (por exemplo, pontos de calcificao). Infeco por bactrias aerbias ou anaerbias facultativas Manipulaes cirrgicas. Esterilizao intestinal pr-operatria. Tumores, processos orgnicos ou caseosos. Um baixo potencial de oxi-reduo facilita o crescimento de bactrias anaerbias e a causa clnica mais comum de diminuio do potencial redox a anxia dos tecidos resultante de leso vascular, compresso, hipotermia, choque, edema e outras condies levando m perfuso. Quanto s doenas sistmicas ou condies gerais como corticoterapia, teraputica de tumores, leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses, diabetes, esplenectomias embora relacionadas como predisponentes, no h evidncia concreta de que realmente estejam associadas maior incidncia de infeco por anaerbios.

3. PROCESSAMENTO DOS MATERIAIS PARA ISOLAMENTO DE ANAERBIOS 3.1. Coleta de material - As amostras devem ser colhidas de forma que no entrem em contato com oxignio e no se contaminem com bactrias anaerbias da flora normal. Por este motivo devem ser aspiradas com seringa, da qual eliminado o ar imediatamente aps a obteno da amostra. O material no pode ser colhido com zaragatoa (swab). Para evitar a contaminao pelos anaerbios da flora normal, no devem ser semeados escarro, secreo farngea ou nasal, secrees vaginal, fezes ou material de colostomia, pois estes materiais sempre tm bactrias anaerbias. Idealmente, as bactrias anaerbias estritas so pesquisadas em lquidos aspirados de cavidade fechadas, material obtido por

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aspirao profunda de feridas, puno de traquia ou pulmonar e sangue para hemocultura. Em resumo, serve qualquer material que no esteja normalmente contaminado com as bactrias anaerbias da flora normal. 3.2. Transporte do material ao laboratrio - O transporte pode ser feito com a mesma seringa com que foi colhido o material. Obviamente que este transporte deve ser o mais rpido possvel. O melhor que a mesmo profissional que colheu leve imediatamente a seringa ao laboratrio. Tambm pode ser empregado, com este fim, um vidro do tipo de penicilina, que contm meio de tioglicolato de sdio ( 7 ml). O tioglicolato um sal redutor, de forma que no interior do meio existem condies de anaerobiose. A este meio lquido pode acrescentar-se uma pequena quantidade de gar (0,5%) para transform-lo em um meio mais espesso, o que dificulta a difuso de oxignio. O meio tem um indicador de oxigenao que a rezarsurina, de modo que se por algum motivo existe oxigenao do mesmo, o indicador adquire cor rosa. O material aspirado inoculado do interior do meio de cultura, atravs da tampa de borracha. Especial cuidado deve ter-se para no agitar o meio, antes e depois da inoculao, para evitar sua oxigenao. As amostras colhidas neste meio podem ser encaminhadas ao laboratrio vrias horas aps sua inoculao (at 24 horas). 3.3. Processamento do material no laboratrio - Sempre feita uma colorao de Gram e de esporos, quando necessrio, da amostra recebida, o que pode orientar o clnico para o diagnstico e a teraputica precoce. Por exemplo, a observao num

processo com aspecto de gangrena gasosa de bacilos gram-positivos, grandes esporulados, quase confirmao do diagnstico de Clostridium e de gangrena gasosa. A existncia de poucas ou muitas bactrias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previamente a amostra em um caldo ou fazer diretamente a semeadura em placa. Quando o material vem numa seringa, a semeadura feita em tioglicolato e em placa. Quando o material j vem no meio de tioglicolato, feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os meios.

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3.4. Produo de anaerobiose - Existem vrios procedimentos para conseguir no laboratrio uma atmosfera de anaerobiose adequada multiplicao das bactrias anaerbias produtoras de patologia no ser humano; por exemplo: uso de tubos com meios slidos pr-reduzidos; cmaras anaerbias (glove Box), nas quais o manipulador introduz s as mos, sendo o ar eliminado, colocando-se uma mistura de gazes (H2, CO2,N2); nestas cmaras existem todos os elementos necessrios para o trabalho bacteriolgico, incluindo estufas de incubao; sistema mais empregado bactrias. Existem diversos tipos de geradores. Os mais utilizados so os que provocam um consumo do oxignio com substncias redutoras como ferro reduzido ou cido ascrbico. Dentro da jarra colocada tambm uma fita de papel filtro impregnada de azul-demetileno, que um indicador de anaerobiose.Quando a atmosfera do interior da jarra tem condies adequadas de anaerobiose, o azul de metileno altera-se para uma cor branca. Numa jarra de tamanho mdio 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10 placas e muitos tubos. Com estes sistemas o contedo de O2 da jarra cai a 0.4%, em mais ou menos 1 hora e meia, de forma que as condies anaerbias esto presentes, bem antes da transformao do azul-de-metileno, que acontece por volta de 4-6 horas. Observar uma jarra com placas semeadas, um gerador de anaerobiose sobre a ltima placa, e o indicador de anaerobiose reduzido, de cor branca. Comparar esta cor com a cor azul do indicador nos geradores localizados fora da jarra em sua parte inferior. o sistema das jarras de anaerobiose com geradores

qumicos que permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicao destas

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Os trs mtodos citados acima do resultados semelhantes quanto eficcia do isolamento de bactrias anaerbias em amostras clnicas, porm, o sistema das jarras mais prtico e menos complicado. 3.5. Semeadura em placa - As amostras so semeadas em trs placas de gar sangue preparadas com Brucella gar adicionadas com 10% de sangue de carneiro. Uma das placas incubada a 37C em atmosfera aerbia, e uma segunda incubada a 37C em uma atmosfera com 5% de CO2 para bactrias microaerfilas. Para este fim colocamos a placa em uma jarra com um gerador de CO2, produzindo aproximadamente 5% de CO2. A terceira placa a que se inocula em atmosfera de anaerobiose. O meio de cultura desta terceira placa enriquecido com hemina (5mg/ml), vitamina K (10 mg/ml) e extrato de levedura (0,5%). Neste meio acrescentamos tambm um antibitico aminoglicosdeo (geralmente amicacina, 100 mcg/ml). A adio do antibitico cria um meio seletivo porque os anaerbios estritos so resistentes a estes antimicrobianos e a maior parte das cepas de aerbios e anaerbios facultativos so sensveis. Como a maior parte das infeces provocadas pelos anaerbios estritos so infeces mistas, este meio seletivo ajuda o isolamento bacteriano. No se justifica o uso de mais uma placa sem antibitico porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaerbios. Estas placas so incubadas dentro da jarra a 37C de temperatura durante 48 horas. Quando se suspeita, pelo quadro clnico ou pela colorao de Gram da amostra, que estamos em presena de uma infeco por Clostridium, que so de crescimento mais rpido, as jarras podem ser abertas aps 18 a 24 horas de incubao. Por outra parte, bactrias de crescimento mais lento, como os actinomices, podem demorar sete dias ou mais para formar colnias visveis. 3.6. Identificao bacteriana - comprovao de anaerobiose estrita - Aps a incubao, as placas so examinadas e agora o passo mais importante a comprovao de que as bactrias desenvolvidas nas placas de anaerobiose so anaerbios estritos. Com este fim, so feitas coloraes de Gram, de todos os diferentes tipos de colnias observadas nas trs placas e comparada a morfologia bacteriana. Ao mesmo tempo, semea-se as diversas bactrias obtidas, novamente em anaerobiose e aerobiose. S feito o diagnstico de anaerbio estrito quando aps 24 a 48 horas da nova incubao a bactria s crescer na placa de anaerobiose. O Gram das colnias j orienta

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para uma identificao preliminar do grupo de anaerbio isolado, de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1 - Agrupamento das bactrias anaerbias estritas, de importncia em patologia humana de acordo com sua morfologia na colorao de Gram
- Staphylococcus - Peptostreptococcus - Streptococcus - Veillonella -Acidaminococcus -Megasphaera no - Propionibacterium; - Bifidobacterium - Actinomyces; - Eubacterium - Lactobacillus - Clostridium - Bacterides; - Fusobacterium - Prevotella; - Porphyromonas

Cocos Gram positivos

Cocos Gram negativos

BacilosGram esporulados

positivos

Bacilos Gram positivos esporulados Bacilos Gram negativos

3.7. Identificao bacteriana presuntiva Das colnias de anaerbios estritos, deve ser feita colorao de Gram. J nesta etapa o laboratrio presta uma grande ajuda ao clnico, informando que o paciente tem uma infeco por uma bactria anaerbia estrita que pertence a determinado grupo morfolgico. O diagnstico de gnero e espcie feito utilizando provas bioqumicas (utilizao de acares, produo de indol, reduo de nitratos, urease, crescimento em presena de bile, liquefao da gelatina, hidrlise de esculina etc.), produo de pigmentos, hemlise, aprofundamento no gar, susceptibilidade a antimicrobianos e formao de cidos, (detectados por cromatografia lquida), inoculao experimental e sorologia. As seguintes consideraes prticas so teis para a orientao do clnico para uma conduta adequada,sem a necessidade de aparelhos ou metodologias caras por parte do laboratrio: Na presena de cocos Gram positivos, o laboratrio deve fazer o diagnstico presuntivo de Peptostreptococcus, que so os mais freqentemente isolados neste grupo morfolgico.

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diagnstico diferencial com Streptococcus e Staphylococcus anaerbios como das espcies de Peptostreptococcus deve ser feita com ajuda da cromatografia para detectar a produo de diferentes cidos graxos.

Na presena de cocos Gram negativos, o laboratrio deve fazer o diagnstico presuntivo de Veillonella, gnero mais freqente neste grupo. Para o diagnstico diferencial com os outros gneros de cocos Gram negativos tambm recomendada a cromatografia lquida, para pesquisar cidos graxos.

Na presena de bacilos Gram positivos esporulados, o laboratrio deve fazer o diagnstico de Clostridium. Na dvida no diagnstico de bacilo esporulado, recomendamos o tratamento

com lcool etlico a 95%, durante 1 hora temperatura ambiente e ressemeadura posterior. Ale disso, a suspenso bacteriana pode ser aquecida a 80 durante 10 minutos, esfriada e feita resemeadura. Aps um ou outro destes procedimentos, s sobrevivem bactrias esporuladas. Se o Clostridium produzir um duplo halo de hemlise pode ser feito o diagnstico presuntivo de Clostridium perfringens. Esta espcie a mais freqentemente isolada dentro deste grupo bacteriano. Para o diagnstico diferencial das outras espcies de Clostridium devem ser feitas provas bioqumicas como hidrlise da gelatina, fermentao da glicose, lecitinase, lipase, produo de indol, uria, nitratos, e motilidade. Na presena de bacilos Gram positivos no esporulados recomendamos fazer a prova de catalase, reduo de nitratos, hidrlise de esculina, urease, e produo de pigmento. Para o diagnstico definitivo, deve ser feita a pesquisa da produo de cidos graxos. Se a colorao de Gram mostrar bacilos Gram negativos, recomendamos semear a colnia em gar sangue (Brucella gar), colocando um disco de Rifampicina (15 mcg) e um disco de Kanamicina (1.000 mcg); a bactria deve tambm ser semeada num meio que contm bile a 20%, e num meio rico em triptofano para determinar a produo de indol, com as placas incubadas por 48 horas a 37C. Estas provas junto com a produo de pigmento permitem fazer o diagnstico presuntivo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium de acordo com a tabela 2.

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Frente aos discos de antibiticos, a bactria considerada sensvel se o halo de inibio de 12 mm ou maior. considerada resistente com halos menores de 12 mm. Como inculo para a semeadura, utilizada uma suspenso com turvao semelhante ao nmero 3 de escala de MC Farland ou uma turvao semelhante aps incubao em meio de tioglicolato. A prova da bile considerada positiva, se existir crescimento bacteriano no quadrante respectivo. Para a produo de pigmento, recomendamos a observao direta das colnias, e, em caso de no existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta ( 360 nm de comprimento de onda). Colnias de Prevotella melaninogenicus aparecem de cor tijolo avermelhado. Para a prova de indol, recomendamos passar uma colnia, a partir do meio com triptofano, com ajuda de uma ala de platina num papel filtro impregnado em 1% de paradimetilaminocinamaldeido (em cido clordrico 10%). Uma reao positiva produz imediatamente uma cor azul. Tabela 2- Diagnstico presuntivo feito de acordo seguinte tabela:
Bacilos Gram negativos anaerbios estritos Bactrias / Testes Bacteroides grupo fragilis Prevotella sp. Porphyromonas sp Bacterides sp F.mortiferum F.varium Fusobacterium spp. Rifampicin a 15 mcg S S S S R R S Kanamicin a 1.000 mcg R R R S-R S S S Bile 20% + + + Indol + + + Pigmento + + -

Para Rifampicina e Kanamicina: S= halo de inibio com 12 mm ou mais de dimetro R= ausncia de halo ou menor que 12 mm de dimetro.

A diferenciao dos gneros Prevotella e Porphyromonas realizada atravs da capacidade de fermentar glicose que positiva para o primeiro gnero e negativa para o segundo.

Alguns sistemas comerciais manuais ou automatizados permitem fazer o diagnstico das diferentes espcies de anaerbios utilizando numerosas provas bioqumicas.

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Algns utilizando a ao de enzimas bacterianas pr-formadas podem fazer este diagnstico aps 4 horas de incubao. Destes os mais freqentemente utilizados so: API, Vitek e Microscan. Estes sistemas mais caros no so fundamentais para o diagnstico dos grupos bacterianos e para uma orientao teraputica adequada. Em algumas infeces importante, para o diagnstico, determinar a presena

de toxinas como acontece nas infeces intestinais por Clostridium difficile. Esta determinao feita com provas sorolgicas disponveis comercialmente. 3.8. Provas de sensibilidade a antimicrobianos O estudo da sensibilidade destas bactrias importante pelo aumento permanente de sua resistncia frente aos diferentes antimicrobianos.Esta resistncia mais comum nos gneros Bacteroides e Prevotella, mas pode estar presente tambm nos gneros Clostridium, Porphyromonas e Fusobacterium. O mtodo do disco difuso no adequado para estudar a sensibilidade das bactrias anaerbias estritas. O NCCLS (National Committee for Clinical Laboratories Standards) dos EUA recomenda um mtodo de diluio em gar: as concentraes de antimicrobianos so incorporadas no meio de Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentrao de um antimicrobiano. As bactrias so semeadas utilizando o inoculador mltiplo de Steers e as placas colocadas em jarras com gerador de anaerobiose. A leitura feita aps 48 horas de incubao na estufa, determinando-se a CIM (concentrao inibitria mnima). Um mtodo alternativo,mais prtico a determinao da sensibilidade utilizando fitas de plstico impregnadas com um gradiente de concentrao de antimicrobianos como no mtodo do E test. As bactrias so semeadas em forma similar empregada no mtodo do disco para aerbios. So colocadas duas fitas cada uma com um antibitico diferente em cada placa de 9 cm de dimetro. Em geral necessrio testar 6 antibiticos( 3 placas). Os antimicrobianos com maior atividade in vitro e in vivo frente aos anaerbios estritos so: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, metronidazol, penicilina e amoxicilina-cido clavulnico. As placas so incubadas dentro de jarra com gerador a 37 graus de temperatura. A leitura feita aps 48 horas de incubao, e a sensibilidade interpretada nos dois mtodos seguindo as tabelas publicadas pelo NCCLS. Salientamos que existe uma boa correlao nos resultados obtidos com as duas metodologias descritas.

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4. REFERNCIAS

1. FORBES B.A., SAHM D.F., WEISSFELD A.S. Bailey and Scott!s Diagnostic Microbiology.10th ed.Mosby,1998. 2. ISENBERG H.D. Clinical Microbiology Procedures . Handbook. ASM, Washington, DC.1992. 3. KONEMAN,W.E., ALLEN, D.S., JANDA, M.W., SCHRECKENBERGER, C.P., WINN JR, C.W. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th ed.Lippincott,1997 4. MURRAY, R.P.,BARON,J.E. ,PFALLER,A.,M., TENOVER,C.F., YOLKEN, H.R. Manual of Clinical Microbiology,7th.Ed. ASM Press, Washington, DC. 1999. 5. NCCLS: Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria.Approved standard,Vol 17 no 22, Villanova PA, National Committee for Clinical Laboratories Standards, 1997.

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Captulo 10 - Interpretao de Resultados e Relatrios Microbiolgicos

1. INTRODUO: O microbiologista ao elaborar os relatrios de exames microbiolgicos deve ter em mente a possibilidade do clnico no saber interpret-lo adequadamente, tanto por desconhecer um determinado nome de bactria, como seu potencial patognico e porque muitas vezes estas dvidas associadas disponibilidade do antibiograma possam ser um fator determinante do uso inadequado de antimicrobianos. A requisio do exame constitui um formulrio padronizado que, na maioria dos casos, o nico contato entre o clnico e o laboratrio e, desse modo, deve fornecer informaes suficientes para um processamento adequado da amostra. Cabe ao microbiologista padronizar um impresso de solicitao de exames microbiolgicos que d a oportunidade ao mdico de informar no mnimo: idade, sexo, se o paciente internado ou ambulatorial; condies co-mrbidas: gravidez, imunossupresso, diabetes, etc. destacar informaes clnicas e impresso diagnstica que so fundamentais para a anlise microbiolgica como por exemplo: Urina paciente sintomtico ou no Fezes diarria hemorrgica Sangue endocardite, sepse,etc. Escarro tuberculose, micose pulmonar Leso de pele mordida de animal ou piodermite ou infeco cirrgica, etc.

2. O RELATRIO (LAUDO) MICROBIOLGICO Cabe ao microbiologista elaborar um laudo claro e objetivo, facilitando a comunicao: diretamente (telefone ou pessoalmente), indo ao encontro do clnico ou encorajando-o a procurar o laboratrio para discutir casos ou participar de reunies, visitas de enfermaria, etc. elaborando manuais de coleta, informes sobre perfil de bactrias mais isoladas e padres de sensibilidade (por exemplo em hemoculturas, em urina, ferida cirrgica por

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especialidade, etc.), esclarecendo novos padres de relatrios, novos agentes, seu potencial patognico,mudanas de padres (p. ex. de antibiograma), disponibilidade de recursos diagnstico e orientao teraputica (ex. E-test, testes rpidos com ltex para pesquisa de antgenos, etc.) O microbiologista deve ter em mente os principais agentes etiolgicos correspondentes a cada material enviado, bem como da respectiva flora normal, para adequada interpretao do resultado. Verificar no mdulo 2 estas informaes. Cabe ao microbiologista como membro nato da Comisso de controle de infeco hospitalar : - tomar iniciativa de procurar o mdico ou o paciente para esclarecer dvidas sobre exames e materiais - estimular e envolver a enfermeira e o infectologista da CCIH ou clnico para a comunicao rpida de resultados de bactrias resistentes, - exames relacionados com diagnstico de infeco hospitalar - exames de urgncia: LCR, hemocultura, etc. - diagnstico de doenas de notificao compulsria ou que exijam isolamento, etc. Em resumo, mais do que um retrato do crescimento nas placas de Petri, o laudo microbiolgico deve ser o resultado de uma leitura interpretativa e crtica, utilizado como um instrumento de comunicao e interao entre o laboratrio de microbiologia e o mdico.

3. ANLISE MICROBIOLGICA O microbiologista na sua rotina diria para decidir a importncia das bactrias ou fungos isolados deve considerar: potencial patognico do agente a bacterioscopia e o pedido mdico Bactrias como S. pyogenes, Neisseria gonorrhoeae e Mycobacterium tuberculosis, independente do material que foram isoladas so de importncia clinica e epidemiolgica. Bactrias como Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae, se

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forem isolado no LCR ou sangue so de importncia indiscutvel, mas quando isolados em mucosas costumam representar flora e seu relato discutvel. 3.1. Algumas sugestes importantes Como norma, no se deve identificar e fazer antibiograma de bactrias da microbiota de pele e mucosas. No entanto, sempre conveniente entender as sugestes que se seguem como sujeitas a revises conceituais e atualizaes: No caso de dvida: conversar com o mdico do paciente ou com o mdico da CCIH ou mesmo com o paciente se indicado quando no for possvel a comunicao, relatar os achados da bacterioscopia, se realizada, com identificao sumria (bacilos ou cocobacilos no fermentadores), ou a nvel de gnero (enterobactrias e alguns Gram positivos), se o estafilococo aureus ou coagulase negativo, etc. conservar a bactria por um prazo de 7 a 10 dias prosseguir nos testes caso necessrio. Estudos quantitativos so sempre que possvel mais teis que exames qualitativos, usando ou diluio do material ou semeando com ala calibrada Relatrio quantitativo de bacterioscopia: nmero mdio de bactrias anotadas no mnimo em 10 campos observados:
Tabela 1 Relatrio quantitativo de exame microscpico pela colorao de Gram
Descritivo Ausente Raros Frequentes Numerosos Incontveis Classificao nmerica 0 + ++ +++ ++++ N Mdio de bactrias, clulas epiteliais, leveduras, neutrfilos /campo 1.000x 0 1-5 6-15 16-30 >30
o

deixando a possibilidade de

Relatrio qualitativo de bacterioscopia do esfregao corado pelo Gram, descrevendo e quantificando a presena de: - Principais grupos morfolgicos de bactrias(cocos/bacilos/ Gram positivos ou negativos) e predomnio.

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- Quando o microbiologista for experiente recomenda-se adicionar o comentrio:sugestivo de pneumococo ou haemophilus, etc. - Presena de bactrias intracelulares (neutrfilos ou fagcitos) - Presena de fungos leveduriformes em brotamento e hifas, etc. Finalmente a discusso sobre os materiais provenientes de tecido cutneo-mucosos, o que devemos relatar com antibiograma e o que entender como flora e ignorar, so muito relativos, no havendo unnimidade para padres definitivos de relatrios. Nota: sempre conveniente entender que as sugestes que se seguem esto sujeitas a revises conceituais, atualizaes e pequenas adaptaes locais. Como fazer microbiologia somar evidncias (microbiolgicas, clnicas,

epidemiolgicas...), torna-se impossvel esgotar todas as possibilidades. O que pode e dever ser feito buscar traar linhas mestras para a orientao do raciocnio, deixando que cada caso seja analisado como um exerccio constante do bom senso cientificamente embasado.

4. SUGESTES DE RELATRIOS MICROBIOLGICOS POR MATERIAL 4.1. TRATO RESPIRATRIO SUPERIOR a) Orofaringe - importante relatar os achados de bacterioscopia do esfregao corado pelo Gram, descrevendo e quantificando a presena de: Clulas epiteliais Polimorfonucleares (neutrfilos) e/ou mononucleares (linfcitos) Principais grupos morfolgicos de bactrias Presena de bactrias intracelulares (neutrfilos ou fagcitos) Presena de fungos leveduriformes / hifas Quando presente relatar associao fuso-espirilar Patgenos a serem relatados em isolados de cultura: Streptococcus pyogenes (beta hemoltico do grupo A) Arcanobacterium haemolyticum Bordetella pertussis

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Corynebacterium diphtheriae (quando solicitado, realizar ou encaminhar para Laboratrio de Referncia) Resultado sem patgenos: Presena de bactrias da microbiota da orofaringe No caso de paciente imunossuprimido, quando solicitado cultura de vigilncia e se houver predominncia de bactria ou fungo, relatar predomnio de: P. aeruginosa, Candida spp, S. aureus, Enterococcus spp, etc., nestes casos o antibiograma ser feito apenas quando solicitado pela CCIH. Obs: Embora seja um tema polmico na literatura e na prtica microbiolgica,, relatar o isolamento de pneumococo, Haemophilus, N. meningitidis, Moraxella catarrhalis em orofaringe, nos casos em que: a bacterioscopia revelar predomnio de neutrfilos (ressalva em imunossuprimidos), presena do agente em neutrfilos/macrfagos e crescimento abundante (ntido predomnio) em relao ao restante da microbiota. a pedido mdico Colocar a seguinte observao: A(s) bactria(s) isolada(s) fazem parte da microbita da orofaringe, no sendo recomendvel uso de antimicrobianos. Consultar

infectologista para orientao. b) Swab nasal - O swab nasal ou de nasofaringe no tem valor diagnstico para sinusite, otite ou infeces do trato respiratrio inferior, no devendo ser processada para estes fins. Pode ser til apenas para pesquisar portadores de S. aureus e Streptococcus

pyogenes (beta hemolitico do grupo A). c) Epiglote/Nasofaringe - No caso de epiglotite, no material de nasofaringe ou do local podem ser isolados o Haemophilus influenzae, o pneumococo e o Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus como agente etiolgico. No caso de coqueluche deve-se pesquisar a Bordetella pertussis. Relatar o resultado positivo ou negativo para Haemophilus influenzae, pneumococo, Streptococcus pyogenes, S. aureus e Bordetella pertussis quando pesquisados. d) Seios da face - Culturas de aspirados intra-operatrios ou obtidos por puno devem ser relatados: Bacterioscopia - relato quantitativo de bactrias, fungos, neutrfilos e clulas epiteliais.

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Cultura dos agentes isolados e se houver predomnio de algum (so esperados o pneumococo, H. influenzae, M. catarrhalis, Streptococcus pyogenes e mais raramente o S. aureus). Caso seja sugestivo de contaminao com secreo de nasofaringe (muitas celulas epiteliais, poucos neutrfilos) relatar: sugestivo de contaminao com microbiota de nasofaringe. aconselhavel em sinusite subaguda e crnica a cultura para anaerbios. Quando realizada relatar o resultado. Quando no realizada, comparar a bacterioscopia com o resultado da cultura e relatar sobre a possibilidade de participao de bactrias anaerbias (observadas no Gram, mas que no crescem em aerobiose). Obs: rino-sinusite infecciosa aguda e no complicada na maioria das vezes de etiologia viral. Ressaltando-se as seguintes casos: - Em imunossuprimidos e diabticos valorizar o achado de fungos filamentosos do tipo Aspergillus spp - Em pacientes com entubao nasotraqueal ou nasogstrica > que 48h, o material pode revelar presena de enterobactrias, bactrias no fermentadoras, S. aureus, leveduras e polimicrobiana. Devem ser relatados, mas para serem valorizados deve haver clnica ou evidncia radiolgica e material representativo. e) Ouvido Otite externa relatar o resultado da bacterioscopia e fazer identificao e antibiograma caso a bacterioscopia de respaldo (abundantes neutrfilos e predomnio do tipo morfolgico isolado na cultura de potencial patgeno) ao isolamento de uma enterobactria ou Pseudomonas ou eventualmente fungo. Otite mdia - Culturas de materiais obtidos por timpanocentese (miringotomia) so ideais, mas raros e devem ser relatados os achados de bacterioscopia e cultura. - Swabs, ou aspirados de conduto auditivo em membranas previamente rompidas tem pouco ou nenhum valor diagnstico. Sugerir no coletar este tipo de material. - Quando realizada a cultura, havendo crescimento de bactrias da microbiota (Gram positivos, Neisserias, enterobactrias, etc.) Relatar: presena de bactrias da flora do conduto externo.

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- No caso da bacterioscopia revelar predomnio de um tipo morfolgico, com abundantes neutrfilos e predomnio na cultura de um agente. Relatar: Microscopia do esfregao corado pelo Gram com relatrio quantitativo dos elementos celulares (clulas, bactrias e neutrfilos) e qualitativa. - Resultado da cultura: quando o agente isolado for: Haemophilus, Pneumococo ou M. catarrhalis, relatar o agente isolado e o antibiograma - Quando o agente for uma enterobacteria ou Pseudomonas relatar que a bactria isolada sugestiva de contaminao, exceto se for em paciente com entubao nasotraqueal h mais de 48h. A pedido mdico fazer antibiograma. - No caso de mastoidite a indicao obteno cirrgica de fragmentos sseos para cultivo e no cultura de secreo de ouvido externo/mdio. Poder se relatado o cultivo deste material quando a bacterioscopia for concordante e a bactria isolada for: Aguda: Haemophilus, pneumococo, S. pyogenes e S. aureus fazer antibiograma Crnica: Enterobactrias, Pseudomonas, S. aureus. - Quando isolar Staphylococus coagulase negativa, S viridans, Corynebactrias, etc, em flora mista. Relatar: presena de bactrias da flora do conduto auditivo externo e no fazer antibiograma. 4.2. ESCARRO O escarro til para diagnstico de tuberculose e quando revela os agentes de algumas micoses pulmonares (blastomicose sul-americana, histoplasmose, criptococose). Pode ser valorizado o agente isolado quando houver correspondncia na bacterioscopia, poucas clulas epiteliais e numerosos leuccitos. Quando a bacterioscopia revelar >de 10 clulas epiteliais por campo de pequeno aumento: objetiva de 10x , havendo predomnio sobre leuccitos e sem um tipo morfolgico predominante, relatar: material com sugestiva contaminao de flora de

orofaringe. Exame de valor diagnstico prejudicado, no processar o material e solicitar nova amostra. Processar o material que revele < 10 clulas epiteliais, predomnio de leuccitos e quando houver predomnio de um tipo morfolgico de bactria. Este critrio mais rigoroso, pois o anterior era >25 clulas epiteliais revelou ser mais fidedigno. Os agentes bacterianos esperados em pneumonia aguda da comunidade so: S. pneumoniae, M. catarrhalis, H. influenzae e S. aureus.

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4.3. SECREO ENDOTRAQUEAL/LAVADO TRAQUEAL/LAVADO BRNQUICO: Rotina para lavado brnquico, escarro e secreo traqueal 1. Homogeneizar muito bem a amostra, por pelo menos 1 minuto. 2. Fluidificar com 1,0ml de soluo salina estril ou com N-acetil-cistena as secrees traqueais muito espessas. 3. Pode-se tambm utilizar prolas de vidro estreis na homogeneizao do material. 4. Confeccionar lmina para colorao de Gram. 5. Centrifugar 7 ml e corar o sedimento, quando processar lavado brnquico. 6. Corar o material direto, sem centrifugar, quando processar escarro e secreo traqueal. 7. Fixar cuidadosamente o esfregao seco sobre a chama. 8. Observar ao Gram (imerso) a presena de bactrias intracelulares que devem ser reportadas caso ultrapassem 7%. 9. Verificar a presena de clulas estratificadas epiteliais. Mais de 1 clula para cada 10 leuccitos ou mais de 10 clulas em campo de pequeno aumento, contra indicam a realizao de cultura, reportar como Material Inadequado. 10. Confeccionar tambm lminas para colorao de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessrio. 11. Plaquear volume de 1 l (ala calibrada) em meios de MC, MN, AS e AC (atmosfera CO2). 12. Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1 C e realizar a primeira leitura quantitativa. 13. Reincubar por mais 24 horas nos casos de difcil diferenciao macroscpica entre colnias. 14. Multiplicar o nmero de cada tipo de colnia identificada pelo fator 103. 15. Interpretar como significativo as contagens > 105 UFC do lavado brnquico, escarro ou secreo traqueal. 16. Realizar antibiograma somente para as colnias com contagens significativas. 17. Liberar apenas a identificao, sem TSA, para microrganismos em contagens inferiores a 105 UFC. Relatrio:

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Quando usar tcnica qualitativa: Quando o material for adequado, mas mais de trs bactrias isoladas, sem predomnio, relatar microbiota mista, presena de (nmero) Gram positivos e (nmero) de Gram negativos. No fazer antibiograma e guardar a placa por sete dias. Quando houver predomnio de uma bactria relatar: predomnio do agente e antibiograma. Presena de outros microrganismos: Gram positivos e/ou Gram negativos, no mximo identificados a nvel de gnero, sem antibiograma. Quando usar tcnica quantitativa Se houver contagem significativa, com predomnio de um microrganismo e eventualmente 2, relatar o(s) agente(s) isolado(s) e fazer antibiograma. Se a contagem no for significativa ou vrias bactrias da microbiota do trato respiratrio superior foram isoladas relatar: presena de bactrias da flora do trato respiratrio superior sem valor diagnstico. No identificar nem fazer antibiograma.

4.4. LAVADO BROCOALVEOLAR OU ESCOVADO BRNQUICO: So considerados junto com a bipsia pulmonar os materiais de melhor valor preditivo de isolamento do agente patognico. imprescindvel a semeadura quantitativa para posterior contagem do nmero de colnias. Rotina de semeadura e interpretao para escovado protegido e BAL 1. Passar assepticamente a escova para um tubo contendo 1,0ml de soluo salina estril. 2. Homogeneizar muito bem em vrtex por pelo menos 1 minuto. 3. Confeccionar lmina para Gram com pipetor de 10 ? ou ala calibrada de mesmo l volume. 4. Deixar que a lmina seque por 30 minutos dentro da estufa. 5. Completar a fixao do esfregao cuidadosamente sobre a chama. 6. Confeccionar tambm lminas para colorao de BAAR e pesquisa de fungos, quando necessrio. 7. Plaquear 10 l (ala calibrada ou pipetor) em MC, MN, AS e AC (CO2). 8. Plaquear 1 ?(ala calibrada) em MC, MN, AS, AC (CO2) l 9. Incubar todas as placas por 24 horas a 35 + 1 C e realizar a primeira leitura quantitativa.

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10. Reincubar por mais 24 horas nos casos de difcil diferenciao macroscpica entre colnias. 11. Multiplicar a contagem dos tipos de colnias identificadas pelo fator, de acordo com o volume plaqueado. 12. Multiplicar pelo fator 102 quando o volume plaqueado foi 10 l. 13. Multiplicar pelo fator 103 quando o volume plaqueado foi 1l. 14. Quando for conhecido o valor de soluo fisiolgica utilizado na tcnica do BAL, devese considera-lo como mais um fator de correo. Por exemplo: se forem utilizados 10, 20 ou 100 mL; multiplicar por 10, 20 ou 100, respectivamente. 15. Interpretar como significativo para o diagnstico de pneumonia contagens: a) > 103 ufc para Escovado Brnquico Protegido; b) > 104 ufc para BAL 16. Realizar antibiograma somente para as colnias com contagens significativas. 17. Liberar apenas a identificao, sem TSA, para os microrganismos em contagens inferiores significativa. Exemplo de clculo: o Cultura quantitativa de BAL, colhido com 10 mL de soluo fisiolgica estril, apresentou crescimento de 80 colonias de Pseudomonas aeruginosa com a ala de 10 L e 8 com a ala de 1 L, alm de 5 colonias de Streptococcus viridans apenas na semeadura com 10 L. Clculo: Pseudomonas aeruginosa 10 (sol. Fisiolgica) x 80 (no de colnias) x 100 (ala de 10L) = 80.000 (ou 8.104 ufc/mL) 10 (sol. Fisiolgica) x 8 (no de col.) x 1000 (ala de 1L) = 80.000 (ou 8.104 ufc/mL)

Streptococcus viridans Relatar: 10 (sol. Fisiolgica) x 5 (no de col.) x 100 (ala de 10 L) = 5.000 (ou 5.103 ufc/mL)

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Pseudomonas aeruginosa - 8.104 ufc/mL o com antibiograma

Streptococcus viridans 5.103 ufc/mL o sem antibiograma

Relatrio da bacterioscopia Descrever os achados da bacterioscopia do centrifugado, lembrando que ser melhor quando feita em citocentrfuga. Relatar: relao clulas epiteliais/neutrfilos descrever presena de bactrias e particularmente se houver presena de microrganismos fagocitados, seu padro morfo-tintorial (forma e reao ao Gram) e se h predomnio de algum tipo. Relatrio da cultura Culturas quantitativas de amostras do trato respiratrio inferior relatar: - Contagem final do(s) microrganismo(s) isolados - Quando isolar um ou at dois microrganismos em contagens significativas (vide parmetros ), fazer antibiograma - Comentar: contagem bacteriana significativa bom valor preditivo de infeco se a clnica for concordante. Quando as contagens no forem significativas ou mais de dois microrganismos isolados e bacterioscopia com predomnio de clulas epiteliais sobre os leuccitos. Relatar: Presena de bactrias do trato respiratrio superior - sem valor diagnstico.
Tabela 2 - Contagens bacterianas consideradas significativas
Escarro, aspirado endotraqueal, lavado brnquico Escovado brnquico protegido Lavado broncoalveolar (BAL) 10 10 Ufc/mL =10 Ufc/mL =10 Ufc/mL
4 3 5 6

Candida em secrees respiratrias:

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Pneumonia causada por Candida spp considerado uma raridade e o diagnstico s pode ser definido por bipsia pulmonar que revele invaso tecidual e no por cultura. muito freqente a presena qualitativa de Candida spp em todos os materiais obtidos de pacientes com cnula oro-traqueal ou traqueostomia. O relato de isolamento de Candida costuma induzir a teraputica desnecessria, cara e com efeitos colaterais e selecionadora de cepas resistentes. Mesmo contagens significativas de leveduras devem ser consideradas com cautela, pois pode apenas representar colonizao. Exceo deve ser feita aos recm-natos pr-termo e de baixo peso. Nestes, a mortalidade por Candida apresenta nveis bastante elevados e a possibilidade de infeco invasiva deve ser considerada

Outros fungos como Histoplasma, Cryptococcus spp e mesmo Aspergillus spp (particularmente em imunossuprimidos) devem ser identificados e relatados. 4.5. PLEURAL Todo o cuidado deve ser tomado para evitar contaminao deste material. A bacterioscopia do sedimento centrifugado muito til para avaliar a presena de bactrias, micobactria e eventualmente fungos, bem como as caractersticas da celularidade. Alguns patgenos encontram-se em pequena concentrao (Haemophilus, pneumococo, Streptococcus pyogenes, S. aureus) ou mais raramente podem ser Anaerbios , fastidiosos ou fungos. Relatar o isolamento de bactrias potencialmente patognicas (acima relacionadas). No caso de Staphylococcus coagulase negativo, Corynebacterium spp, Streptococcus viridans e outras bactrias da flora cutneo-mucosa conveniente comparar com os achados da bacterioscopia e na dvida contactar o clnico e solicitar nova coleta com anti-sepsia rigorosa.

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4.6. ABSCESSO PULMONAR Os mesmos potenciais patgenos do derrame pleural podem estar presentes, incluindo os anaerbios e fungos e somados s Nocardias, Micobactrias, Bacillus anthracis, etc. O exame microscpico da amostra do material deve ser processado pela microbiologia e pelas tcnicas histolgicas. As coloraes de Gram e Ziehl , exame direto com azul de algodo e se possvel o Giemsa sero muito teis na busca do agente etiolgico e na sugesto de meios de cultura para semeadura, para orientar tempo de incubao, etc. Relatar o isolado se potencialmente patognico. Cautela na liberao de resultados de cultura se exames microscpicos forem negativos e cultura revelar bactrias potenciais contaminantes de pele. Outras causas de abscesso devem ser consideradas (neoplasia, infarto, etc.). 4.7. OCULAR Os potenciais patgenos devem ser distinguidos dos potenciais contaminantes de mucosas, sendo o recurso mais simples a bacterioscopia do material, quando necessrio concentrado fazendo-se uma suspenso do swab em salina e centrifugado em cito-centrfuga. No entanto comum a bacterioscopia ser inconclusiva, tanto pela dificuldade de caracterizar a bactria como pelas outras etiolgias (viral, Chlamydia trachomatis, alrgica, qumica, uso prvio de colrios com antibiticos, etc.). Infeces de glndula lacrimal, ordolo e blefarite podem involver amostras de S. aureus. Conjuntivite bacteriana: podem ser atribudas N. gonorrhoeae em recmnascidos. A presena de S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus configura so outras possibilidades etiolgicas. O isolamento de bactrias como S. aureus ou os outros agentes relacionados, concordantes ou no com a bacterioscopia, desde que no descrito como rarssimas colnias deve ser relatado e realizado o antibiograma. lcera de crnea pode envolver P. aeruginosa e outros oportunistas inclusive protozorios (Acanthamoeba). Cautela no caso de isolamento de Neisserias saprofitas, Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp e outros potenciais habitantes de mucosas. Comparar sempre o resultado da

bacterioscopia, com a quantidade de bactrias isoladas, se houve crescimento puro ou quase puro.

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Relatar: cultura positiva para bactria da microbiota de mucosas sem valor diagnstico. Sugerir nova coleta. Endoftalmite envolve bactrias potencialmente patognicas como S. aureus, P. aeruginosa, pneumococo, Haemophilus spp, N. meningitidis, e outros agentes relacionados a fatores predisponentes como imunossupresso, diabetes, trauma, cirurgia, endocardite, bacteremia, etc. O material dever ser obtido por puno e evitar contaminao. Eventualmente anaerbios e fungos podem estar presentes. O exame microscpico poder ajudar a evidenciar o agente e orientar o meio de cultura mais adequado ou apenas o resultado da cultura poder revelar o agente, que poder ser um dos listados acima. No caso de potenciais contaminantes que crescem em pequena quantidade, sem respaldo da bacterioscopia, identificar o agente e relatar: bacteria da flora de mucosas, papel patognico duvidoso. Guardar a bactria por sete dias para eventual teste de sensibilidade. 4.8. LQUIDO CFALO RAQUIDIANO (LCR): Os agentes clssicos das meningites devem ser relatados bem o antibiograma. A bacterioscopia pode ser relatada sem resultado positivo de cultura quando o microbiologista sentir confiana no diagnstico. No caso de isolamento na cultura de potenciais contaminantes de pele em caso de meningite bacteriana sem fator predisponente (imunossupresso, cirurgia, etc) e bacterioscopia discordante ou negativa relatar: O agente isolado com o comentrio: potencial contaminante de coleta. O antibiograma ser realizado apenas a pedido mdico. No cultivar LCR em caldo de cultura pois aumenta muito a chance de isolamento de contaminantes. LCR obtido pelo shunt a maioria das infeces em pacientes com shunts, ou derivaes so bactrias da flora cutnea: Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus viridans, Corynebacterium spp , Neisserias saprofitas e Acinetobacter spp. Neste caso devem ser considerados e relatados. Eventualmente Propionibacterium spp podem estar envolvidos. Na dvida solicitar novo material para confirmao. Bactria que cresce no caldo e no cresce no gar, se no for fastidioso ou anaerbio em geral contaminante.

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4.9. FEZES Os potenciais agentes de diarria so muitos. O laboratrio deve listar apenas os agentes pesquisados na sua rotina ou quando especificado pelo clnico relatar o resultado sobre os agentes solicitados. Relatar: Cultura negativa para os seguintes enteropatgenos pesquisados: E. coli clssica, E. coli invasora, E. coli O 147 EHEC, Shigella spp, Salmonella spp, Yersinia enterocolitica, Aeromonas spp (opcional), Plesiomonas shigelloides (opcional). Relatar pesquisa de leuccitos quando realizada pois d suporte a infeces por Salmonella, Shigella e Campylobacter. No caso de realizar cultura para Campylobacter de rotina, inclu-lo no relatrio. Lembrar que diarria/enterocolite em pacientes com >3dias de hospitalizao e fazendo uso de antimicrobianos pode ser Clostridium difficile pesquisando a toxina com kits especficos. Diarria com mais de 7dias de durao em imunocomprometidos pode ser por parasitas (Giardia, Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora belli e em paciente com HIV, complexo do Mycobacterium avium.

4.10. PELE, ABSCESSOS e FERIDAS - Consideraes Abscesso tecido subcutneo Abscesso cerebral Abscesso intra-abdominal Embora sejam os trs materiais abscesso, o microbiologista deve ter em mente expectativa de isolamento de diferentes agentes. Os abscessos fechado e puncionados com tcnica assptica so considerados materiais de bom valor preditivo diagnstico quando revelam bactrias ou fungos. Deve-se, portanto, orientar o mdico para obter material nas melhores condies de assepsia possvel. Encaminhar rapidamente o material para o laboratrio. Para abscessos considerar a possvel participao de anaerbios estritos ou microaerfilos. Quando disponvel fornecer meio de transporte adequado ou orientar para enviar o material na seringa sem agulha. Fazer lmina para bacterioscopia, e, se indicado, exame direto com KOH 10% para pesquisa de fungos, asssim como pesquisa de BAAR para micobactrias.

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Nos abscessos de tecido subcutneo e cerebral a bacterioscopia pode dar orientao til para escolha dos meios de semeadura ou ajudar no resultado. S. aureus a causa mais importante em abcesso subcutneo, mas em caso de associao com mordida, os fastidiosos devem ser lembrados. No caso de abscesso cerebral o diagnstico correto e rpido de extrema valia. O exame microscpico pode ser muito til se revelar algum agente. Pode haver participao dos mais variados agentes bactrias comuns, fastidiosos, fungos, nocardia, micobactrias, etc. Deve-se procurar semear no maior nmero de meios diferentes, inclusive em caldo tioglicolato. No caso de abscesso abdominal a associao de enterobactrias com anaerbios esperada. Dependendo da histria clnica lembrar de Salmonella e Yersinia. No caso de abscesso de tecido subcutneo o resultado ideal quando concordante com a bacterioscopia e revelando agente potencialmente patognico. O S. aureus e Streptococcus beta hemolticos causam mais celulite, mas podem ser isolados em abscessos, sendo raro as enterobactrias. No caso da cultura revelar bactrias da microbiota, mas concordante com a bacterioscopia (S. viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc,) liberar o resultado com o antibiograma. No caso de bacterioscopia negativa ou discordante e, principalmente em abscesso drenando h alguns dias, liberar o resultado fazendo restries sobre a possibilidade de contaminao: A bactria isolada possivelmente representa contaminao pela microbiota da pele, assim, guardar a bactria por sete dias e no fazer o antibiograma. No caso de abscesso cerebral se o exame microscpico revelar possvel agente, o clnico deve ser imediatamente comunicado e informado do andamento dos exames de cultura. Tanto bactrias potencialmente patognicas podem ser isoladas como possveis contaminantes de pele ou mucosas, mas o clnico deve estar informado e o teste de sensibilidade poder ser feito de qualquer destas bactrias. Os abscessos abdominais polimicrobianos da comunidade em geral respondem teraputica emprica e no exigem a identificao de todas as bactrias anerbias facultativas e anaerbios estritos. Importante relatar quando isolar enterococcus ou enteropatgenos ou bactrias no comuns ou nos casos de insucesso teraputico indica-se identificar os agentes isolados e fazer o antibiograma.

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a) Ferida/Leso Cutnea - Em geral estes materiais so feridas de origem na comunidade. O relatrio de cultura de ferida aberta ou leso depende muito de saber se a coleta foi adequada removendo secrees superficiais ou no. Relatar quando isolar S. pyogenes, S. aureus e fastidiosos em condies clnicas concordantes (mordida, acidente com gua, terra, etc). Enterobactrias e Pseudomonas podem ser contaminantes ou patognicos. Deve-se relatar o achado, mas colocar como ressalva a possibilidade de contaminao. Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Coryneformes, etc., sugerem contaminao Do respaldo a possibilidade de isolamento de agente patognico quando so atendidos os seguintes requisitos: a) Coleta bem feita. b) Bacterioscopia concordante com a cultura e c) Ocorrem muitas colnias de uma mesma bactria, isoladas em cultura pura ou em ntido predomnio. b) Ferida Cirrgica - So esperadas bactrias endgenas ou tipicamente de origem hospitalar (Enterobacterias, S. aureus, Pseudomonas, etc). Para o relatrio de cultura e indicao de antibiograma deve-se contar com coleta bem feita, e os resultados devem ser comunicados CCIH. Neste caso infeces polimicrobianas so comuns, devendo-se considerar os gneros predominantes. Guardar as cepas isoladas por perodo maior (mnimo 30 dias) para eventual investigao de surto. Fazer antibiograma com ateno para pesquisa de bactrias multiresistentes. c) Dreno/Fstula - So materiais que no deveriam coletados pois na maioria das vezes representam colonizao dos drenos. Mesmo fstulas de osteomielite no so adequadas. Nos casos em que a bactria encontrada j tenha sido isolada de procedimento com menor risco de contaminao (bipsia, puno, etc.) e persiste, relatar o achado e fazer antibiograma. Para os demais casos relatar os gneros que predominaram na cultura, sem antibiograma e que representam possvel contaminao. Guardar as bactrias por sete dias. Considerar que fstulas expontneas podem revelar presena de micobacteriose, micoses, actinomicose, etc.

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d) Bipsia - As bipsias devem seguir critrios cirrgicos de antissepsia. Assim representam material de bom valor preditivo diagnstico. O material dever em condies asspticas ser triturado em gral e semeado qualitativa e quantitativamente para posterior clculo aproximado do contedo bacteriano por grama de material. Utiliza-se as seguintes amostras: Tecido, Material de queimadura, material sseo. Condies que do segurana para liberao do resultado e antibiograma: Condies adequadas de coleta, transporte e processamento preliminar. Bacterioscopia concordante com achados de cultura. Cultura pura ou predomnio de algum germe em particular. Contagens >104 UFC/g tecido Para os demais casos: Bacterioscopia negativa ou discordante Culturas polimicrobianas Isolamento de bactrias da flora cutneo-mucosa (Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, corineformes, Neisseria spp, etc) Baixas contagens <104 UFC/g de tecido - Relatar o(s) agente(s) isolados sua contagem sem antibiograma e guardar a(s) bactria(s) por sete dias. e) Gnglio - O gnglio quando infectado pode revelar agentes importantes de doenas localizadas ou sistmicas, de origem: bacteriana (incluindo os fastidiosos), raramente anaerbios, micobacteriose, fungos, protozorios e vrus Cabe ao laboratrio aproveitar ao mximo. Uma parte ser enviada para estudo histolgico e o restante do material dever ser triturado e realizados os exames microscpicos (Gram, direto com KOH 10%, Giemsa) e culturas para bactrias em meios ricos, fungos e micobactrias e caldo BHI com suplemento (pode ser o balo de hemocultura) e tioglicolato com suplemento. Procurar identificar o gnero e espcie com segurana e na dvida encaminhar a laboratrio de referncia. No caso de isolamento de bactrias da flora cutneo-mucosa e sem correlao com a bacterioscopia relatar o achado sem antibiograma e guardar a bacteria por sete dias.

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Contactar o clnico e o patologista, e se persistir a suspeita de etiologia bacteriana, quando possvel, solicitar nova amostra. 4.11. GENITAL a) Uretral - os principais agentes etiolgicos das uretrites esto bem estabelecidos: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma spp e Ureaplasma spp e Herpes simplex vrus .Raramente Trichomonas vaginalis, Haemophilus spp e outros. Colher sempre lmina para bacterioscopia: Para Trichomonas pode-se colher urina e centrifugar para fazer pesquisa no sedimento imediatamente aps a coleta. Para Chlamydia o diagnstico melhor imunolgico (Imunofluorescncia) Para Mycoplasma e Ureaplasma existem meios especficos e kits muito prticos com cultura semi-quantitativa por avaliao visual de mudana de cor. No resultado da cultura importante comparar com a bacterioscopia e estar aleta para no dar falsos resultados de N. gonorrhoeae confundindo com Neisserias saprfitas e Acinetobacter. Quando isolar Staphylococcus coagulase negativo ou outras bactrias da flora genital relatar: Presena de bactrias da flora genital, no fazer antibiograma e concluir: sugerindo, quando no realizado, a pesquisa de Chlamydia e Micoplasma. Quando isolar enterobactrias, Enterococcus em cultura pura ou em grande quantidade e for concordante com a bacterioscopia, relatar o isolamento com antibiograma e concluir: Bacteria raramente isolada como agente de uretrite; sugerimos investigar outras causas como Chlamydia, Micoplasmas, Trichomonas etc. b) Vaginal - As principais causas de vaginite so: vaginose, Candida spp e Trichomonas vaginalis. Em meninas e pacientes na menopausa ou deficientes hormonais enterobactrias, S. aureus e mesmo bactrias da flora podem eventualmente estar relacionadas com a sintomatologia. A bacterioscopia sempre til para observar: presena de leveduras, presena e quantidade de neutrfilos, presena e predomnio de bactrias,

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presena de Gardnerella spp e Mobiluncus spp, e outros anaerbios que caracterizam a vaginose, associados s clue cells (clulas caractersticas do epitlio vaginal abarrotadas de bactrias). Quando isolar Candida spp e for caso de doena recidivante interessante (quando disponvel) a identificao de espcie, podendo ser necessrio tambm o teste de sensibilidade (mais fidedigno e prtico, mas caro o E-test ) Quando isolar Streptococcus beta hemoltico do grupo A, Streptococcus agalactiae , enterococos, Listeria spp, Quando a bacterioscopia for normal, com raros neutrfilos, presena de clulas epitelias e bacilos de Doderlein e houver crescimento de raras Gram positivos e/ou raras enterobactria relatar: Presena de bactrias da flora vaginal normal Se isolar numerosas colnias de enterobactrias ou S. aureus e a bacteriocopia sugerir alterao de flora relatar: Presena de bactrias da flora vaginal com predomnio de: p. ex. E. coli, Enterococcus spp, S. aureus, etc. c) Endocervical - A cultura de secreo endocervical pode ser til para isolamento de N. gonorrhoeae quando houver suspeita. Deve-se recomendar a pesquisa de Chlamydia trachomatis nos casos de cervicite. O isolamento de enterobactrias, enterococcus, etc. pode significar alterao de microbiota por diferentes causas, mas o achado deve ser relatado, para considerao do mdico. No caso da bacterioscopia revelar presena de freqentes, numerosos ou incontveis neutrfilos (++ a ++++) e presena de bactrias com a morfologia e Gram concordantes com as bactrias encontradas na cultura relatar: Alterao da flora endocervical/vaginal com a presena das bactrias isoladas com antibiograma Lembrando que outras causas devem ser investigadas e/ou afastadas antes de iniciar o tratamento especfico No caso de material endometrial e amnitico, fazer cultura para anaerbios e bacterioscopia. No caso de no realizar cultura para anaerbios, relatar a bacterioscopia e o resultado da cultura.Destacar a possibilidade de anaerbios se visualizar bactrias no Gram sem correspondente crescimento. d) Esperma e/ou Fludo Prosttico - aconselhavel para elaborar um laudo adequado : Fazer bacterioscopia do esperma e da secreo prosttica

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verificar contagem de leuccitos semear com ala calibrada de 10 uL e fazer contagem de colnias Relatar os achados de bacterioscopia, contagem de leuccitos e bacteria

isolada em contagens =103 Ufc/mL. No caso de enterobactrias, enterococos Pseudomonas fazer antibiograma.

No caso de isolamento de estafilococos, Streptococcus spp, Corynebacterium spp e outras bactrias da flora uretral, principalmente em prostatite crnica, sugerir a pesquisa de outros agentes (Chlamydia, Micoplasma, Trichomonas, virus, etc.), sem liberar antibiograma.

4.12. URINA - Interpretao de Uroculturas Para a interpretao da urocultura, algumas informaes so consideradas uteis: Paciente com sintomas de infeco urinaria? Leucocitria? Idade/sexo Gestante Tipo de coleta: jato mdio, coletor, puno de sonda vesical em sistema fechado, puno supra-pbica, etc. Uso prvio de antibiticos coleta da presente amostra, etc. 4.12.1 Urinas Coletadas por Jato Mdio Quando estas urinas so submetidas a cultura sem informao clnica especfica sugere-se que contagens de colnias <105 UFC/ml possam tambm causar infeco, somente se um nico microrganismo e potencial patgeno for isolado. Provveis contaminantes so: difterides, Streptococcus viridans, Lactobacilos, e estafilococos coagulase negativa outros que no sejam classificados como

Staphylococcus saprophyticus. a) Contagem de colnias >105 UFC/ml: Um provvel patgeno >105 UFC/ml - Definitivamente identificar a nvel de espcie. - Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma). - No caso de paciente assintomtico solicitar nova amostra, trata-se de provvel bacteriria assintomtica.

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- No caso da presena de outras espcies em contagens <104 UFC/ml, relatar nmero de microrganismo(s) presentes em <104 UFC/ml. Um provvel contaminante em >105 UFC/ml (difterides, Streptococcus viridans, lactobacilos, e estafilococos coagulase negativa outros que no sejam Staphylococcus saprophyticus.) - Realizar uma identificao limitada: exemplo distinguir entre S. saprophyticus de outros estafilococos coagulase negativa, ou Streptococcus agalactiae (grupo B) de Streptococcus viridans . No fazer antibiograma e sugerir nova coleta. - raro, mas no impossvel, ocorrer infeco urinria por bactrias da microbiota da uretra ou vagina. Para caracterizar ITU h necessidade de confirmar o achado com nova urocultura, e que esteja associada a sintomas. Sintomas e leucocitria tornar muito provvel o diagnstico. Sem sintomas pode ser bacteriria assintomtica ou falha grosseira na coleta. - Enumerar outras espcies eventualmente presentes <104 UFC/ml Dois provveis patgenos em >105 UFC/ml, com um diagnstico infeco do trato urinrio crnica ou recorrente. - Definitivamente identificar a nvel de espcie. - Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma). Dois provveis patgenos em >105 UFC/ml com sintomas de ITU - Identificar a nvel de espcie. - Realizar o teste de sensibilidade (antibiograma). - Solicitar nova amostra para confirmao Mais que dois microrganismos em >105 UFC/ml. - Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura. b) Contagem de colnias 105 UFC/ml: Um provvel patgeno 105 UFC/ml - Para pacientes sob antibioticoterapia, grvidas, recm-nascidos, infeco urinaria de repetio, realizar identificao e teste de sensibilidade.

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- Um potencial patgeno presente em >102 UFC/ml em mulheres sintomticas Fazer identificao e antibiograma. - Um potencial patgeno presente em >103 UFC/ml em homens sintomticos Fazer identificao e antibiograma. Sem informao clnica. - Descreva o microrganismo presente entre 104 e 105 UFC/ml, com base na morfologia - Entre em contato com o paciente e/ou mdico. Solicite informaes e/ou a coleta de nova amostra Caso o contato no seja possvel, mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para possvel retomada de identificao, se requerido pelo mdico do paciente. Um provvel contaminante 105 UFC/ml. - Leuccitos normais: descritivamente identifique o isolado - Leuccitos aumentados: solicite nova amostra Dois ou mais microrganismo presentes em <104 UFC/ml. - Relatar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura. 4.12.2. Urinas Coletadas por Cateterizao a) Contagem de colnias >104 UFC/ml: Dois ou mais provveis patgenos presentes em >104 UFC/ml. - Realize a identificao e teste de sensibilidade de ambos os isolados. - Descritivamente identifique as espcies presentes em <104 UFC/ml. Um ou dois provveis contaminantes em >104 UFC/ml. - Reportar o(s) microrganismo(s) presente(s) com descrio do tipo(s) morfolgico(s), exemplo, difterides, Streptococcus do grupo viridans. - Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura. Um provvel patgeno e um provvel contaminante. - Identificar o provvel patgeno e fazer antibiograma - Fornecer o tipo morfolgico do provvel contaminante. Trs ou mais microrganismos - Fornecer uma descrio dos tipos morfolgicos

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- Reportar: Mltiplos microrganismos presentes; provvel contaminao, repetir a cultura. b) Contagem de colnias <104 UFC/ml: Para pacientes sob antibioticoterapia, mulheres sintomticas, homens sintomticos, realize identificao e teste de sensibilidade. Para todos os outros pacientes, fornea uma descrio do(s) tipo(s) morfolgico(s) presente(s) e requeira nova amostra. Mantenha a cultura a temperatura ambiente por 3 dias para se necessrio retomar o processamento de identificao se requerido pelo mdico do paciente. Obs.: Uroculturas com Candida provenientes de pacientes sondados so utilizadas como critrio para a troca da sonda. Sugere-se nova coleta de urocultura aps 24 horas. Caso o isolamento de Candida seja mantido, deve-se relatar pois poder haver necessidade de instituir terapia especfica. 4.12.3. Urinas Coletadas por Puno Suprapbica a) Um ou dois microrganismos presentes - Identifique a nvel de espcie - Realize o teste de sensibilidade do provvel agente patognico. b) Trs ou mais microrganismos presentes - Identifique - Mantenha a cultura por trs dias para possvel consulta. c) Sem crescimento - Examine em at 48 horas de incubao - Reporte Sem crescimento, teste com sensibilidade de >102 UFC/ml em 48 h (para semeadura de 10l). 4.12.3. OBSERVAES a) No realizar cultura de ponta de sonda vesical b) O critrio de positividade pode ser aplicado sempre que isolar >105 UFC/ml de um s agente, devendo a presena de sintomas caracterizar a infeco do trato urinrio e a ausncia como bacteriria assintomtica.

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c) Realize pesquisa para anaerbios somente em punes supra-pbicas, quando solicitado. d) No realize de rotina o teste de sensibilidade diretamente da amostra de urina, embora em situaes de urgncia da disponibilidade do antibiograma isto possa ser feito. .

Em caso de dvida na interpretao da urocultura, se possvel, entre em contato com o paciente e/ou mdico para maiores informaes, conferindo as condies de coleta. Isto no sendo possvel, relate o numero de diferentes microrganismos encontrados e sua contagem e solicite nova amostra. 4.13. SANGUE Em caso de bacteremia, septicemia, ou febre a esclarecer, deve-se sempre que possvel colher duas amostras de sangue venoso (perifrico) de locais diferentes e se paciente tiver cateter mais uma amostra obtida do catter. Bactrias isoladas no sangue perifrico do tipo S. aureus, Streptococcus pneumoniae, enterobactrias, P. aeruginosa e Candida albicans, tem elevado valor preditivo de infeco Enterococos tem significncia clnica em 80% dos casos Streptococcus viridans entre 40 a 60% - 1 cultura positiva em duas obtidas muito provvel uma contaminao - 2 ou mais culturas positivas muito provvel a infeco - 1 colhida e positiva. Colher nova amostra Staphylococcus coagulase negativa entre 20 a 40%. - 2 amostras colhidas e positivas verificar se so da mesma espcie ou se tem mesmo antibiograma. Se diferirem na espcie e/ou nitidamente no antibiograma provvel contaminao de coleta. No liberar antibiograma. - 2 amostras colhidas e 1 positiva solicitar nova amostra provvel contaminao. No fazer antibiograma. - 2 amostras colhidas e identificadas como da mesma espcie e com mesmo antibiograma Liberar resultado da cultura e antibiograma e destacar: Bactria da flora cutnea. Instituir tratamento especfico se evidncias clnicas de infeco. Se paciente com cateter, possvel colonizao.

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Outras bactrias que, isoladas em uma nica amostra, so sugestivos de contaminao: Micrococcus spp, corineformes, Propionibacterium spp, Bacillus spp. Hemoculturas positivas e repetidas para bactrias potencialmente

contaminantes podem ser considerados patognicos quando afastada a contaminao por cateter. Considerar a hiptese de endocardite. Quando houver suspeita de fastidiosos ou fungos ou micobactrias conservar as hemoculturas por 30 a 40 dias. Tabela 3 - relao entre idade e volume ideal de sangue a ser coletado
Idade < 1 mes 1m a 2a >2 a a 10 a Adolescente Adulto volume 1-2 mL 2-3 mL 3-5mL 10-20mL 40mL

4.14. Ponta de Cateter Cultura qualitativa no se justifica fazer para diagnstico de bacteremia. Devese relatar o nmero de colnias isoladas e a(s) bactrias isolada(s) pela tcnica semiquantitativa de Maki. Quando maior que 15 colnias identificar, mas no fazer antibiograma. Se a hemocultura for positiva fazer antibiograma da hemocultura. No caso de bacteremia, a remoo do cateter e envio da ponta para cultura se justifica quando a amostra de hemocultura for colhida no prazo de 24h. Considerando que a colonizao de cateter muito comum, identificar bactrias do cateter e fazer antibiograma no se justificam, se no houver bacteremia, exceto se houver indicao de monitoramento dos cateteres pela CCIH. Caso a hemocultura seja negativa, no se justifica trabalhar com bactrias do cateter. As tcnicas de investigao de contaminao da luz do cateter justificam-se quando se deseja descobrir fonte de bacteremia, fungemia, abscessos em mltiplos orgos, etc.

5. REFERNCIAS: 1. BARENFANGER, J. Improving the clinical utility of microbiology data: an update. Clinical Microbiology Newsletter, 25(1):1-8, 2003.

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2. ISENBERG H.D. Essential Procedures for Clinical Microbiology, p. 95-101, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1998. 3. KONEMAN, E.W., ALLEN, S.D., JANDA, W.M., SCHRECKENBERGER, P.C., WINN Jr, W.C. Staphylococci and related organisms in: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th ed., Lippincot, 1997. 121-170. 4. SCHRECKENBERGER, P. Questioning dogmas: proposed new rules and guidelines for the clinical microbiology laboratory. ASM News, 67: 388-89, 2001.