Purificacin de protenas

Purificacin
Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentracin diferencial de la protena o molcula de inters

Condiciones generales a evaluar

Calidad (% de pureza del producto de acuerdo a mis objetivos) secuenciacin, cristalizacin ensayo de actividad, productos alimenticios mdicos Cantidad tcnicas de alta capacidad y de baja capacidad preparativas analticas Costos

Pasos a seguir en una purificacin

1. Definir un ensayo especfico que identifique a la protena (actividad biolgica) (especfico, sensible, rpido y barato) 2. Elegir la fuente (matriz biolgica) 3. Extraer la protena de la fuente (protenas intraceluares o extracelulares) 4. Estabilizacin de la molcula 5. Aislamiento y concentracin (fraccionamiento) 6. Determinar la pureza y calidad del producto final

1 Actividad Biolgica

Cantidad de protena que produce, por su accin biolgica, un determinado cambio.

Este cambio puede ser: Un efecto biolgico (Muerte celular, hemlisis, proteccin inmunolgica) Variacin en la cantidad de una sustancia qumica (producto de una reaccin)

De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biolgica como :

Una unidad de Actividad Biolgica es la cantidad de protena que produce una determinada cantidad de efecto 1. Toxina Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de protena que produce la muerte del 23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones) 2. Enzima Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de protena que produce 5.98 moles de producto en 1 minuto en condiciones (siguen especificaciones)

2 Eleccin de la Fuente

Matriz donde se encuentra la protena de inters

Concentracin Accesibilidad Costo Facilidad de la extraccin

3 Extraccin de la protena de la fuente

Lisis osmtica: tcnica muy suave. Uso de sn hipotnicas + fuerzas mecnicas. Para bacterias y clulas vegetales: lisozimas u otras enzimas Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas Ultrasonido: sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra

4 Estabilizacin
Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento 1 PH 2 Grado de oxidacin (-SH) 3 Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes 4 Polaridad y fuerza inica de la solucin 5 Presencia de proteasas 6 Temperatura 5 Actividad de la molcula

5 Aislamiento y concentracin
Fraccionamiento del extracto crudo Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan propiedades fisicoqumicas o biolgicas de la protena de inters para separarla del resto de las molculas Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el rendimiento en la purificacin, pureza y actividad especfica de cada fraccin obtenida. Si bien no hay una sola secuencia de tcnicas a seguir, en general se recomienda empezar por tcnicas de alta capacidad y seguir con las de baja capacidad. En general se desea obtener una gran pureza (segn los objetivos) acompaada de un gran rendimiento.

Solubilidad diferencial Cromatografa de intercambio inico Cromatografa de absorcin Cromatografa de exclusin molecular Cromatografa de afinidad Electroforesis Isoelectroenfoque Resolucin Capacidad

Monitoreo del proceso de fraccionado

Actividad Especfica AE = Unidades totales en la fraccin i Total de protenas en la fraccin i Rendimiento R = Unidades totales en la fraccin i Unidades totales en la fraccin original Porcentaje de purificacin P = AE en la fraccin i AE en la fraccin original

Actividad vs Actividad especfica

1800 1600 1400 1200 AE Purificacin Rendimiento

110 100 90 80 70 60 50 40 30 1 2 3 4 5 6

AE y Purificacion

50 40 30 20 10 0

pasos

Rendimiento

1000

2600 2400 2200 2000 Actividad total Actividad por mililitro

100

80 Actividad por mililitro

Actividad Total

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 0 1 2 3 4 5 6

60

40

20

X Data Pasos

Fraccionamiento por desnaturalizacin

(precipitacin diferencial)
Temperatura

 PH: PI

Salting-in

Fuerza inica ( I = 0.5 miZi2)

Salting-out: Sultafo de amonio Fosfato de potasio

Formas de obtener la precipitacin - en forma de producto seco -en forma de sn saturada de la sal Tanto si se trabaja con el precipitado o con el sobrenadante esta tcnica en general va seguida de una tcnica de de-salado

 Uso de solventes orgnicos: modifican D (constante dielctrica) e hidratacin Etanol Acetona butanol
Producen algo de desnaturalizacin. Requieren de bajas temperaturas

Fraccionamiento por campo elctrico

(electroforsis)

Movilidad electrofortica =

f = coeficiente de friccin = A
Para una esfera A = 6 r V=4/3 r3 Vesp = V/PM

Electroforesis en papel

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

A PH = 8 - 9

1 q/m =

2 q/m =

3 q/m =

4 q/m

Efecto colador

PAGE SDS

SDS

Movilidad = 1/ PM

Tipos de Electroforesis

PAGE Nativa PAGE SDS PAGE + condiciones reductoras Isoelectroenfoque Bidimensional

Determinacin de PM

Isoelectroenfoque

Bidimensional