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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE Ana Karin Marchel Paluch Carlos Henrique Antunes

Nauna Hay Paiva Tatiana Renesto Vieira

Relatrio de prticas de Imunologia : Tipagem sangunea Teste do beta hCG Protena C reativa ( PCR)

Relatrio entregue disciplina Imunologia do curso de cincias biolgicas como nota parcial da avaliao do 2 bimestre. Professora : Elisngela Gueiber

Outubro/2011

EXPERIMENTO 1 : TIPAGEM SANGUNEA INTRODUO H vrios grupos sangneos herdados independentemente entre si sendo que so conhecidos diversos sistemas de grupo sangneos. O sistema ABO o de maior importncia na prtica transfusional e no ensino da imunologia por ser o mais imunognico, ou seja, por ter maior capacidade de provocar a produo de anticorpos, seguido pelo sistema Rh. Os antgenos deste sistema esto presentes na maioria dos tecidos do organismo. Fazem parte deste sistema trs genes A, B e O podendo qualquer um dos trs ocupar o loco ABO em cada elemento do par de cromossomos responsveis por este sistema. Os genes ABO no codificam diretamente seus antgenos especficos, mas sim enzimas carreadoras que tem a funo de transportar acares especficos, para uma substncia precursora na superfcie dos eritrcitos resultando nos antgenos ABO. O indivduo do grupo AB possuidor de um gene A e de um gene B, sendo que um foi herdado da me e o outro do pai. Ele possui nos seus glbulos vermelhos os antgenos A e B e seu gentipo AB. No caso do grupo O, foi herdado do pai e da me o mesmo gene O. As clulas de grupo O so reconhecidas pela ausncia de antgeno A ou B. Quando o gene O herdado ao lado de A, apenas o gene A se manifesta; e se herdado ao lado do gene B apenas o gene B se manifesta. O Sistema Rh caracterizado pela presena ou ausncia do antgeno D. Ao contrrio do sistema ABO, um individuo sem o antgeno D no possui anticorpos anti-D se nunca tiver sido exposto ao antgeno. O antgeno D s produzido aps o contato. Nas transfuses sangneas, em relao ao sistema ABO, preciso considerar, inicialmente, que a taxa de aglutinognios nas hemcias significativamente maior que a taxa de aglutininas no plasma. Dessa maneira, so inviveis as transfuses em que o sangue doado contm aglutinognios que encontraro no receptor as aglutininas contrastantes. Isso significa que, se o sangue doado apresenta aglutinognios A, o sangue do receptor no pode conter

aglutininas anti-A; e que, se o sangue doado contm aglutinognios B, o receptor no pode apresentar aglutininas anti-B. Assim, exemplificando, um indivduo do grupo B no pode doar sangue para outro do grupo O, uma vez que as aglutininas anti-B do receptor reagiriam com os aglutinognios B do doador, semelhana de uma reao antgeno-anticorpo. Dessa reao, na qual os aglutinognios B atuariam como antgeno (estranho ao receptor do grupo O) e as aglutininas anti-B como anticorpos, resulta a aglutinao do sangue doado, fato que pode provocar a obstruo de vasos sangneos, com conseqncias que podem levar o receptor morte. No entanto, um indivduo do grupo O pode doar sangue para outro do grupo B. Isso porque o volume de sangue doado no contm aglutininas em taxa suficientemente grande para provocar a aglutinao das hemcias do receptor. Observe ento, que as hemcias que se aglutinam so aquelas presentes no sangue doado e, para tanto, devem conter aglutinognios (antgenos) estranhos, isto , que no existem no sangue do receptor. Este sistema ABO, tambm pode ocasionar incompatibilidade materno-fetal, com desenvolvimento da doena hemoltica do recm nascido. Apresenta tambm importncia em transplantes renais ou cardaco, com menor papel nos hepticos ou de medula ssea. Em alguns processos pode ocorrer a perda parcial do antgeno A ou B, como em algumas leucemias. REAO DE AGLUTINAO A medida direta da ligao de um anticorpo ao antgeno especfico utilizada na maioria dos ensaios sorolgicos. Alguns importantes ensaios esto baseados na capacidade do anticorpo se ligar ao antgeno e esta ligao levar a uma alterao do estado fsico do antgeno. Estas interaes secundrias podem assim ser detectadas de diversas maneiras. Por exemplo: quando o antgeno est presente numa superfcie de uma partcula grande como, por exemplo, uma bactria, ou um eritrcito, os anticorpos, uma vez ligados, levam estas partculas a se agruparem num fenmeno conhecido por aglutinao. O mesmo princpio aplica-se s reaes utilizadas para determinao dos grupos sanguneos, onde os antgenos encontramse na superfcie das hemcias e esta reao de aglutinao causada pela ligao do anticorpo denominada hemaglutinao (do grego ,haima, sangue).

Este procedimento utilizado para determinar o grupo sanguneo ABO e tambm pode ser utilizado para o grupo Rh, mas deve-se levar em considerao que somente 75% dos indivduos Rh positivos (D positivos) podem ser tipados desta forma, j que existem os D fracos que necessitam ser testados pela forma de aglutinao indireta (Coombs indireto). Para a tipagem utiliza-se anticorpos (aglutininas) anti-A ou anti-B e anti-D que se ligaro nos determinantes antignicos A, B e D respectivamente presentes nas hemcias (aglutinognios). Estes aglutinognios esto presentes num grande nmero de cpias na superfcie das hemcias levando as clulas a se ligarem cruzadamente entre si quando da ligao do anticorpo especfico. Estas ligaes cruzadas ocorrem pela interao das clulas pela ligao simultnea de uma mesma molcula de anticorpo em clulas diferentes, j que cada molcula de Ig possui pelo menos dois stios de ligao ao antgeno. OBJETIVOS: Determinar a tipagem sangunea de uma amostra pr-coletada Observar as reaes de aglutinao Materiais Utilizados: Sorologia: Anti A Anti B Anti AB Anti D 4 tubos de ensaio Amostra de sangue pr-coletada Soluo salina Centrfuga PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Preparou-se uma suspenso com dezenove gotas de soluo salina 0,95 L e uma gota de sangue 50 L -.Em seguida, acrescentou-se uma gota de suspenso em cada tubo de ensaio,sendo que eram quatro tubos.Esses tubos foram identificados como A,B,AB e Rh,e com o auxilio de uma micropipeta calibrada em 0,50 L adicionou-se uma gota de soro monoclonal Anti A no tubo A,uma gota de

soro monoclonal Anti-B no tubo B ,uma gota de Anti AB no tubo AB,e por fim, uma gota de Anti D ou Rh no tubo Rh. Esses tubos foram centrifugados por um minuto a 1000 RPM. RESULTADOS E DISCUSSO Aps a centrifugao foram obtidos os seguintes resultados: Soro Anti A Anti B Anti AB Anti D ou Rh Tubo A B AB Rh Resultado No aglutinou No aglutinou No aglutinou Aglutinou

Neste procedimento realizado em laboratrio com o auxilio do soros contendo anticorpos para tipagem sangunea, podemos verificar que a amostra de sangue coletada era do tipo sanguneo O+. Constatou-se isso porque nenhuma das amostras aglutinou, o que pode-se deduzir que no era nem A, nem B e nem AB. positivo pois aglutinou com o anti D ou Rh. A no aglutinao resultado da no reao do anticorpo com o antgeno, fato esse que torna o tipo sanguneo O doador universal. CONCLUSO: sangue tipo O +

EXPERIMENTO 2 - beta hCG Introduo A gonadotrofina corinica humana (hCG) um hormnio glicoprotico, de alto peso molecular, produzido pelo tecido trofoblstico normal e tumoral. De relevncia para a prtica clnica, a hCG apresenta propriedades qumicas, biolgicas e imunolgicas. Tem na sua estrutura qumica duas cadeias de polipeptdeos, alfa e beta, ligadas por carboidratos. A subunidade alfa semelhante a dos outros hormnios glicoproticos - hormnios luteinizantes (LH), hormnio folculoestimulante (FSH) e hormnio liberador de tirotropina (TSH). Em contraste, a subunidade beta que determina a atividade biolgica e a especificidade

imunoqumica da molcula da hCG. Concentraes de b-hCG no soro de mulheres saudveis, no-grvidas, so menores ou iguais a 5 mUI/ml, que so consideradas o nvel de corte. A gonadotrofina corinica humana interage com os receptores LHCG e promove a manuteno do corpo lteo durante o incio da gravidez, fazendo-o secretar o hormnio progesterona. A progesterona enriquece o tero com um espesso revestimento dos vasos sanguneos e capilares para que ele possa sustentar o crescimento fetal. Devido a sua alta carga negativa, o beta hCG pode afastar clulas imunizarias da me, protegendo o feto durante o primeiro trimestre. Tambm tem sido hipotetizado que o hCG pode ser um vnculo placentrio para o desenvolvimento local da imunotolerncia materna. Por exemplo, clulas endometriais, tratadas com hCG induzem um aumento da apoptose de clulas T (dissoluo das clulas-T). Tambm tem sido sugerido que os nveis do hCG esto ligados severidade do enjo matinal apresentado pelas mulheres grvidas. Por causa de sua semelhana com o LH, o hCG tambm pode ser usado clinicamente para induzir a ovulao nos ovrios, bem como produo de testosterona nos testculos. Como a mais abundante fonte biolgica so as mulheres grvidas, algumas organizaes chegam a coletar urina de mulheres grvidas para extrair hCG para uso no tratamento de fertilidade. A gonadotrofina corinica humana tambm desempenha um papel na diferenciao celular / proliferao e pode ativar a apoptose. Nos indivduos do sexo masculino a presena de Beta hCG nos exames clnicos indica alguma anomalia celular nos testculos,ou seja, um indicativo de tumores de testculos. Em mulheres o aumento da concentrao plasmtica desse hormnio pode indicar o caso clinico denominado como Doena Trofoblstica Gestacional,popularmente conhecida como Moli Hidatiforme. Nessa condio ocorre um crescimento exagerado da placenta que leva a produo exarcebada do hormnio hCG.Durante o exame laboratorial concentraes acima do normal

Testes hCG

Nveis de hCG podem ser medidos no sangue ou na urina. Mais comumente, isto feito com a finalidade de obter um teste de gravidez, destinado a indicar a presena ou ausncia de um embrio implantado. A maioria dos testes de gravidez emprega um anticorpo monoclonal, que especfico para a subunidade do -hCG (bHCG). Este procedimento empregado para garantir que os testes no resultem em falsos positivos confundindo o hCG com FSH ou LH. (Os dois ltimos so sempre presente em diferentes nveis no corpo, enquanto que a presena de hCG quase sempre indica a gravidez.). O teste hCG de urina pode ser um ensaio imunoenzimtico cromatogrficos ou qualquer outro formato de testes, caseiros, consultrio mdico ou de base laboratorial. No incio de gravidez, resultados mais precisos podem ser obtidos usando a primeira urina da manh quando os nveis de hCG so mais elevados. Quando a urina diluda (densidade especfica inferior a 1.015), a concentrao de hCG pode no ser representativa da sua concentrao no sangue e, o teste pode ser um falso negativo. O exame beta hCG de sangue feito utilizando 2.4 ml de sangue venoso, tipicamente uma quimio ou Imunoensaio Fluorimtrico que podem detectar nveis bHCG to baixos quanto 5 mIU / ml e permite a quantificao da concentrao de bHCG. A capacidade de quantificar o nvel bHCG til no acompanhamento das clulas germinativas trofoblstica e tumores, cuidados comuns aps um aborto, e no diagnstico e acompanhamento dos cuidados ps-tratamento de gravidez ectpica. A visvel falta de um feto em uma ultra-sonografia vaginal aps terem alcanado nveis bHCG de 1500 UI / ml um forte indicativo de gravidez ectpica. Testes usando os nveis de hCG so tambm um elemento do triplo teste, um teste de rastreio para certas anomalias cromossmicas fetais / defeitos congnitos O ELISA (do ingls, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) se baseia na identificao de anticorpos e ou antgenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reao faz com que o cromgeno mude de cor. O produto da reao, alm de colorido, insolvel para no difundir do local da formao. A reao desenvolvida, freqentemente, em microplacas contendo vrios poos onde so depositados os reagentes. H vrias maneiras (mtodos) de se processar o ensaio imunoenzimtico.

O mtodo competitivo mais usado para identificao de antgenos, mas pode tambm ser empregado para a deteco de anticorpos. Neste mtodo primeiro se adsorve o anticorpo no poo da microplaca. Aps a adsoro do anticorpo, uma soluo que possivelmente contm o antgeno adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O prximo passo adicionar o antgeno marcado com uma enzima. Os poos que no possuem o antgeno primrio (da soluo problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poos que possuem antgenos aderidos aos anticorpos no mudam de cor. O mtodo indireto utilizado para deteco de anticorpos. Neste caso o antgeno fica aderido aos poos da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A presena de cor nos poos indica a presena do anticorpo, e os poos que no mudarem de cor indica a ausncia do anticorpo em questo. O mtodo de sanduche, ou captura, indicado para identificao de antgenos, e este antgeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primrio especfico ao antgeno adsorvido no poo da microplaca. Em seguida o antgeno na soluo problema adicionado. Depois o segundo anticorpo especfico ao antgeno marcado com uma enzima adicionado. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A presena de cor nos poos indica a presena do antgeno, e os poos que no mudarem de cor indica a ausncia do antgeno em questo. OBJETIVOS Deteco qualitativa de B-hCG em amostras. MATERIAIS : 2 amostras com controle positivo hCG Amostra com controle negativo hCG Pocinhos Bloqueador - > H2SO4 Substrato Pipeta graduada gua destilada

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: Adicionou-se 50L da amostra em 3 pocinhos. No primeiro pocinho adicionou-se o controle positivo uma concentrao baixa, no segundo o controle negativo e no terceiro outro controle positivo, porm uma concentrao maior. Esperou-se 5 minutos temperatura ambiente. Na seqncia lavou-se a amostra 5 vezes com gua destilada. Aps colocou-se 50L do conjugado nos mesmos 3 pocinhos em T.A e esperou-se 5 minutos. Lavou-se novamente 5 vezes. Colocou-se 50L do substrato e esperou-se 5 minutos a T.A. Observou-se e anotou-se os resultados. Em seguida pipetou-se 50L H2SO4 (bloqueador). Observou-se novamente a reao e anotou-se os resultados da mesma. RESULTADOS E DISCUSSO Primeiramente, com a adio do conjugado nos 3 pocinhos, obteve-se a seguinte colorao em cada um : Tabela 1 Controle positivo (concentrao baixa) Amarelo Aps a adio Controle negativo Incolor Controle positivo (concentrao alta) Amarelo

do substrato em cada pocinho, observou-se a mudana na

colorao, como pode ser vista na tabela abaixo: Tabela 2 Controle positivo (concentrao baixa) Azul claro Controle negativo Incolor Controle positivo (concentrao alta) Azul um pouco mais escuro em relao ao 1 pocinho

Com a adio do bloqueador H2SO4, obteve-se os seguintes resultados: Tabela 3 Controle positivo Controle negativo Controle positivo

(concentrao baixa) Amarelo

Incolor

(concentrao alta) Amarelo

As amostras positvas onde foi adicionado o conjugado ficaram amarelas, demonstrando a presena do anticorpo. Aps a adio do substrato, as amostras positivas reagiram com o anticorpo anti-hCG, pelo princpio da reao sanduche ( anticorpo-antgeno-anticorpo-enzima-substrato) por isso tornam-se azuis. Com a adio do bloqueador, essa reao cessa e as amostras voltam tonalidade inicial ( amarela) .

CONCLUSO: Pode-se concluir a eficincia do exame laboratorial de deteco do beta Hcg, porm o mesmo deve ser feito conforme as recomendaes de um mdico, pois vrios fatores como a concentrao do hCG na amostra podem alterar os resultados de forma determinante EXPERIMENTO 3 - Protena C Reativa (PCR)

A Protena C-Reativa (PCR) uma protena de fase aguda, cujos nveis

aumentam desde 0,07 mg/L at 150 mg/L dentro dos cinco primeiros dias de um processo inflamatrio. Por outro lado sua vida mdia suficientemente curta, permitindo que os nveis caiam rapidamente quando o processo inflamatrio diminui. As protenas da fase aguda so especialmente valiosas na determinao da atividade da enfermidade assim como no prosseguimento da resposta frente ao tratamento. Assim, os nveis elevados de PCR tm valor diagnstico para a confirmao e prosseguimento dos processos reumticos como artrite reumatide, poliartrite, vasculite sistmica, polimialgia reumtica. Alm disso, possvel realizar um diagnstico diferencial nos processos com sintomas similares, porm que originam respostas bastante diferentes sob o ponto de vista das protenas da fase aguda. Por exemplo, os nveis de PCR na doena de Crohn so significativamente menores que no processo de colite ulcerosa, para uma mesma intensidade inflamatria. Isso tambm ocorre quando se comparam os nveis de PCR de pacientes com lpus eritematoso sistmico com os de pacientes com artrite reumatide. Outros processos em que se obtm uma ativao das protenas da fase aguda so todos aqueles em que ocorre dano tissular ou infeco. Isto especialmente til no acompanhamento ps-operatrio do paciente, j que permite avaliar tanto a recuperao do mesmo, como detectar de forma prematura uma possvel infeco. Durante as fases iniciais de doena, a concentrao de PCR plasmtica aumenta mais rapidamente do que a velocidade de hemossedimentao e desaparece imediatamente aps a recuperao. Por esta razo, a determinao de PCR no somente de valor diagnstico, como tambm oferece indicaes sobre a evoluo do processo inflamatrio e a efetividade da terapia.

OBJETIVOS:Determinar a presena da protena C reativa nas amostras utilizando tcnicas diferentes

MATERIAIS: Soluo salina Soro controle positivo e negativo

Suspenso de ltex, revestida com anticorpo monoclonal anti-PCR Varetas plsticas Cartes de teste Tubo de ensaio Pipeta volumtrica . PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Teste Qualitativo: Pipetou-se 25 L da amostra do soro do paciente em uma rea da lmina. Em seguida homogeneizou-se a suspenso de ltex e pipetou-se 25 L na mesma rea da amostra. Com uma vareta de plstico misturou-se o soro com o ltex, espalhando cuidadosamente na rea de observao da reao.Atravs de movimentos suaves de rotao, observou-se durante 2 minutos a formao de uma eventual aglutinao. Diluio em tubo: Em um tubo de ensaio, adicioniou-se 10 L da amostra do soro juntamente com 40 L de soluo salina e observou-se ( efeito de zona).Em seguida, com o auxlio da pipeta, coletou-se 25 L da diluio e pipetou-se no carto de teste, e posteriormente pipetou-se 25 L de ltex. Misturou-se com uma vareta de plstico, realizou-se movimentos rotatrios e observou-se a aglutinao aps 2 minutos. Diluio sereada: Diluiu-se o soro do paciente em salina (NaCl a 0,9%) 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e em seguida pipetou-se 25 l de cada diluio em cada rea do carto-teste. Homogeneizou-se a suspenso de ltex e pipetar 25l em cada rea onde se encontra a diluio da amostra. Misturou-se o soro com o ltex, espalhando-se cuidadosamente com uma vareta plstica (uma para cada diluio). Atravs de movimentos suaves de rotao observou-se durante 2 minutos a formao de aglutinao. RESULTADOS E DISCUSSO: Teste qualitativo: Resultado positivo para o teste qualitativo: Aglutinao tnue ou ntida.

Caso o resultado desse negativo a suspenso no carto de teste seria homognea, poderia se atribuir uma total ausncia de aglutinao, ou seja, a concentrao da pcr estaria inferior ao valor de referncia. Teste semi-quantitativo : O ttulo da amostra corresponder a maior diluio em que ocorrer aglutinao. A concentrao de PCR ser dada pelo seguinte clculo: Concentrao (mg/litro) = 6 X D, onde 6 a sensibilidade do teste e D, a maior diluio que apresenta aglutinao. Se o ttulo obtido for 1:8, a concentrao aproximada de PCR existente na amostra ser: 6 x 8 = 48 mg/litro. Indivduos normais apresentam concentrao de PCR igual ou menor que 6 mg/litro. O resultado foi positivo, portanto a presena de aglutinao indicando um teor de PCR igual ou superior a 6mg/dL. Visualiza-se uma aglutinao macroscpica que varia desde a mg/dL. Visualiza-se uma aglutinao macroscpica que varia desde a formao de grumos finos at grumos grosseiros. Caso o resultado desse negativo a ausncia de aglutinao indicaria um teor de PCR inferior a 6 mg/dL e a suspenso seria homognea

CONCLUSO: O Imuno-Ltex PCR apresentou uma grande sensibilidade ao soro do paciente o que efetivou a prtica como resultado positivo.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

JANEWAY, C.A. e cols. Imunobiologia: O sistema imune na sade e na doena, Editora ARTMED, 2002. Disponvel em: http://www.webartigos.com/articles/23229/1/Teste-de-Gravidez/pagina1.html em 03/10/2011 http://www.abcdasaude.com.br/artigo.php?207 acesso em 03/10/2011 acesso