Universidad Santo Toms. Escuela de Agronoma Microbiologa.

LABORATORIO N 4
"OBSERVACION DE MICROORGANISMOS PROCARIONTES" Introduccin Los microorganismos son demasiado pequeos para ser observados a simple vista, por lo que es necesario utilizar un microscopio. Los modernos microscopios proporcionan, con una gran claridad, aumentos de decenas a cientos de veces superiores a los obtenidos con las lentes sencillas de van Leeuwenhoek. Resumen de las caractersticas de distintos tipos de microscopios
Tipos de microscopio Campo claro Caractersticas especiales Utiliza luz visible como fuente de iluminacin; no puede resolver estructuras de menos de 0,2 m; la muestra aparece sobre fondo brillante. Utiliza un condensador especial con un disco opaco que impide la entrada directa de la luz en el objetivo; entra la luz difractada por la muestra, la cual aparece brillante sobre fondo oscura. Usa un condensador especial y una placa de difraccin que difracta los rayos de luz para que se desfacen unos con respecto a otros; la muestra aparece con diferentes grados de brillo y contraste. Utiliza una fuente de luz ultravioleta o cercana a la ultravioleta que provoca la emisin de luz por parte de compuestos fluorescentes presentes en la muestra. Usa haces de electrones en vez de luz gracias a la longitud de onda ms corta de los electrones puede resolver estructuras menores de 0,2 m. Usos principales Comnmente usado para observar especmenes teidos (muertos) diversos; no resuelve muestras muy pequeas, como los virus. El instrumento es econmico y fcil de usar. Comnmente usado para examinar microorganismos vivos que sean invisibles al microscopio de campo claro, que sean difciles de teir o que se alteren por la tincin; usado a menudo para detectar Treponema pallidum. Se usa frecuentemente para permitir un examen detallado de las estructuras internas de los especmenes vivos; no se requiere tincin.

Campo oscuro

Contraste de fases

Fluorescencia

Su uso fundamental es en tcnicas de inmunofluorescencia para detectar o identificar con rapidez microorganismos en muestras clnicas. Se usa el microscopio electrnico de transmisin para examinar virus o ultraestructuras celulares en cortes delgados, la imagen no es tridimensional . El microscopio electrnico de barrido se usa para estudiar la superficie de clulas y virus, la imagen que se forma e tridimensional.

Electrnico

Dos tcnicas generales son las que se emplean para proporcionar material o muestras para las observaciones microscpicas. Una es la suspensin de los organismos en un lquido. La otra utiliza pelculas o frotis secos, fijados y teidos de la muestra. Para poder observar los microorganismos directamente, el microbilogo debe utilizar un instrumento de precisin, el microscpio. Si lo que interesa observar es la motilidad o reactividad frente a sustancias qumicas es conveniente examinar las bacterias

sin teir; por otra parte si se quiere visualizar estructuras celulares especficas es necesario tratar las clulas con colorantes, proceso denominado TINCIN.

Examen de microorganismos sin tincin: 1.Preparacin hmeda: es la forma ms simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos, y consiste en la suspensin de un inculo de cultivo en agua u otro lquido, colocando una gota de sta suspensin en un portaobjeto comn y cubrirlo con un cubreobjeto. Este procedimiento requiere utilizar microscopa de contraste de fase. Preparacin de la gota pendiente: sta tcnica requiere de un portaobjeto con una concavidad o depresin circular en su centro (portaobjeto excavado o clula de Kacli). Tcnica: - Colocar un anillo delgado de vaselina alrededor de la depresin central. - Depositar una gota de solucin fisiolgica en el centro del cubreobjeto y emulsionar en ella el material a examinar si proviene de un cultivo slido o utilizar una gota de cultivo si es lquido. - Invierta el portaobjeto de manera tal que la excavacin central quede encima de la gota del cubreobjeto. - Presione el portaobjeto y luego invirtalo con un movimiento rpido. La gota que contiene el material quedar pendiendo sobre la excavasin del portaobjeto como se muestra en la figura:

2.-

Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los microorganismos, sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias qumicas. Examen de microorganismos teidos: Colorantes: son compuestos qumicos orgnicos, generalmente sales, en las que uno de sus iones es el portador del color. Segn su comportamiento qumico los colorantes pueden clasificarse en :cidos, bsicos y neutros. a).b).c).Colorante cido o aninico: la carga del in que imparte el color es negativa. Ejemplo: fucsina cida, eosina, rojo congo. Colorante Bsico o catinico: el in que imparte el color tiene carga positiva. Ejemplo: cristal violeta, azul de metileno, safranina. Colorante neutro: sal compuesta de un colorante cido y otro bsico. Ejemplo: eosinato de azul de metileno, giemsa.

La mayora de los estudios sobre las morfologas y agrupaciones celulares de los microorganismos se hacen a partir de preparaciones teidas- Teir significa simplemente colorear los microorganimos con un colorante que resalta algunas estructuras. Sin embargo, para poderlos teir es necesario que los microorganismos hayan sido adheridos o fijados al portaobjetos; de otro modo la tincin podra eliminarlos por lavado. El proceso de tincin supone una reaccin de intercambio de iones, entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Para teir una preparacin se pone una pequea cantidad del material a examinar en un portaobjeto limpio y sin grasa. Si el inculo proviene de un medio slido se emulsiona en una gota de solucin fisiolgica estril. La muestra se extiende con el asa (esterilizada y enfriada) hasta que quede una fina pelcula. Esta pelcula se conoce como FROTIS. Una vez realizado el frotis, se procede a la FIJACIN. ste es un procedimiento que mata las bacterias del frotis y hace que se adhieran al portaobjeto. La fijacin se puede realizar sumergiendo el portaobjeto en alcohol metlico, ter o formalina; siendo el calor el ms

indicado para el trabajo de rutina. La fijacin por calor se logra pasando el portaobjeto varias veces por sobre la llama del mechero. El mtodo de fijacin depender del tipo de m.o. que se desea observar; por ejemplo, las bacterias Halfilas se fijan sumergiendo el portaobjeto en cido actico, para poder extraer las sales. Una vez realizado el frotis y la fijacin, se procede a aplicar el o los colorantes segn sea la tincin. En bacteriologa se utilizan tres clases de tinciones: T. simple, T. diferencial y T. especiales. 1.Tincin simple: es aquella que hace uso de un slo tipo de colorante y sirve para observar tamao y forma celular. Las ms comunes son la de azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta y safranina. Tcnica: -frotis y fijacin de la muestra -colorante durante un minuto -lavar con agua para retirar exceso de colorante -dejar secar al aire -observar al microscpio de inmersin Tinciones diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su reaccin con los colorantes utilizados. Entre ellos la tincin de Gram y la de alcohol-cido resistente son las ms usadas. Tincin Gram: es la tcnica de uso ms comn en microbiologa y permite dividir las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo a las propiedades fsicas de la pared celular. Tcnica: -frotis y fijacin de la muestra -cristal violeta durante un minuto -lavar con agua -mordiente: solucin de yodo (lugol) durante un minuto -lavar con agua -agente decolorante: alcohol durante 30 seg. -lavar con agua -safranina por 30 seg. -lavar con agua y secar al aire -examinar al microscpio con objetivo de inmersin

2.-

2.1-

El mordiente tiene la funcin de aumentar la afinidad del colorante con las estructuras celulares. El agente decolorante tiene la funcin de retirar el colorante de la clula. Las bacterias sometidas a la tincin de Gram que retienen el colorante "cristal violeta" y aparecen de color violeta profundo se clasifican como bacterias Grampositivas. Aquellas que pierden el cristal violeta y se tien rojas por el colorante de contraste, se clasifican como bacterias Gram-negativas. Este resultado se fundamenta en el hecho de que las bacterias Gram(+), despus del tratamiento con alcohol, se produce una deshidratacin con la consiguiente disminucin en el dimetro de los poros de pptidoglicano de la pared celular. Esto permite que el colorante cristal violeta quede retenido en el interior de la clula. Las paredes de las bacterias G(-) tienen una cantidad mucho menor de pptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas, lo que le da una consistencia mucho ms laxa que permite la salida del complejo cristal violeta-yodo y la posterior tincin con safranina (Cuadro I). CUADRO I: Reaccin de las clulas Gram (+) y Gram (-), frente a la tincin de Gram. COLORANTE Cristal violeta Lugol Alcohol Safranina GRAM (+) azul azul azul azul GRAM (-) azul azul decolorada rojo

3.Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la clula bacteriana, inclusiones citoplasmticas como tambin algunos microorganismos que dadas sus caractersticas especiales no se tien adecuadamente con tcnicas rutinarias. 3.1- Tincin de estructuras: a. Esporas: Son muy impermeables a los colorantes, por lo que se hace necesario usar tcnicas especiales. Tcnica: - Frotis y fijacin de la muestra - Cubrir frotis con papel filtro - Teir con Verde Malaquita a emisin de vapores por 10 a 15 min. - Enfriar y lavar con agua - Aplicar Safranina por 30 segs a 1 min. - Lavar con agua y secar al aire - observar al microscopio con inmersin Las esporas aparecen de color verde y la clula vegetativa roja. La vaporizacin del colorante sobre la muestra incrementa la penetracin de ste en los recubrimientos impermeables de la espora (Cuadro III). CUADRO III: Reaccin de las clulas frente a la tincin de Esporas. COLORANTE Verde malaquita Agua Safranina ESPORA verde verde verde CLULA VEGETATIVA verde decolorada roja

b. Cpsula: Usada para los gneros Klebsiella y Streptococcus. Muchas bacterias estn rodeadas por una envoltura mucosa o cpsula, pero slo en algunas se encuentra bien desarrollada. Esta se compone de polisacridos, polipptidos y polmeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran por el calor, nunca se podr utilizar calor en ninguno de los pasos de la tincin. La cpsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse como un halo transparente alrededor de la clula. La tcnica de la tincin negativa incorpora materiales tales como tinta china, que se compone de partculas demasiado grandes para penetrar la clula y un colorante de contraste, la safranina, que penetra la clula bacteriana. Al examinar la preparacin, la cpsula aparecer

como una zona transparente que rodea la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cpsulas, debido a que el encogimiento de las clulas o la separacin de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado contiene muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es probable que sean reales y no artificiales. Tcnica: - Sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de tinta china (con asa de loop) y emulsionar con ella los microorganismos a examinar. - Extender la muestra y dejar secar al aire. - Cubrir con Safranina por 30 a 45 segs. - Dejar secar - Observar al microscopio con inmersin. La cpsula se ver como un halo transparente rodeando la clula de color rojo y el resto de la preparacin aparecer de color negro. Tabla. Resumen de varios tipos de tincin y su uso Tincin Aplicaciones principales

Simple Solucin alcohlica o acuosa de un solo (Azul de metileno, carbolfuchsina, cristal colorante bsico (a veces se aade un violeta, safranina) mordiente para intensificarla). Se usa para destacar microorganismos y determinar su morfologa celular y disposicin. Diferencial Gram Divide a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y aparecen moradas. Las bacterias Gram negativas no lo retienen y permanecen incoloras hasta ser teidas por el colorante de contraste, apareciendo entonces rosa. Acido alcohol resistente Se usa para diferenciar Mycobacterium y Nocardia. Las bacterias cido alcohol resistentes teidas con carbolfuchsina y tratadas con cido y alcohol permanecen rojas porque retienen el colorante. Las no cido alcohol resistentes pierden el colorante en el mismo tratamiento y quedan azules al ser teidas con azul de metileno. Utilizadas para teir y destacar diversas estructuras, como cpsulas, endosporas y flagelos; a veces sirven de ayuda al diagnstico. Utilizada para demostrar la presencia de cpsulas. Como las cpsulas no toman la mayora de los colorantes, aparecen como un halo alrededor de las clulas bacterianas destacando sobre fondo oscuro. Se usa para detectar la presencia de endosporas en seis gneros bacterianos. Reacciona de forma distinta con diferentes tipos de bacterias y permite diferenciarlas

Especiales

Negativa

De endosporas

Cuando se aplica verde malaquita a una extensin fijada por calor de clulas bacterianas este colorante penetra en las endosporas y las tie de verde. Se aplica despus safranina, que tie el resto de la clula de rosa. De flagelos Sirve para demostrar la presencia de flagelos. Se usa un mordiente para engrosar el dimetro de los flagelos hasta ser visibles microscpicamente al ser teidos con carbolfuchsina. Procedimiento de la muestra: Frotis Fijacin Tincin

Staphylococcus aureus, azul-violeta

Bacillus subtillis, bacilo esporulado Gram+

Bacillus subtillis, bacilo esporulado Tincin espora , bacilo(rojo), espora (verde)