Construo de cassetes de deleo e/ou substituio gnica utilizando estratgia baseada em PCR e recombinao in vivo no organismo modelo Saccharomyces

cerevisiae Introduo Os cassetes de deleo so uma das vrias tcnicas existentes e utilizadas para se estudar a funo de determinado gene em uma clula. Simplificadamente, um cassete um fragmento de DNA engenheirado para ser introduzido em um organismo alvo a fim de deletar ou substituir um gene de interesse, criando-se mutantes que podem ser utilizados para se estudar a funo biolgica do produto desse gene a partir da alterao do fentipo original, a partir de abordagens genticas tanto diretas quanto reversas. Nesta tcnica, parte-se de um gene de interesse denominado gene alvo (ou ORF, de open reading frame). As regies flanqueadoras 5 e 3 a esse gene so amplificadas atravs de PCR, produzindo-se fragmentos de cerca de 1500 a 2000 pares de bases denominados ORF 5 (regio flanqueadora 5) ORF 3 (regio flanqueadora 3). O gene utilizado como marcador de seleo, que pode ser do tipo auxotrfico ou dominante (auxotrfico neste caso) tambm amplificado, geralmente a partir de um plasmdeo que o contenha (por exemplo, o plasmdeo pyrG, que possui o gene marcador de seleo URA-). Esses trs fragmentos (ORF 5, ORF 3 e marcador de seleo) so ento unidos para formar o cassete de deleo (neste caso), o qual inserido em um plasmdeo atravs de uma regio de homologia existente entre as extremidades do cassete e o stio mltiplo de clonagem do plasmdeo no qual ser inserido (pRS426, neste caso). Uma vez inserido no plasmdeo, o cassete em questo pode ser obtido em larga escala por PCR e ser empregado nos fins desejados A montagem desse cassete, bem como a sua insero no plasmdeo, realizada in vivo por recombinao homloga dentro de um organismo modelo: a levedura Saccharomyces cerevisiae. A recombinao homloga um processo celular essencial, onde enzimas especficas e altamente reguladas so utilizadas para misturar e rearranjar cromossomos homlogos, especialmente quando os cromossomos so pareados antes da primeira diviso nuclear no processo de meiose. Durante o pareamento e atravs da recombinao homloga, ocorrem permutaes (ou trocas) entre genes localizados nos cromossomos homlogos; essa permuta gentica normalmente conhecida como sobrecruzamento ou crossing over. Sendo assim, pode-se inferenciar que a quebra e a religao do DNA um aspecto central da recombinao homloga, resultando na permutao gentica. Alm de gerar a permutao gentica, a recombinao possui outros efeitos nos organismos que a

efetuam, como permitir que as clulas recuperem sequncias perdidas por leses no DNA (substituio da regio danificada por uma fita de DNA que no foi danificada de um cromossomo homlogo), fornecer um mecanismo de reiniciao de forquilhas de replicao que foram interrompidas ou danificadas e at mesmo exercer papel na regulao da expresso de alguns genes (alterao de segmentos cromossmicos especficos, posicionando genes dormentes em stios onde eles podem ser expressos). Sendo assim, a recombinao homloga uma caracterstica dos organismos em que ocorre homologia entre cromossomos, sendo necessria a para a tcnica a utilizao de um organismo que realize esse processo com bastante eficincia, como a S. cerevisiae. A levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada como organismo modelo para tcnicas em biologia molecular por diversos motivos, entre eles: a) as clulas de S. cerevisiae podem se encontrar tanto no estado haplide quanto diplide, sendo que a converso entre esses estados se d por acasalamento (haplide para diploide) e esporulao (diplide para haploide); tal peculiaridade no ciclo de vida da levedura pode ser utilizada para a elaborao de muitos experimentos genticos. b) possui um rico histrico de estudos genticos, sendo que o seu genoma, relativamente pequeno, j todo conhecido, inclusive com muitos padres de expresso gnica caracterizados sob diferentes condies. c) suas clulas alteram a sua forma medida que crescem, sendo possvel identificar facilmente em qual fase do ciclo celular se encontram. Especificamente para essa tcnica, entretanto, as principais caractersticas da S. cerevisiae que sero exploradas so o seu fcil cultivo em um intervalo de tempo curto e a sua alta taxa de eficincia da recombinao homloga (em torno de 95%) mesmo com regies curtas de homologia (em torno de 50 pb), necessria para a unio dos fragmentos flanqueadores com o marcador de seleo e a insero desse novo fragmento no plasmdeo. O objetivo dessa aula prtica construir cassetes de deleo e/ou substituio gnica utilizando-se de uma estratgia, descrita por Baudin et al., baseada em PCR e recombinao com o uso do organismo modelo Saccharomyces cerevisiae, sendo que os cassetes produzidos podem ento ser empregados em alguns estudo dos j descritos acima. Material e Mtodos Material

- Cultura de S. cerevisiae - Centrfuga - Microcentrfuga

- Tubos de centrfuga - Soluo estril de TE 1x - Soluo de TE 1x/LiAc1x (Tri-EDTA 1x em Acetato de Ltio 1x) - Tubos do tipo falcon - Tubos de microcentrfuga de 1,5 ml - Shaker - DNA de esperma de Salmo - Banho-maria - Isopor com gelo - Soluo de acetato de ltio 1x/PEG 40% - Placas de Petri - Meio SC URA- Ala de Drigalski - Lamparina - Pipetas automticas - Ponteiras para pipetas automticas - Estufa de incubao - PCR (regio flanqueadora 5 regio flanqueadora 3 marcador de seleo) Mtodos

Crescimento da cultura O pr-inculo de S.cerevisiae foi preparado em um tubo do tipo falcon de 50mL, adicionando 1 colnia (3 a 5mm, aproximadamente) rejuvenescida da linhagem de S. cerevisiae SC 9421 crescida em meio YPD slido em 20mL do meio de cultura YPD. Esse tubo foi incubado sob agitao de 200 rpm a 30C durante a noite (cerca de 18-20 horas). Na manh seguinte, aps o crescimento do pr-inculo, foram inoculados 500L da cultura em erlenmeyer contendo 50mL de YPD. O erlenmeyer foi incubado a 30C sob agitao constante at que fosse atingida a DO600 de 0,4 e 0,6 (aproximadamente 3-4 horas de incubao), condio em que se tem clulas jovens, em fase exponencial de crescimento. O espectrofotmetro foi calibrado utilizando-se meio YPD lquido como branco. Obs.: devido ao tempo de incubao e durao da fase de crescimento da cultura, os procedimentos at aqui j foram realizados, sendo que o grupo j disps de um erlenmeyer contendo a cultura com densidade ptica variando entre 0,4 e 0,6. Separao e lavagem das clulas obtidas

A cultura de levedura obtida foi transferida para um tubo de centrfuga e centrifugada a 2500 rpm por 5 minutos. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi descartado e o pellet celular obtido foi gentilmente ressuspenso em 15mL de soluo de TE estril. O tubo foi novamente centrifugado a 2500 rpm por 5 minutos, descartando-se o sobrenadante em seguida. O pellets obtido foi gentilmente ressuspenso em 600L de soluo recm preparada de TE 1x/LiAc 1x (Tri-EDTA 1x em acetato de ltio). Obs.: o mtodo de transformao utilizado neste experimento baseado no uso de acetato de ltio, sendo este reagente fundamental para o processo de transformao e para a obteno de clulas competentes; cada reao de transformao utiliza 200L de clulas competentes geradas pelo mtodo baseado em acetato de ltio, sendo que sero trs transformaes no total: um controle negativo, um controle positivo e a reao de interesse. Preparo das reaes de transformao O tubo com as clulas em 600L de TE 1x/LiAc 1x do passo anterior foi incubado por 1 hora a 30C sob agitao constante (200 rpm) em um shaker. Aps a incubao, o contedo do tubo foi distribudo em trs tubos de microcentrfuga de 1,5mL, de acordo com a tabela abaixo para compor as reaes de transformao. A seguir, um frasco contendo uma soluo de fragmentos de DNA de esperma de salmo (10mg/mL estoque) foi incubado por 5 minutos em banho-maria fervente para que o DNA fosse desnaturado; aps a desnaturao, o tubo foi colocado imediatamente no gelo para evitar a renaturao do DNA, sendo que este deve ser imediatamente utilizado nas reaes de transformao conforme a tabela. Os trs tubos foram incubados a 30C por 30 minutos no shaker sob agitao constante (250 rpm). Em seguida, os tubos foram retirados do shaker e, utilizando-se de uma chama para propiciar condies estreis, foi adicionado 1mL de uma soluo recm preparada de acetato de ltio 1x/polietilenoglicol (PEG) 40% em cada tubo, misturando-se cada um por inverso cerca de 5 vezes. Os tubos foram ento incubados a 42C por 30 minutos para se aplicar o choque trmico. (Esse momento crucial e deve ser muito bem controlado, pois nessa etapa que o DNA exgeno entrar na clula da levedura que foi permeabilizada pelo acetato de ltio. Uma vez o material gentico dentro da clula, ocorrer a reao de recombinao homloga e unio dos fragmentos entre si e a sua unio ao plasmdeo pRS426). As clulas, ento, foram centrifugadas em uma microcentrfuga a 4000 rpm por 2 minutos. A seguir, em condies de esterilidade, os sobrenadantes foram descartados e os pellets resultantes foram ressuspendidos com 1 mL de TE 1x estril (pH 7,5). Os tubos foram novamente centrifugados a 4000 rpm por dois minutos, e os sobrenadantes foram novamente descartados. Os pellets resultantes foram ressuspendidos em 100L de TE 1x estril.

Obs.: a soluo contendo fragmentos de DNA de esperma de salmo armazenada na concentrao de 10mg/mL. Deve obrigatoriamente ser desnaturado no momento do uso e funcionar como carreador do DNA exgeno que ser inserido na levedura.

Tabela 1: Reaes de transformao de S. cerevisiae e seus componentes Tubo Plasmdeo pRS426 circular (200500ng) regio flanqueadora linearizado 3 (EcoRI/BamHI) (200-500ng) 5 (0,5-1g) regio flanqueadora 3 (0,5-1g) marcador de seleo pyrG (0,5-1g) 5 5 20L 5 Produto de PCR Volume (L) 5 DNA de esperma de salmo fragmentado e desnaturado 20L 20L Propsito da reao controle negativo controle positivo

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construo do cassete

Inoculao das clulas em meio seletivo Trs placas de meio slido SC URA- (synthetic complete sem uracila) foram preparadas (previamente); a ausncia de uracila no meio permite apenas o crescimento das clulas que incorporaram o plasmdeo recombinado contendo o gene URA. As placas foram, ento, identificadas como controle negativo, controle positivo e reao de recombinao. As clulas foram inoculadas nas placas com o auxlio de uma pipeta e espalhadas usando-se uma ala de Drigalski flambada, sendo que esta foi esterilizada aps cada inoculao para se evitar contaminao cruzada entre o contedo dos tubos. As placas foram ento incubadas a 30C durante 3 ou 4 dias para que se fosse possvel visualizar as clulas de levedura que cresceram sobre o meio seletivo. Resultado e Discusso

O crescimento de colnias de Saccharomyces cerevisiae em meio seletivo SC URA (synthetic complete sem uracila) evidncia a ocorrncia de recombinao homloga nesses organismos, pois a cepa de levedura utilizada no experimento no possui o gene para a produo de uracila, que faz com que a mesma tenha que ser cultivada em meios em que a uracila est presente. Portanto, o crescimento das colnias em meio seletivo indica que essas leveduras incorporaram um cassete de deleo, ou seja, um fragmento de DNA exgeno com gene para a produo de uracila em seu genoma, o que causou uma alterao no fentipo das mesmas, que passaram a produzir uracila. A anlise das fotos tambm indica que houve contaminao no experimento, uma vez que, houve o crescimento de colnias de bactria no controle negativo. Concluso A Saccharomyces cerevisiae muito eficiente no processo de transformao, uma vez que houve desenvolvimento efetivo das colnias nas placas. Isso comprova o sucesso na construo dos cassetes de deleo e/ou substituio atravs de estratgia baseada em PCR e recombinao in vivo, os quais podem ser posteriormente extradaos e amplificados via PCR. Referncias Baudin, A.; Ozier-Kalogeropoulos, O.; Denouel, A.; Lacroute, F.; Cullin, C. (1993) A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic acids research. 21, 3329-3330 Openthesis. Construo de um vetor integrativo em mltiplas cpias para Saccharomyces cerevisiae utilizando seqncias delta. Disponvel em: <http://www.openthesis.org/documents/de-um-vetor-integrativo-em-496905.html>. Acesso em: 22/11/11, 10h23min. Watson, J. D.; et al. Biologia Molecular do Gene. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 762 p., il.