Separacin de pobIaciones ceIuIares

Diferenciacin de las clulas

sanguneas a partir de clulas
madre de mdula sea
lulas del sistema inmune
IthIattnes teIuIares en sanere entera
eucocitos
lulas nucleadas
Se producen en medula sea (humanos a un ritmo de 80 millones por
minuto)
Se pueden reconocer por sus propiedades de tincin
y su estructura interna
o granuIosos
infocito
Heterogeneidad morfologica, 6-10um.
itoplasma basfilo muy escaso.
Puede tener granulaciones escasas
Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se tie de color
violeta y estructura compacta.
Monocito
itoplasma basfilo.
Tiene numerosas granulaciones pequeas y distribuidas
regularmente (no se ven con aumentos bajos)
Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta claro,
no compacto
eucocitos
poIimorfonucIeares
eutrfiIo
itoplasma acidfilo color rosa plido (con eosina cida se tie de amarillo).
Tiene granulaciones neutroflicas chicas , regularmente distribuidas,
abundantes; pueden ser primarios o secundarios
Nucleo multilobulado
10-20um de diametro
Tienen una vida media de 2-3 dias
En humanos constituyen el 60-70% de los leucocitos totales de la sangre.
No muestran ninguna especificidad para los antgenos pero desempean un mportante papel en la
inflamacin aguda
EosinfiIo
itoplasma acidfilo con granulaciones acidfilas grandes, menos
nmerosas que en neutrofilos, distribucin regular y muy
refringentes
Ncleo bilobulado en forma de anteojos, violeta oscuro y compacto.
BasfiIo
itoplasma acidfilo o antfilo (no toma colorante)
granulaciones basfilas grandes,poco nmerosas, distribucin irregular de
color azul violeta intensos.
Ncleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta oscuro y compacto
Basfilo
Tincin de leucocitos en frotis
Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar
oloracin ideal:
May GrunwaId (azul de metileno/eosina)
Ti citoplasma y granulaciones
Giemsa (azul de metileno/eosina y azur)
Ti el ncleo
Sangre perifrica
eonatos 1ao AduItos
Neutrfilos en banda 9% 600-3000 3% 50-700 2 -8 % 1800-7000
Neutrfilos 52% 3300-17000 28% 1800-4600 46 - 66 % 0-700
Eosinfilos 2 % 20-850 3 % 50-700 1 - 5 % 0-450
Basfilos 0 % 0-640 0 % 0-200 0 -1 % 0-200
Linfocitos 31 % 2000-11000 61 % 4000-10500 20 - 40 % 1000-4800
Monocitos 6 % 400-3100 6 % 50-1100 2 - 10 % 100-800
Puncin cardaca
Frotis
FrmuIa Ieucocitaria (en humanos)
Tipos celulares
eutrfiIos
infocitos
BasfiIos EosinfiIos
Monocitos
En rata, el % de linfocitos es mayor al de neutrfilos (la relacin se invierte)
Frmula leucocitaria
1. Para determinar el porcentaje de los diferentes tipos celulares se cuenta un
nmero fijo de clulas por frotis (por ejemplo 100), diferenciando los tipos
celulares siguientes: linfocito, macrfago y granulocitos.
2. La diferenciacin celular se basa en la relacin del tamao ncleo/citoplasma,
la morfologa del ncleo y la coloracin que adquiere el citoplasma.
3. Barrer el preparado en guarda griega porque las clulas no se distribuyen
homogneamente: linfocitos en franja central, monocitos y polimorfos nucleares
en el borde.
4. Las proporciones de la frmula leucocitaria varan segn:
* Edad
*especie (humanos predominan los neutrfilos, rata predominan
los linfocitos)
anglios axilares
Timo
anglios
mesentricos
anglios
inguinales
Placas
de
Peyer
Bazo
anglios linfticos
rganos linfoides secundarios.
Linfocitos T 77 %
Linfocitos B 18 %
Timo
rgano linfoide primario.
Linfocitos T 97 %
Linfocitos B 1 %
Mdula sea
rgano linfoide primario.
eneracin de clulas
del S.
apacidad
hematopoytica
Mdula sea
Bazo
rgano linfoide secundario.
Linfocitos T 35 %
Linfocitos B 38 %
Sangre
Linfocitos T 70 %
Linfocitos B 24 %
Obtencin de clulas de rganos linfoides
Preparacin de suspensiones celulares
Obtencin de M.O.
RPM 1640
Obtencin de clulas linfoides
entrifugar
Resuspender en medio de cultivo
ontar
Timo
Bazo
anglios
Recuento de clulas
Determinacin de la concentracin de clulas en una
suspensin
cmara de Neubauer
N de clulas/ml=
_n
4
X 10 x dil
4
Separacin de pobIaciones ceIuIares
&n mtodo eficiente debe reunir :
Buena recuperacin
Alta pureza
Mantenimiento de la funcionalidad celular
Sirven para: enriquecer o depletar una poblacin de clulas
Mtodos basados en tamao y densidad
'elocidad de sedimentacin a 1 x g
Ley de Stokes: Fuerza de friccin experimentada por objetos esfricos movindose en un fluido
viscoso en un rgimen laminar de bajo nmero de Reynolds (Re< 2000).
&na clula que sedimenta obedeciendo la Ley de Stokes (en general es vlida para
partculas pequeas movindose a velocidades bajas), llega a una velocidad terminal dada
por:
2 g (8 - 8) r
2
' =
9
Densidad de la clula Densidad del medio
Radio de la clula
'iscosidad del medio
onstante gravitacional
La temperatura puede modificar la velocidad de sedimentacin alterando la viscosidad
6 7 8 9 10 11 12
2
3
4
5
6
7
8
9
10
'
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

s
e
d
i
m
e
n
t
a
c
i

n

(
m
m
/
h
)
Dimetro ()
1,09
1,08
1,07
1,06
Densidad celular
El dimetro influye ms que la densidad de la clula en la determinacin de la velocidad
de sedimentacin
Separacin en base al tamao principalmente (medio de baja densidad)
'entajas:
Buena reproducibilidad
Buena recuperacin
Puede separar una gran cantidad de clulas
Desventaja:
Tiempo requerido para la separacin
Separacin en base a Ia densidad
entrifugacin en gradiente de densidad:
utiliza un soporte fIuido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior.
el gradiente se consigue con un soIuto preferiblemente de baja masa moIecuIar en un
solvente en el que la muestra a analizar puede ser suspendida
permite separar Ios componentes de una muestra
realizar medidas anaIticas
Dos variantes:
entrifugacin zonaI: la muestra se deposita en la parte superior de un gradiente
de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partculas sedimentan movindose
a diferentes velocidades dependiendo de su masa.
entrifugacin isopcnica : la muestra se disuelve en una sn en donde est el soluto
formador del gradiente. Durante la centrifugacin el soluto se distribuye en el tubo y las
particulas de la muestra se reorientan de acuerdo a su densidad. (sedimentacin a altas
g a travs de un medio cada vez ms denso)
uando la densidad del medio y de las clulas son iguales, entonces v = 0 y la
clula flota en una posicin de equilibrio.
Las clulas muy densas llegan al fondo del tubo y pueden morir por compresin.
Las clulas muertas tambin son muy densas y llegan al fondo del tubo.
Se utilizan altas g para alcanzar ms rpido el equilibrio y evitar mezclas por
efectos de difusin.
uanto mayor es la relacin ncleo : citoplasma, mayor es la densidad de la
clula
Medio hipotnoico: clulas menos densas; medio hipertnico: clulas ms
densas
Se utilizan gradientes de BSA lineales o discontinuos y slica gel coloidal, Percoll.
Separacin en base a tamao y densidad (Hypaque-Ficoll)
Separacin de una suspensin celular a travs de un medio de alta densidad
por centrifugacin a baja velocidad
FicoII. Se trata de un polisacrido sinttico de aIto peso moIecuIar (400 kDa). Presenta
un alto contenido en grupos hidroxiIo por lo que tiene una buena soIubiIidad en
medios acuosos. Adems no presenta grupos ionizabIes que puedan servir de unin a
las muestras. Es estabIe a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin
degradarse. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque sigue siendo algo
elevada, lo que supone un inconveniente y no altera la presin osmtica del medio.
Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separacin de clulas y
partculas subcelulares mediante centrifugacin zonal.
Densidad del medio para clulas humanas : 1,075 g/cm
3
ratn : 1,09 g/cm
3
rata: 1,089 g/cm
3
(12H22O11)n.(3H5lO)n
PM: 400.000
Ficoll Hypaque
Polmero sinttico de sacarosa y
epiclorhidrina
Hypaque sdico (diatrizoato sdico)
sodio 3,5-diacetamido-2, 4, 6-
triiodobenzoate (11H83N2NaO4)
contiene 59.87 % de odo
Obtencin de clulas mononucleares de sangre perifrica por Ficoll- Hypaque
Antes de centrifugar
Sangre
diluida
Ficoll
Hypaque
entrifugacin Plasma y plaquetas
MononucIeares
Ficoll Hypaque
Polimorfonucleares +
lbulos rojos
MononucIeares: infocitos + monocitos
400 g 30 temp amb
Despus de centrifugar
Purificacin de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque
Por sedimentacin sobre dextran 6 %
Lisis con H
2
O (1')
Llevar a isotonicidad
PMN + R
*
R
Dextran
PMN + R + SF
Agitacin por inversin y
sedimentacin por 30'
El dextran es un poIisacrido complejo y ramificado formado por muchas molculas de glucosa
unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones
glucosdicas d1->6 entre molculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en
uniones d1->4 (en algunos casos tambin en uniones d1->2 y d1->3). El dextrano es sintetizado a
partir de Ia sacarosa por ciertas bacterias cido-lcticas( Leuconostoc mesenteroides y
Streptococcus mutans).
Separacin de clulas sanguneas humanas por centrifugacin
en gradiente de Percoll
uando la densidad del medio
y de las clulas son iguales,
entonces v = 0 y la clula flota
en una posicin de equilibrio.
MononucIeares
(Iinfocitos)
GR
PM
70 % (1083)
60 % (1077)
50 % (1065)
PIasma
Monocitos,
radiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperacin
y pureza mayor al 90 %
PercoII.
Se trata de una suspensin de partcuIas (5.15
nm) de cido siIcico revestidas de un derivado
de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta
baja viscosidad a densidades altas, no afecta
prcticamente a la presin osmtica del medio y
es estabIe a pH comprendidos entre 5 y 10.
Es soIubIe en solucin acuosa y estable en ellas
siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato),
especialmente a bajos pH.
El compuesto puede ser utilizado para
centrifugaciones zonales, preformando gradientes,
o bien para centrifugacin isopcnica, ya que la
centrifugacin de percoll en rotores angulares
durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce
un ligero gradiente, independientemente de la
densidad inicial del percoll.
Mtodos basados en adherencia
3 categoras:
1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura
dependiente (ej: macrfagos, polimorfonucleares)
2- Adherencia fsica: Se puede realizar a 4 o a 37 (ej: subsets de
clulas B)
3- Adherencia de clulas muertas o daadas
Sustancias empleadas:
Sephadex 10: Quedan retenidas las clulas adherentes.
La separacin se basa en adherencia y tamao.
Polvo de hierro (arbonyl iron powder): Las clulas que fagocitan o se
adhieren a las partculas de hierro, son removidas con un imn. (ej: Remocin
de linfocitos B)
Lana de nylon: Se utiliza para obtener clulas T libres de clulas B.
El rendimiento es bajo (15 a 25 %).
Puede haber retencin diferencial de subpoblaciones T.
Adherencia a superficies de vidrio o plstico
Adherencia a Iana de nyIon
Rendimiento bajo (15-25 %)
Alta pureza.
Mtodos basados en adherencia
Adherencia a superficies de vidrio o pIstico
* Purificacin de macrfagos
(clulas adherentes)
* Separacin por agentes qumicos
(quelante de calcio, EDTA o tripsina)
o por rastrillado.
* Purificacin de linfocitos T
Mtodos basados en afinidad (nteraccin receptor-ligando)
*Rosetas
*oIumnas con anticuerpos
*Panning: superficies pIsticas recubiertas con anticuerpo
*Beads magnticas
*AgIutinina de man: interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros,
aglutinando las clulas (las clulas maduras presentan stos residuos enmascarados
por cido silico.
*AgIutinina de soja: aglutina clulas B pero no clulas T.
*FAS
Monocitos + LB
Mtodos basados en afinidad
(nteraccin receptor-ligando)
Rosetas espontneas
Ficoll-Hypaque
Rc
Rc
Rc
Rc
R
c
%
Roseta
Rc
2
Rosetas T
%
(humanos)
A partir de interfase de Ficoll- Hypaque
Mtodos basados en afinidad
Panning
&tilizacin de pequeas beads recubiertas
con anticuerpos monoclonales que se unen
especficamente a los linfocitos T o B. &na
vez hecha la unin las clulas se extraen
con la ayuda de un separador magntico.
La pureza es excelente. Se trabaja a
temperatura ambiente
Beads magnticas
Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y
superficies plsticas recubiertas
con anticuerpos
D 19 (Linfocito B)
D 3 (Linfocito T)
SeIeccin positiva
SeIeccin negativa
%cnicas inmunomagnticas
Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en
la especificidad de la interaccin)
Antisuero + complemento: Eliminacin de una subpoblacin que lleva un
antgeno de membrana especfico.
Mtodo basado en filtracin por columna de bolitas de vidrio
53 a 65 de dimetro
Las clulas ms grandes se retrasan con respecto a las ms pequeas.
El vidrio debe estar siliconado
Metodo basado en carga elctrica neta
En roedores hay una distribucin bimodal de movilidades correspondiendo a
clulas B y T.
En humanos esa distribucin no se puede correlacionar con las poblaciones B y T
Otros mtodos de separacin
Mtodos basados en la separacin funcional por inactivacin de
clulas proliferantes
1- Pulso de timidina marcada con radioistopos
Linfocitos expuestos a Ag o mitgenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN
La desintegracin radioactiva mata las clulas proliferantes.
(Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotxicas mediadas por clulas).
a timidina se
incorpora aI A
ceIuIar
X
2- PuIso de 5-Br-2-eoxiuridina (BUdR)
Se incorpora aI A en cIuIas en divisin como anIogo de Ia timidina.
uando se activa con Iuz UV, causa eI dao deI A.
3- Mitomicina
ausa cross-Iinking deI A y Ias funciones que requieren divisin
ceIuIar son aboIidas
4- Irradiacin
Rayos X, obaIto (60o), esio (137s), rayos gamma.
X