GENETICA, algunos apuntes

Dr. Julio Hilario Vargas

Profesor Asociado Departamento de Fisiologa Humana Facultad de Medicina

Huntingtons disease is an autosomal dominantly inherited disease that usually starts in midlife and inevitably leads to death. We studied the proteome of a well established mouse model by large gel two-dimensional electrophoresis. We could demonstrate for the first time at the protein level that 1antitrypsin and B-crystalline both decrease in expression over the course of disease. Maintaining 1-antitrypsin and B-crystallin availability during the course of Huntingtons disease might prevent neuronal cell death and therefore could be useful in delaying the disease progression
Zabel C, Chamrad DC, Priller J, Woodman B, Meyer HE, Bates GP and KloseJ. Alterations in the Mouse and Human Proteome Caused by Huntingtons Disease. Molecular & Cellular Proteomics 1:366375, 2002.

Collins et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921. 2001

http://www.ensembl.org/index.html

J. Craig Venter, et al. The Sequence of the Human Genome. Science 291, 1304 (2001)

http://www.celera.com/celera/Proteomics_R_D

http://genomics.energy.gov/

Project goals were to: - Identify all the approximately 20,000-25,000 genes in human DNA, - Determine the sequences of the 3 billion chemical base pairs that make up human DNA, - Store this information in databases, - Improve tools for data analysis, - Transfer related technologies to the private sector, and - Address the ethical, legal, and social issues (ELSI) that may arise from the project.

The organization of genes on a human chromosome

Human chromosome 22 small only 48,000,000 base pairs (1.5% of genome)

Normal male (XY) human karyotype using painting technique

Human genome 3.2 X 109 nucleotide pairs (diploid human cell = 6.4 X 109 nucleotide pairs) ~30,000 genes (possibly as high as 5060,000 cell type specific)

The Human Genome - Facts

Only 1.1% of the human genome is actually composed of exons that code for protein structure 25 % of the genome represents intronic sequences or regions of DNA between exons that are spliced out. 75% of the genome is composed of intergenic DNA for which we have no significant understanding of its function or role in the process of gene transcription into RNA or translation into protein

J. Craig Venter, et al. The Sequence of the Human GenomeScience 291, 1304 (2001)

Representation of the nucleotide sequence content of the human genome

LINE = long interspersed nuclear element SINE = Short interspersed nuclear element LINES, SINES and transposons multiply Heterochromatin (10%) large tandem arrays of simple repeats tightly packed Euchromatin (90%) less tightly packed, segments rich in unique sequences ~ half of the unique sequence are genes (though only < 2% protein coding)

The Human Genome - Facts

Despite the large phenotypic differences between individuals, the similarity in the structure of human DNA from one individual to another is striking. It has been estimated that we share at least 99.9% of our nucleotide code, suggesting that any two individuals differ by only 0.1%.
J. Craig Venter, et al. The Sequence of the Human GenomeScience 291, 1304 (2001)

The Human Genome - Facts

The genome can be considered a historical record the genome carries significant information as to how our ancestors evolved and were affected by their environment through natural selective processes. For example, it is believed that proto-oncogenes, such as c-Src, were incorporated into our genome long ago via retroviral infections to assume roles in cellular growth and replication

Alteraciones genticas: Mutaciones. Clases. frecuencia de mutaciones. Mutaciones somticas y de lnea germinal
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Vectores: de clonacin, de expresin, de lanzadera. Tipos, fagos, plsmidos, csmidos, yac

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Proyeccin de terapia gnica. Animales transgnicos. Mtodos para crear animales transgnicos. Microinyeccin de DNA. Transferencia gentica

Alteraciones genticas

Mutaciones
Son cambios en el material gentico. Las mutaciones causan: Dao genotpico Pueden ser letales Pueden ser silenciosas Correr el marco de lectura Cambiar un nucletido.

Alteraciones genticas

Mutaciones
Causantes de la evolucin Responsables de la variabilidad gentica Favorecen la adaptacin de los organismos a ambientes diversos

Alteraciones genticas

Mutaciones
Pueden ser: Mutaciones inducidas exposicin a agentes mutagnicos qumicos (carcingenos) fsicos Mutaciones espontneas sin causa conocida bajo nivel de error metablico.

Alteraciones genticas

Mutaciones
MOLECULARES Sustitucin de una sola base Sentido errado Sin sentido Silentes Disociativas Inserciones y deleciones Sindrome X fragil Huntington CROMOSOMICAS Duplicaciones Translocaciones Inversiones GENOMICAS o NUMERICAS
Poliploidia Haploida Aneuploidia

Alteraciones genticas

Mutaciones
MOLECULARES Sustitucin de una sola base Sentido errado Sin sentido Silentes Disociativas Inserciones y deleciones Sindrome X fragil Huntington CROMOSOMICAS Duplicaciones Translocaciones Inversiones GENOMICAS o NUMERICAS
Poliploidia Haploida Aneuploidia

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Sustitucin de una sola base

Sentido errado Nuevo nucletido altera el codon y genera un nuevo AA en la protena Ejemplo: Anemia de clulas falciformes A x T en nucletido 17 del gen de la cadena beta de la Hb. GAG A GTG= Glutmico por valina

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Sustitucin de una sola base

Sin sentido Altera alguno de los codones de terminacin: TAA, TAG, or TGA La traduccin del RNA transcrito a partir del gen mutante presentar una terminacin prematura Ejemplo: Fibrosis Qustica. Protena transporta Cl- fuera de la clula Mas de una mutacin.

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Sustitucin de una sola base

Silentes Mas de un codn para una AA Ejemplo si la ltima base de TCT es sustituida por cualquiera de las otras tres generar todava serina - La mayora de los polimorfismos proceden de mutaciones silentes.

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Sustitucin de una sola base

Disociativas Al momento de la fase de remocin de intrones del pre-mRNA Seales de nucletidos guan la maquinaria enzimtica con gran precisin Si se producen mutaciones en estas seales una parte del intrn permanece y genera una protena anmala

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Inserciones y deleciones
Adicin o remocin de bases Deslizamiento de las bases hacia delante o hacia atrs Traduccin del RNA en nuevos grupos de codones generndose una protena diferente a partir de estos codones Nuevos codones de terminacin, mutaciones sin sentido

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Insercin de copias del mismo triplete

Sindrome X frgil Enfermedad de Hungtington

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Sindrome X frgil
Cromosoma X: 5 a 50 Repeticiones CGG Hasta 100 no son patolgicas Localizadas en regin intrnica Repeticiones ms grandes (4000) tienden a constreir el cromosoma X lo cual lo hace frgil Hombres que lo heredan sufren de retardo mental. Las mujeres son poco afectadas

Alteraciones genticas

Mutaciones moleculares

Enfermedad de Hungtington
Nucletido repetido CAG. Adicin de glutamina En la secuencia original hay 34 repeticiones, y en la enfermedad, ms de 40 No estn establecidas completamente las bases fisiopatolgicas de la enfermedad, se cree que esas "colas adicionales de glutamina", hacen que las protenas interaccionen entre s de manera hidrofbica y se facilite la formacin de precipitados y acmulos proticos, especialmente en el cerebro Protena interfiere transmisin sinptica en zonas del cerebro y produce apoptosis en estas clulas. Alteraciones genticas

Alteraciones genticas

Mutaciones
MOLECULARES Sustitucin de una sola base Sentido errado Sin sentido Silentes Disociativas Inserciones y deleciones Sindrome X fragil Huntington CROMOSOMICAS Duplicaciones Translocaciones Inversiones GENOMICAS o NUMERICAS
Poliploidia Haploida Aneuploidia

Alteraciones genticas

Mutaciones cromosomicas

Duplicaciones
Meiosis Mala alineacin entre las cromtides hermanas al momento del entrecruzamiento puede generar un doble gen

Alteraciones genticas

Mutaciones cromosomicas

Alteraciones genticas

Mutaciones cromosomicas

Translocaciones
Transferencia de una pieza de un cromosoma a otro no homlogo Son homlogas. Ambos cromosomas ceden una pieza La ruptura puede destruir un gen Influencia de un nuevo promotor. Linfoma de Burkitt Se inserta un gen generando un gen hbrido. Cromosoma Filadelfia. Leucemia mielgena crnica. Gen bcr-abl.

Alteraciones genticas

Mutaciones cromosomicas

Translocaciones

Alteraciones genticas

Mutaciones cromosomicas

Inversiones
Es el cambio de sentido de un fragmento del cromosoma

Alteraciones genticas

Mutaciones
MOLECULARES Sustitucin de una sola base Sentido errado Sin sentido Silentes Disociativas Inserciones y deleciones Sindrome X fragil Huntington CROMOSOMICAS Duplicaciones Translocaciones Inversiones GENOMICAS o NUMERICAS
Poliploidia Haploida Aneuploidia

Alteraciones genticas

Mutaciones genmicas o numricas

GENOMICAS O NUMERICAS
Son las mutaciones que afectan al nmero de cromosomas o todo el complemento cromosmico (todo el genoma). Poliploida: Aumento del nmero normal de juegos de cromosomas . Los seres poliploides pueden ser autopoliploides, si todos los juegos proceden de la misma especie, o alopoliploides, si proceden de la hibridacin, es decir, del cruce de dos especies diferentes. Haploida: Son las mutaciones que provocan una disminucin en el nmero de juegos de cromosomas.

Alteraciones genticas

Mutaciones genmicas o numricas

GENOMICAS O NUMERICAS
Aneuploida: Afectan slo a un nmero de ejemplares de un cromosoma o ms, pero no al juego completo. Las aneuploidas pueden ser monosomas, trisomas, tetrasomas, etc, cuando en lugar de dos ejemplares de cada tipo de cromosomas, que es lo normal, hay o slo uno, o tres, o cuatro, etc. Entre las aneuplodas podemos encontrar diferentes tipos de trastornos genticos en humanos como pueden ser: Trisoma 21 o Sndrome de Down que tienen 47 cromosomas. Trisoma 18 o Sndrome de Edwards. Tambin tienen 47 cromosomas. Monosoma X o Sndrome de Turner. Trisoma sexual XXX o Sndrome del triple X. Trisoma sexual XXY o Sndrome de Klinefelter. Trisoma sexual XYY o Sndrome del doble Y.

Alteraciones genticas

Mutaciones genmicas o numricas

Alteraciones genticas

Frecuencia de Mutaciones
Raras, menos del 1 % de la poblacin Sorprendente dado la cantidad de base que se heredan de cada progenitor: 3 x 109 Fase S del ciclo celular 1 en cada 50 millones (5 x 107) de nucletidos 120 nuevas mutaciones 97% del DNA no codifica nada

Alteraciones genticas

Alteraciones genticas

Los hombres contribuyen mas a las mutaciones que las mujeres

Slo 24 divisiones mitticas ocurren desde el huevo fertilizado que inicia una nia y el de sus futuros huevos. El esperma de un hombre de 30 aos, en contraste, es el descendiente de por lo menos 400 divisiones mitticas desde el huevo fertilizado que lo form.

Alteraciones genticas

Mutaciones somticas y de lnea germinal

Mutaciones somticas: Afectan algunas clulas de cuerpo y pueden producir cncer Mutaciones de la lnea germinal: Afectan los gametos y se heredan. Se producen malformaciones o sndromes.

Alteraciones genticas

Mutaciones somticas

Alteraciones genticas

Alteraciones genticas

Vectores: de clonacin, de expresin, de lanzadera. Tipos, fagos, plsmidos, csmidos, yac

The Life cycle of a retrovirus

VECTORS
Vector is an agent that can carry a DNA fragment into a host cell. If it is used for reproducing the DNA fragment, it is called a "cloning vector". If it is used for expressing certain gene in the DNA fragment, it is called an expression vector

Vectores
Vector de clonacin Plsmido o fago utilizado para transportar DNA extrao a fin de producir ms material o un producto protenico. Vector de expresin Vector de clonacin diseado de manera que una secuencia codificadora insertada en un punto concreto ser transcrita y traducida a protenas. Vector lanzadera Plsmido construido de manera que tenga orgenes de replicacin para dos huspedes (E coli y S cerevisiae) de manera que se pueda transportar una secuencia extraa tanto en procariotas como en eucariotas

Commonly used VECTORS

Plasmid Lambda phage Cosmid Yeast artificial chromosome (YAC).

Plasmid
Plasmids are circular, double-stranded DNA molecules that exist in bacteria and in the nuclei of some eukaryotic cells. They can replicate independently of the host cell. The size of plasmids ranges from a few kb to near 100 kb. A vector usually contains a sequence (polylinker) which can recognize several restriction enzymes so that the vector can be used for cloning a variety of DNA samples. Also contain a drug-resistance gene for selective amplification. The transformed E. coli cells are protected by the ampicillin-resistance gene (ampr) which can express the enzyme, b-lactamase, to inactivate the antibiotic ampicillin.

A typical plasmid vector

It contains a polylinker which can recognize several different restriction enzymes, an ampicillinresistance gene (ampr) for selective amplification, and a replication origin (ORI) for proliferation in the host cell

Lambda phage
phages are viruses that can infect bacteria. The major advantage of the phage vector is its high transformation efficiency, about 1000 times more efficient than the plasmid vector.

Fagos como antibiticos naturales

Fagos en clonacin de DNA

Fagos como bibliotecas genticas

Cosmid
The cosmid vector is a combination of the plasmid vector and the COS site which allows the target DNA to be inserted into the head. It has the following advantages: High transformation efficiency. The cosmid vector can carry up to 45 kb whereas plasmid and phage vectors are limited to 25 kb.

Cloning by using cosmid vectors

YAC: yeast artificial chromosome

This vector is capable of carrying a large DNA fragment (up to 2 Mb), but its transformation efficiency is very low. Essential components of YAC vectors Centromers (CEN), telomeres (TEL) and autonomous replicating sequence (ARS) for proliferation in the host cell. ampr for selective amplification and markers such as TRP1 and URA3 for identifying cells containing the YAC vector. Recognition sites of restriction enzymes (e.g., EcoRI and BamHI)

Cloning by the yeast artificial chromosome (YAC) vector

Proyeccin de terapia gnica. Animales transgnicos. Mtodos para crear animales transgnicos. Microinyeccin de DNA. Transferencia gentica

Antecedentes histricos
Caractersticas heredadas y mutaciones espontneas. Brinster, 1974. Ratn quimrico por combinacin de clulas del estado de mrula de dos cepas diferentes. Jaenisch, 1976. Transgnesis usando retrovirus Gordon y Rudle. Microinyeccion de DNA en ratones. 1981 Gossler et al, 1986. Uso de clulas madre embrionarias o Embryonic stem cells (ES) para transferencia de genes

Animales transgnicos
Animal que presenta una modificacin deliberada del genoma Introduccin de DNA recombinante forneo Transmisin del material a todas las clulas incluidas las germinales

EMBRYONIC STEM CELLS

Ratones transgnicos

Son aquellos cuyo material gentico es manipulado con el fin de otorgarle alguna caracterstica especfica.

Ratones transgnicos

Ratones knockout

Tcnica que permite crear ratones en los que se suprime un determinado gen, lo que permite estudiar la funcin del mismo y el efecto de su ausencia en el desarrollo del animal

Strategy for generating conventional knockout mice

Homanics, G.E., and Hiller-Sturmhofel, S. New genetic technologies in alcohol research. Alcohol Health & Research World 21(4):298309, 1997

Mtodos para crear animales transgnicos

Microinyeccin de DNA Transferencia gentica usando clulas ES Transferencia gentica usando retrovirus

Microinyeccin de DNA
Gen o genes recombinantes De la misma o diferente especie Inyectado al proncleo de un vulo fertilizado Efecto: Aumento o disminucin de la expresin del gen Insercin al azar dentro del genoma Transferencia al oviducto de madre receptora

Transferencia gentica usando clulas ES

Insercin previa del DNA deseado a un cultivo de clulas ES Incorporacin de clulas al embrin en estadio de blastocisto Mtodo de eleccin para inactivacin gentica por gene knock-out

ES: Embryonic stem cells

Transferencia gentica usando retrovirus

Uso de vectores. Virus o plsmidos Objetivo: Incrementar la expresin del gen insertado Ventaja del Retrovirus: su habilidad para infectar las clulas mediante la transferencia de su material gentico La transmisin del transgen es posible solo si el retrovirus es integrado en las clulas germinales

Resultados esperados
Tasa de xito de obtener animales vivos es muy baja Si la insercin es no abortiva, la Generacin F1 debe ser analizada para la presencia del transgen La generacin F1 pueden ser quimeras heterocigticas Se necesitan 10 a 20 cruzamientos sucesivos de las quimeras para obtener animales transgnicos homocigticos

Aplicaciones
Investigacin de la funcin del transgen Toxicologa. Determinacin de animales respondedores a drogas Gentica del desarrollo Produccin farmacolgica de protenas, drogas y evaluacin de su eficacia Desarrollo de animales donantes de xenoinjertos.

HLA-B27 Transgenic Rats

Features: The HLA-B27 transgenic rat, expressing HLA-B27 and human 2m, exhibits a phenotype similar to humans suffering B27 related rheumatic disorders such as reactive arthritis, ankylosing spondylitis, psoriasis and inflammatory bowel disease. This rat model is useful for research and pharmacological studies of spontaneous systemic inflammation, arthritis, inflammatory bowel disease and skin diseases including psoriasis and alopecia.

Clonacin
Remocin de cromosomas de oocitos no fertilizados Reemplazo con un ncleo de otra clula Transferencia nuclear o Transferencia citoplasmtica o fusin de dos clulas. Pequeas diferencias relacionadas al genoma de mitocondrias

Clonacin. Problemas
Distancia de desarrollo entre el oocito recipiente y la clula donante del ncleo. Eficiente slo en clulas tomadas de estados embrionarios tempranos Debe hacerse eficiente tambin en clulas en cultivo prolongado

Terapia gnica

http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive -your-inner-healers

Therapeutic cloning strategies

http://www.obgyn.net/infertility/infertility.asp?page= /infertility/articles/jecar-tissue

Generating induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are adult cells that have been genetically reprogrammed to an embryonic stem celllike state by being forced to express genes and factors important for maintaining the defining properties of embryonic stem cells

Janet Rossant. Stem cells: The magic brew. Nature 448, 260-262(19 July 2007

Scientists Cure Sickle Cell Anemia in Mouse Model

http://medgadget.com/archives/2007/12/scientists_cure_sickle_cell_anemia_in_mouse_model.html

Cellular Visions: The Inner Life of a Cell

http://www.studiodaily.com/main/technique/tprojects/6850.html

Esta clase esta dedicada a la memoria de mi gran maestro y amigo Dr. Walter Arrascue Vargas