FISIOLOGIA MOLECULAR Y BIOQUIMICA DE PIROFOSFATASAS TRANSLOCADORAS DE PROTONES . Autor: LOPEZ MARQUES ROSA LAURA. Ao: 2003. Universidad: SEVILLA.

Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS . Centro de realizacin: INSTITUTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y FOTOSINTESIS. Resumen: INTRODUCCIN El pirofosfato (PPi) es una sencilla molcula inorgnica, que posee un enlace P-O-P, denominado enlace pirofosfato, caracterizado por su elevada energa libre de hidrlisis. Esta molcula se genera como subproducto en un gran nmero de reacciones anablicas. Hasta hace poco, se pensaba que el PPi era hidrolizado nicamente por las pirofosfatasas solubles (sPPasas), liberndose la energa del enlace pirofosfato en forma de calor [Lahti y col. 1988]. Se han descubierto adems protenas integrales de membrana que son capaces de acoplar la hidrlisis del PPi a la generacin de un gradiente de protones a travs de una membrana, reciclando as parte de la energa contenida en el enlace pirofosfato [Baltscheffsky y Baltscheffsky 1992]. Estudios recientes indican que estas protenas denominadas pirofosfatasas inorgnicas translocadoras de protn (H+-PPasas o VPPasas)- se encuentran presentes en diferentes organismos de muy diversos orgenes filogenticos, como eubacterias, arqueas, plantas superiores y diversos protistas fotosintticos y no fotosintticos, entre ellos, algunos parsitos de humanos [Rea y Poole 1993, Baltscheffsky y col. 1999, Maeshima 2000, Prez-Castieira y col. 2001a, McIntosh y Vaidya 2002]. Por su parte, no se han descrito protenas de este tipo en clulas animales y hongos. Existen dos grandes grupos de H+-PPasas segn requieran o no K+ para desarrollar su actividad mxima: las independientes y las estimuladas por K+. En organismos procariticos, la H+-PPasa mejor estudiada es la de la bacteria prpura no sulfurosa Rhodospirillum rubrum. Esta H+-PPasa se encuentra asociada a invaginaciones de la membrana plasmtica, denominadas cromatforos, donde se localiza tambin la maquinaria fotosinttica y, como la de la mayora de los organismos procariticos, es independiente de K+ [Nyrn y col. 1984]. Se ha propuesto que la H+-PPasa podra hidrolizar PPi, contribuyendo al gradiente de protn en el interior del cromatforo en condiciones de bajo nivel energtico, por ejemplo, de baja luz, en las que el bombeo de este in por parte de la cadena fotosinttica no fuese eficiente. Esto permitira obtener ATP mediante la relajacin de este gradiente a travs de la F0F1-ATP sintasa. En condiciones favorables -por ejemplo, alta luz- el gradiente de protn sera suficiente para sintetizar ATP y para dirigir la sntesis de PPi a travs de la H+-PPasa, regenerndose as la reserva de PPi celular [Nyrn y Strid 1991]. En organismos eucariticos, las H+-PPasas ms estudiadas han sido las de plantas. Durante muchos aos se consider que estas protenas eran estrictamente dependientes de K+ [Rea y Poole 1993, Maeshima 2000], hasta que, muy recientemente, se ha descrito una isoforma en Arabidopsis thaliana cuya actividad es independiente de la presencia de este cation [Drozdowicz y col. 2000]. La mayora de estas protenas se encuentran asociadas a la membrana vacuolar (V-PPasas), pero se han descrito tambin en la membrana plasmtica y en el aparato de Golgi [Maeshima 2000, Mitsuda y col. 2001]. En el tonoplasto, esta enzima contribuye, junto con la V-ATPasa, a mantener la acidificacin vacuolar necesaria para procesos de transporte y detoxificatin. Bajo condiciones de estrs, se han descrito circunstancias que inactivan la V-ATPasa total o parcialmente, y producen, al mismo tiempo, una induccin o una activacin de la V-PPasa. El papel

de estas protenas eucariticas en la membrana plasmtica o el Golgi no ha sido estudiado hasta el momento. RESULTADOS Durante el transcurso de esta Tesis Doctoral, se han llevado a cabo estudios sobre la pirofosfatasa translocadora de protones. Los resultados se dividieron en 5 apartados independientes, que se resumen a continuacin: Mecanismo de regulacin transcripcional de la H+-PPasa de R. rubrum.- Rhodospirillum rubrum es una bacteria muy verstil, que puede crecer tanto en condiciones heterotrficas (fuente de carbono reducido, aerobiosis) y fototrficas (luz, anaerobiosis) [Oelze 1976], como en condiciones fermentativas (fructosa, oscuridad, anaerobiosis) o de respiracin anaerbica (agente oxidante, p.e. DMSO, oscuridad, fructosa, anaerobiosis) [Schultz y Weaver 1982]. Los estudios fisiolgicos con este organismo, han permitido demostrar la existencia de una regulacin coordinada y muy estricta de las dos enzimas que hidrolizan PPi en esta bacteria y que estaran compitiendo por el sustrato, la sPPasa y la H+-PPasa. Adems, la enzima de membrana se encuentra presente en cultivos sometidos a anaerobiosis (fotosntesis, fermentacin y respiracin anaerbica), mientras que se encuentra ausente en condiciones aerbicas. La transferencia de los cultivos aerbicos a condiciones fotosintticas produce una induccin clara de la V-PPasa doce horas despus del cambio. Sin embargo, el oxgeno no parece ser estrictamente necesario para la represin transcripcional, dado que cultivos aerbicos sometidos a estrs salino severo tambin presentan una induccin de la H+-PPasa. Tras clonar un fragmento de DNA genmico que contena las secuencias promotoras del gen vpp de la H+-PPasa de membrana, se han determinado los puntos de inicio de la transcripcin en las distintas condiciones de crecimiento, identificndose un promotores en tandem comunes a todas las condiciones anaerbicas ensayadas y dependientes de los factores transcripcionales FNR y Reg A, y este ltimo, adems, del factor s54, y otros dos diferentes especficos de estrs salino. Esto ha permitido, adems, realizar un anlisis de dichas secuencias promotoras, que ha llevado a identificar putativos sitios de unin para distintos factores de transcripcin, demostrando una vez ms, que esta enzima se haya sujeta a un sistema muy complejo de regulacin a nivel transcripcional. Los intentos de obtencin de un mutante insercional carente de H+-PPasa, tanto por transformacin directa como por conjugacin, no han dado resultados positivos. Obtencin de un mutante condicional de la sPPasa de Saccharomyces cerevisiae y complementacin por H+-PPasas de membrana.- Aunque todas las H+-PPasas que se han estudiado hasta el momento presentan actividad de hidrlisis de PPi in vitro, existe cierta controversia acerca de su funcin fisiolgica in vivo, debido a que diversos grupos han demostrado la capacidad de esta enzima para sintetizar PPi a expensas de un gradiente de protn previamente generado a travs de la membrana [Maeshima 2000]. Por su parte, la levadura Saccharomyces cerevisiae posee dos sPPasas (citoslica y mitocondrial), pero carece de una H+-PPasa en su vacuola, al igual que ocurre en todas las clulas de hongos y animales estudiadas hasta la fecha. La obtencin de un mutante absolutamente carente de sPPasa en cualquier condicin ya haba sido abordada previamente sin xito, lo que indicaba que esa enzima debe ser esencial para la levadura [Lundin y col. 1991]. Uno de los objetivos que se plantearon durante la realizacin de este trabajo de Tesis Doctoral fue la obtencin de un mutante de S. cerevisiae que expresara condicionalmente la sPPasa citoslica, con el fin de realizar estudios de complementacin con H+-PPasas, que permitieran demostrar la hidrlisis de PPi in vivo por parte de estas enzimas. De esta forma, adems, se alterara la bioenergtica del PPi en el mutante complementado de la levadura, que se asemejara en este aspecto a una clula vegetal. Para ello, se obtuvieron plsmidos de expresin que contenan el gen de la sPPasa (IPP1) bajo el control de un promotor de galactosa, de tal modo que la protena slo se expresara en presencia del azcar mencionado. Tras transformar la levadura (estirpe w303)

con este plsmido, se interrumpi la copia de IPP1 del cromosoma, mediante la transformacin de las clulas con un plsmido integrativo que contena dos fragmentos del gen, separados entre s por una casete que permite el crecimiento de la levadura en ausencia de histidina en el medio de cultivo. Finalmente, dado que la ausencia total de actividad pirofosfatasa es letal para las clulas, se seleccionaron aquellas colonias de levadura que crecan slo en presencia de galactosa y no en presencia de glucosa. Este mutante se caracteriz bioqumica y molecularmente, mediante tcnicas de Northern Blot, Southern Blot, PCR, Western Blot y medidas de actividad sPPasa. Una vez comprobada la ausencia de PPasa en glucosa, se obtuvieron construcciones en plsmido que contenan genes de H+-PPasas de membrana, tanto de plantas como de bacterias, bajo el control de un promotor constitutivo y, por lo tanto, activo en presencia de glucosa. De este modo, se consigui complementar funcionalmente el mutante de sPPasa, que recupera su capacidad de crecimiento en glucosa cuando la hidrlisis del PPi, producido en el citoplasma por las reacciones anablicas, es llevada a cabo por las H+-PPasas heterlogas. Mediante el uso de gradientes de sacarosa y experimentos de inmunolocalizacin, se realiz un estudio de la localizacin intracelular de las enzimas heterlogas, encontrndose que se encuentran asociadas fundamentalmente a sistemas de membranas (cisternas) perinucleares. Purificacin de la H+-PPasa de Thermotoga maritima.- La H+-PPasa de la bacteria hipertermoflica Thermotoga maritima, fue caracterizada en nuestro grupo durante el desarrollo de esta beca por expresin heterloga en membranas de levadura, siendo la primera H+-PPasa bacteriana descrita cuya actividad era dependiente de K+ [Prez-Castieira y col. 2001b]. Esta protena presenta, adems de su resistencia a altas temperaturas, la caracterstica de ser resistente al ataque de proteasas. De este modo, se consider que podra ser una buena candidata para purificacin, en comparacin con otras V-PPasas normoflicas (plantas, protistas), muy lbiles. Para dicha purificacin, mediante tcnicas de PCR, se insert una secuencia de seis histidinas en el extremo 5'-terminal del gen que, tras expresin heterloga en levadura, permitira la unin de la H+-PPasa a columnas de afinidad de ion-quelante cargadas con nquel u otro catin divalente. El primer paso de la purificacin, dado que la protena es intrnseca de membrana, consisti en su solubilizacin en presencia de detergente dodecilmaltsido (DDM). Para ello, se probaron distintas relaciones cantidad de protena total:cantidad de detergente, llegndose a un ptimo de 1:3. A continuacin, usando las caractersticas termoflicas de la enzima se someti la misma a un choque trmico (75C, 30 min.), separndose as de la mayor parte de las protenas no deseadas. Finalmente, se combinaron los dos pasos en uno, de modo que la solubilizacin se realiz calentando la muestra en presencia del detergente en presencia de Mg2+, K+ y PPi. Adems, se estudi el efecto de distintos tratamientos en la efectividad de la purificacin: lavado previo de las membranas con distintas disoluciones salinas, variacin de las concentraciones de iones (Mg2+, K+, PPi), aumento de la temperatura de solubilizacin. Una vez solubilizada y libre de la mayor parte de protenas contaminantes, se someti la preparacin a cromatografa en columnas de ion-quelante (Ni2+), obtenindose una fraccin prcticamente pura de la protena de T. maritima. Este trabajo se llev a cabo en el laboratorio del Prof. Michael G. Palmgren de la Royal Veterinary and Agricultural University de Copenhague (Dinamarca). Una vez de vuelta en Espaa, el protocolo optimizado se us para el aislamiento de cantidad de protena suficiente para la obtencin de un anticuerpo policlonal monoespecfico por inmunizacin de un conejo, capaz de reconocer V-PPasas de distintos organismos. La protena se someter en un futuro a una caracterizacin estructural exhaustiva (Anlisis de Partcula Simple, Fuerza Atmica, obtencin de cristales bidimensionales en monocapas lipdicas o tridimensionales), dado que no existen datos sobre la

estructura tridimensional o el estado oligomrico de este tipo de bombas de protn (Cooperacin con Francia-Dinamarca). Expresin de la V-PPasa en microalgas eucariticas sometidas a distintas condiciones nutricionales o de estrs: obtencin de mutantes de Chlamydomonas reinhardtii sobreexpresores o deficientes en V-PPasa.Para este estudio, se usaron dos microalgas, Chlamydomonas reinhardtii y Chlorella fusca (Scenedesmus vacuolatus), muy distintas en su respuesta a las situaciones de estrs inico y osmtico. Cultivos de ambas microalgas se sometieron a estrs de tipo salino y osmtico. De este modo, se demostr que el transcrito de la V-PPasa se induce, en el caso de C. fusca, en todas las condiciones de estrs probadas (15 mM LiCl, 150 mM KCl, 150 mM NaCl y 300 mM sorbitol), sin que se produzca ningn efecto significativo sobre el crecimiento. Sin embargo, para C. reinhardtii no se observ ninguna induccin en presencia de sorbitol, mientras que las sales afectaron a la expresin del gen de manera muy diversa, siendo la induccin mxima en presencia de K+ y mnima en presencia de Li+. Los cultivos de esta alga en presencia de K+ al cabo de 30 horas, mientras que los sometidos a otros iones sufren un retardo en su crecimiento con respecto a los controles. Para los cultivos con sorbitol no se observa ningn tipo de efecto sobre la densidad celular. Adems, se ha estudiado el efecto de las condiciones nutricionales en la expresin de la VPPasa en C. fusca. Para ello, las clulas se crecieron en autotrofa (luz), mixotrofa (luz, glucosa), y heterotrofa (oscuridad, glucosa). Los estudios de Northern Blot permitieron observar una represin de la expresin del gen en presencia de glucosa y ausencia de luz (condiciones heterotrficas), donde las clulas presentan un balance energtico ms favorable. Con el fin de caracterizar en mayor profundidad el uso de la V-PPasa en la respuesta a sales de C. reinhardtii, se plante como objetivo la obtencin de mutantes de este organismo carentes de V-PPasa o que sobreexpresaran el gen para dicha enzima. Este proyecto conllev la obtencin de construcciones de DNA que contuvieran o bien el fragmento de DNA genmico del gen en cuestin, o bien el fragmento de cDNA correspondiente colocado en antisentido, bajo el control de un promotor inducible fuerte. El fragmento de DNA genmico se clon mediante PCR sobre DNA total de la microalga, con oligonucletidos estrictos para los extremos 5' y 3' de la V-PPasa. Para la obtencin del fragmento de cDNA, se utilizaron clones de ESTs al Kasuza Research Institute en Japn, sobre los que se hizo, una vez ms, una reaccin de PCR usando los mismos oligonucletidos. Para las construcciones definitivas, se usaron las secuencias promotoras y terminadoras del gen que codifica la nitrato reductasa de C. reinhardtii, cuya expresin se induce en presencia de nitrato y se reprime totalmente en presencia de amonio. Tras transformar cultivos de la microalga con estas construcciones, los clones obtenidos se cultivaron en presencia de amonio y nitrato y se sometieron a anlisis por Northern y Southern Blot, identificndose varios transformantes, que se encuentran, en el momento actual, en la fase final de su caracterizacin. Asimismo, se estn llevando a cabo estudios adicionales sobre otras condiciones de estrs nutricional, oxidativo y de temperatura, que puedan afectar a la expresin de la V-PPasa en C. reinhardtii. Estudios sobre la distribucin de VPPasas en microalgas eucariticas de diversos grupos taxonmicos.- Al inicio de esta beca, se conoca la existencia de las V-PPasas en plantas, y en algunos parsitos y bacterias fotosintticas. En nuestro grupo, se han obtenido evidencias de la presencia de V-PPasas en un amplio nmero de protistas hetertrofos (parsitos y de vida libre) y de la posible existencia de ms de una isoforma de esta protena en estos organismos (habitualmente con distinta dependencia del K+ para su actividad mxima) [Prez-Castieira y col. 2001a, Prez-Castieira y col. 2002]. Una vez comenzado este trabajo, se public la existencia en Arabidopsis thaliana de una isoforma de la V-PPasa independiente de K+ (AVP2), adems de la isoforma AVP1 (estimulada por K+), que ya era bien conocida. Por todo ello, se plante como

objetivo la bsqueda de genes de V-PPasas en microalgas eucariticas de distintos grupos filogenticos, con el fin de encontrar alguna evidencia sobre el origen evolutivo de los dos grandes grupos de V-PPasas, a saber K+-dependientes e independientes. Con este fin, se obtuvieron clulas de distintas microalgas provenientes del Servicio de Cultivos Biolgicos del Instituto de Bioqumica Vegetal y Fotosntesis en el que se ha realizado esta Tesis, adems de otras provenientes del Instituto de Ciencias Marinas del CSIC (Cdiz) y de distintos laboratorios americanos y europeos. En total se analizaron cerca de 40 organismos mediante tcnicas de PCR, obtenindose un total de 25 fragmentos de DNA, la mayor parte de DNA genmico, correspondientes a genes putativos de V-PPasas. Para la reaccin de PCR, se utilizaron parejas de oligonucletidos degenerados, obtenidos por comparacin de distintas H+-PPasas de plantas y de la bacteria Rhodospirillum rubrum, y que amplifican un fragmento de 570-700 bp (25-30% de la longitud total de la zona codificante), cerca del extremo 3' del gen y que se encuentra muy conservado [Prez-Castieira y col. 2002]. El anlisis de esta secuencia permite adems realizar predicciones sobre la dependencia o independencia de K+ de la protena y ha permitido la localizacin de intrones en algunas isoformas. Adems, con el fin de completar el estudio, se llev a cabo la misma estrategia sobre cDNAs y DNA genmico de algunos protistas ancestros evolutivos de las clulas animales, con resultados positivos. Una vez localizadas las bandas de V-PPasas, se realizaron experimentos de Southern Blot con DNA genmico de las microalgas ms relevantes, para asegurar la presencia de las distintas isoformas encontradas en el genoma de los organismos correspondientes. Tambin se realizaron anlisis de Southern heterlogo para intentar identificar V-PPasas en algunos protistas fotosintticos para los cuales la estrategia de PCR no dio ningn resultado positivo. Para algunos de estos protistas, el anlisis de membranas totales por Western Blot, usando un anticuerpo policlonal generado contra la secuencia de aminocidos del putativo sitio de unin de PPi de AVP1 [Kim y col. 1994], permiti observar bandas de masa molecular esperada, sugiriendo la expresin de V-PPasas en estos organismos. DISCUSIN En esta Tesis Doctoral, se han llevado a cabo estudios encaminados a conocer distintos aspectos, muy poco estudiados o todava no clarificados, acerca de las H+-PPasas de membrana, que han supuesto un importante avance en el conocimiento de estas protenas y des u distribucin, localizacin celular y funcin en organismos fotosintticos, tanto procariticos como eucariticos. El trabajo realizado con la H+-PPasa de R. rubrum en distintas condiciones nutricionales y de estrs, ha permitido demostrar la existencia de una regulacin coordinada muy estricta entre la sPPasa citoslica y la H+-PPasa de los cromatforos, que permitira a las clulas evitar la competencia de ambas protenas por su sustrato. Adems, la H+-PPasa est sometida a una regulacin exhaustiva, como se ha puesto de manifiesto con la clonacin de las regiones promotoras del gen, la identificacin de los puntos de inicio de la transcripcin y el anlisis de las secuencias de los promotores identificados, que ha permitido proponer la existencia de sitios de unin para distintos factores transcripcionales, algunos de ellos especficos de condiciones fisiolgicas de crecimiento concretas. Hasta el momento, no se ha descrito en la bibliografa ningn caso de regulacin a nivel molecular de una H+-PPasa procaritica, de modo que este trabajo tiene un carcter claramente innovador en su campo y aporta datos tiles para la clarificacin de la funcin fisiolgica de estas protenas. La regulacin de estas bombas de protn en microalgas eucariticas tampoco haba sido estudiada previamente. El captulo dedicado a ella ha permitido encontrar una relacin entre el estrs salino u osmtico y la induccin transcripcional del gen en dos microalgas muy distintas. Por una parte, C. fusca posee grandes vacuolas y una pared rgida de celulosa, siendo en este sentido parecida a las clulas de plantas. La existencia de esta pared de celulosa

permitira una gran expansin de la vacuola, que podra llegar a ocupar la mayor parte del volumen celular y donde podran acumularse grandes cantidades de sustancias txicas o de reserva. La respuesta a la presencia de sales u osmolitos en este organismo consiste en la sobreexpresin de la V-PPasa, lo que incrementara el gradiente de protn en la vacuola, permitiendo la entrada de la sustancia txica en la misma a una mayor velocidad. Esto explicara que no existiera ningn efecto sobre el crecimiento de los cultivos en presencia de estrs. Por otra parte, C. reinhardtii presenta pequeas vacuolas, algunas de las cuales se encuentran asociadas a sus flagelos, y una membrana proteincea relativamente flexible. Este hecho explicara el efecto sobre el crecimiento de los cultivos observado en el caso de las sales, ya que no les permitira acumular grandes cantidades de iones txicos provenientes del citoplasma, producindose la inviabilidad celular. En el caso del K+, el efecto sera ms marcado que para el ion Na+, debido a que a lo largo de la evolucin los organismos se han adaptado a vivir en ambientes con exceso de Na+ y han desarrollado sistemas que les permiten controlar la entrada y forzar la salida de este ion a travs de la pared celular. Sin embargo, este no es el caso para el K+, que probablemente se acumula en el citoplasma en una mayor concentracin. La no existencia de un efecto del sorbitol sobre la V-PPasa se debera nicamente al uso de la sntesis de osmolitos para el control de la presin osmtica en esta microalga. La obtencin de mutantes de C. reinhardtii y el estudio de otros tipos de estrs para este organismo permitir confirmar la implicacin de la V-PPasa en la respuesta de este organismo a condiciones no favorables del entorno. El anlisis de la presencia de V-PPasas en el genoma de distintas microalgas unicelulares, ha permitido identificar la existencia de ms de una isoforma en algunas de ellas. En casos como el de Phaeodactylum tricornutum o Porphyra purpurea, han llegado a encontrarse hasta tres isoformas distintas, una de las cuales presenta un intrn dentro del fragmento amplificado. La posicin de estos intrones en las distintas microalgas parece estar bastante conservado, lo que podra implicar la existencia de un gen ancestral comn. Adems, se ha encontrado una putativa H+-PPasa en organismos de la lnea evolutiva de animales. Las clulas animales no presentan este tipo de enzima, de modo que este resultado podra dar informacin sobre el punto de la cadena evolutiva donde se produjo la prdida de este gen. El anlisis de las situaciones fisiolgicas a las que han tenido que enfrentarse los distintos organismos estudiados a lo largo de la evolucin, puede dar una idea de la necesidad de la existencia de dos tipos de pirofosfatasa con distinta dependencia de K+, del origen evolutivo de ambas -provenientes de un nico gen que sufri una evolucin divergente o de dos genes distintos que acabaron evolucionando hacia una funcin comn- y, por supuesto, de las relaciones filogenticas que existen entre los distintos microorganismos estudiados. El trabajo de obtencin de un mutante de S. cerevisiae carente de sPPasa en determinadas condiciones y su complementacin por H+- y VPPasas, de plantas y bacterias, estimuladas e independientes de K+, ha permitido demostrar por vez primera la implicacin de esta enzima en la hidrlisis de PPi in vivo, tanto en bacterias (Chloroflexus aurantiacus), como en plantas (Arabidopsis thaliana). El mutante ha sido ampliamente caracterizado tanto a nivel molecular como bioqumico. La complementacin funcional del mutante con las H+-PPasas ha permitido llevar a cabo estudios de localizacin celular, que han demostrado la acumulacin de las H+-PPasas expresadas heterlogamente en cisternas perinuleares. Por ltimo, la purificacin de la H+-PPasa de la bacteria hipertermoflica Thermotoga martima mediante un protocolo muy simple, se ha usado para la obtencin de un anticuerpo contra H+-PPasas, mediante la inmunizacin de un conejo. La obtencin de grandes cantidades de protena permitir realizar estudios estructurales sobre la misma, clarificando, al menos parcialmente, el mecanismo de accin de estas enzimas, mediante la determinacin de su estado oligomrico y su

estructura bi- y tri-dimensional. Hasta el momento, debido a la labilidad de estas protenas y la dificultad para obtenerlas puras en una forma activa y en grandes cantidades, no se tienen datos estructurales de ningn tipo y la informacin sobre el estado oligomrico de las mismas es muy confusa [Maeshima 2000]. Todos los resultados expuestos en este informe se vern plasmados en una Tesis Doctoral, actualmente en periodo de redaccin. La mayor parte de esos resultados han sido comunicados a Congresos nacionales e internacionales y/o publicados en revistas cientficas de reconocido prestigio, como se recoge en el curriculum vitae adjunto. BIBLIOGRAFIA 1. Baltscheffsky M and Baltscheffsky H. 1992. Inorganic pyrophosphate and inorganic pyrophosphatases. En: L. Ernster (Ed.), Molecular Mechanisms in Bioenergetics, Elsevier Science Publishers B.V., pp 331-348. 2. Baltscheffscky M, Schultz A y Baltscheffsky H. 1999. H+-PPases: a tightly membrane-bound family. FEBS Lett 457, 527-533. 3. Drozdowicz Y, Kissinger JC y Rea PA. 2000. AVP2, a sequence-divergent, K+-insensitive H+-translocating inorganic pyrophosphatase from Arabidopsis. Plant Physiol 123, 353-362. 4.. Kim EJ, Zhen R-G y Rea PA. 1994. Heterologous expression of plant vacuolar pyrophosphatase in yeast demonstrates sufficiency of the substrate-binding subunit for proton transport. Proc Natl Acad Sci USA 91, 6128-6132. 5. Lahti R, Pitkranta T, Valve E, Ilta I, Kukko-kalske E y Heinonen J. 1988. Cloning and characterization of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 170, 5901-5907. 6. Lundin M, Baltscheffsky H y Ronne H. 1991. J Biol Chem 266, 12168-12172. 7. Maeshima M. 2000. Vacuolar H+-pyrophosphatase. Biochim Biophys Acta 1465, 37-51. 8. McIntosh MT y Vaidya AB. 2002. Vacuolar type H+ pumping pyrophosphatases of parasitic protozoa. Int J Parasitol 31, 1343-1353. 9. Mitsuda N, Enami K, Nakata M, Takeyasu K y Sato MH. 2001. Novel type of Arabidopsis thaliana H+-PPase is localized to the Golgi apparatus. FEBS Lett 488, 29-33. 10. Nyrn P, Hajnal K y Baltscheffsky M. 1984. Purification of the membranebound proton-translocating inorganic pyrophosphatase from Rhodospirillum rubrum. Biochim Biophys Acta. 766, 630-635. 11. Nyrn P y Strid . 1991. Hypothesis: the physiological role of the membrane-bound proton-translocating pyrophosphatase in some phototrophic bacteria. FEBS Lett 77, 265-270. 12. Oelze J. 1976. Early formation of intracytoplasmic membranes in Rhodospirillum rubrum, Biochim Biophys Acta 436: 95-100. 13. Prez-Castieira JR, Gmez-Garca R, Lpez-Marqus RL, Losada M y Serrano A. 2001a. Enzimatic systems of inorganic pyrophosphate bioenergetics in photosynthetic and heterotrophic protists: remnants or metabolic cornerstones. Int Microbiol 4, 135-142. 14. Prez-Castieira JR, Lpez-Marqus RL Losada M y Serrano A. 2001b. A thermostable K+-stimulated vacuolar-type pyrophosphatase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. FEBS Lett 496, 6-11. 15. Prez-Castieira JR, Alvar J, Ruiz-Prez LM y Serrano A. 2002. Evidence for a wide occurrence of proton-translocating pyrophosphatase genes in parasitic and free-living protozoa. Biochem Biophys Res Commun 294, 567-573. 16. Schultz JE y Weaver PF. 1982. Fermentation and anaerobic respiration by Rhodospirillum rubrum y Rhodopseudomonas capsulata. J Bacteriol 149, 181-190. .
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REGULACION TRANSCRIPCIONAL DE LA EXPRESION DE LOS GENES NTP1 Y TPS1 INDUCIDA POR ESTRES EN SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE . Autor: PAREDES GARCIA M. VANESSA.

Ao: 2003. Universidad: MURCIA. Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGA UNIVERSIDAD DE MURCIA. Centro de realizacin: FACULTAD DE BIOLOGIA. Resumen: En la levadura con fisin Schizosaccharomyces pombe la ruta de MAP kinasas activable por estrs , homloga a la ruta SAPK de eucariotas superiores juega un papel importante en la transmisin de seales extracelulares al nucleo celular, provocando cambios significativos en los patrones de expresin gnica. El elemento central de la ruta es la MAP Kinasa Sty1p que es activable en respuesta a mltiples condiciones de estrs, fosforilndose y asocindose in vivo al factor transcripcional Atf1p. En las levaduras, la respuesta frente a cambios medioambientales provoca un aumento en la sntesis de trehalosa un disacrido no reductor que acta como carbohidrato de reserva y como metabolito de estrs. En S. pombe la expresin de los genes ntp1+ y tps1+ que codifican, respectivamente los enzimas trehalasa y la trehalosa 6P sintetasa, implicados en la sntesis y degradacin de la trehalosa se inducen transcripcionalemente en respuesta a mltiples estreses de manera preferente a travs de la ruta SAPK y de dos de sus efectores, Atf1p y Pap1p. En condiciones de choque trmico y osmtico, la MAP kinasa Sty1p regula parcialmente la activacin transcripcional por medio de Atf1p, mientras que Atf1p y Pa1p son los responsables de la induccin en condiciones de estrs oxidativo de dosis alta. La MAPK Sty1p regula, de manera independiente a Atf1p y/o Pap1p, la activacin post-traduccional de la trehalasa neutra y la sntesis de trehalosa en condiciones de estrs osmtico y oxidativo, pero no durante estrs trmico. La ruta SAPK es episttica sobre Pka1p, protena kinasa que activa por fosforilacin a la trehalasa neutra, en la activacin transcripcional de ntp1+ y tps1+ mediada por estrs , aunque Pka1p reprime los niveles basales de expresin de ambos genes en presencia de glucosa. El factor transcripcional Rst2p no es responsable de la represin de los niveles basales de expresin de ntp1+ debida a Pka1p. La unin de Atf1p a un elemento CRE (secuencia -CTACGTCA-) presente en el Pntp1+ en posicin -568 a -561 es crtica para la induccin de ntp1+ en condiciones de estrs. Atf1p no se une in vivo a este elemento cuando S. pombe se crece en presencia de glucosa, pero s lo hace al menos en condiciones de desrepresin o de estrs oxidativo. El motivo y-AP1 (sitio potencial de unin de Pap1p al Pntp1+) localizado en la posicin -558 a -552 no es especialmente relevante para la induccin por estrs de ntp1+. El Pntp1+ posee dos elementos HSE (elementos de choque trmico) implicados en la activacin transcripcional de ntp1+ en respuesta a elevadas temperaturas, siendo Atf1p episttico sobre HSF (factor de choque trmico) en la activacin transcripcional en dichas condiciones.
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Mecanismos transcripcionales que regulan la expresin del gen de la protena cida fibrilar de la gla durante la diferenciacin de astrocitos corticales inducida por PACAP . Autor: Cebolla Beatriz. Ao: 2003. Universidad: AUTONOMA DE MADRID.

Centro de lectura: Instituto de Investigaciones Biomdicas. Centro de realizacin: Facultad de Mediciana. Resumen: Durante el desarrollo del SNC, la generacin de los astrocitos a partir de precursores neurales tiene lugar hacia el final del periodo de gestacin en respuesta a determinados factores neurotrficos. Estudios recientes llevadoa a cabo en nuestro laboratorio han puesto de manifiesto que PACAP promueve la diferenciacin de astrocitos a travs de la activacin de la activacin de la ruta de sealizacin dependiente de AMPc. Esta respuesta va est acompaada de la activacin transcripcional del gen de la protena cida fibrilar de la gla (GFAP). En este trabajo hemos identificado y caracterizado elementos de control en el ADN que regulan la expresin de GFAP en respuesta a PACAP/AMPc. Estos elementos se encuentran localizados en una localizados en una regin del promotor situada entre los nucletidos -384 y -35. Uno de ellos es reconocido por el factor Sp1 fundamentalmente en los periodos del desarrollo previos a la gliognesis. Experimentos de inmunoprecipitacin de cromatina y de retardos de la movilidad electrofortica en gel indican que la unin de Sp1 al promotor de GFAP sugieren que Sp1 puede intervenir en los mecanismos que previenen la expresin prematura de GFAP en precursores neurales. Otro factor de transcripcin identificado en este trabajo es NF1, que se une a un elemento del promotor de GFAP localizado en la vecinidad del reconocido por Sp1. El estudio de los complejos ADN-protena sobre elementos indica que NF1 ocupa el promotor de GFAP tanto antes como despus de la induccin de la gliognesis por PACAP. Ensayos de transfeccin en clulas precursoras de la corteza fetal mantenidas en cultivos primarios indican que NF1 es importante para la expresin de niveles apropiados de GFAP tanto en condiciones basales como tras la induccin de la astrogliognesis. Finalmente, hemos determinado que el promotor de GFAP contiene al menos dos elementos reguladores reconocidos por el factor de transcripcin DREAM. La integridad de estos elementos es esencial para la actividad tanto basal como inducida del promotor. experimentos de inmunoprecipitacin de cromatina demuestran que DREAM ocupa el promotor de gen de GFAP antes y despus de la diferenciacin de astrocitos inducida por PACAP en clulas precursoras de la corteza cerebral. Adems nuestros han puesto de manifiesto un mecanismo por el cual DREAM estimula la transcripcin del gen de GFAP desencadenada por PACAP. Este mecanismo requiere un incremento de la concentracin intracelular de calcio que es dependiente de la sntesis de AMPc. Por lo tanto nuestros estudios identifican a DREAM como un activador transcripcional dependiente de AMPc y calcio, que participa en los mecanismos moleculares de diferenciacin de astrocitos inducida por PACAP.
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MECANISMOS REGULADORES ASOCIADOS A LA GENERACIN DE DIVERSIDAD MUSCULAR EN DROSOPHILA MELANOGASTER: REGULACIN DEL GEN PARAMIOSINA/MINIPARAMIOSINA Y EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIN DE LA TROPONINA T . Autor: MARCO FERRERES RAQUEL. Ao: 2003.

Universidad: AUTONOMA DE MADRID. Centro de lectura: MEDICINA. Centro de realizacin: FACULTAD DE MEDICINA-UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. Resumen: La diferenciacin de los distintos msculos de un organismo requiere de la ejecucin coordinada de programas reguladores que van a determinar la expresin diferencial de genes y la produccin de isoformas especficas. Uno de los mecanismos mejor conocidos implicado en la generacin de diversidad muscular es la regulacin de la transcripcin. El gen paramiosina/miniparamiosina de Drosophila codifica dos protenas del filamento grueso de invertebrados: la Paramiosina (PM) y la Miniparamiosina (mPM) que se transcriben a partir de dos promotores distintos. La expresin de la PM est regulada por un activador muscular distal de 900pb, localizado a 1.4 kb del inicio de la transcripcin, qu es esencial para activar la expresin en todos los msculos de Drosophila, excepto en los msculos indirectos de vuelo. Esta regin contiene tres sitios de unin para el factor MEF2 conservados. Sin embargo, para la correcta expresin de la protena se requiere tambin la presencia de otros elementos localizados en posicin 3' de este activador (regin moduladora proximal) que contribuyen a modular los niveles de expresin. Por otro lado, la expresin de la mPM, est regulada por dos activadores: AB y TX, y un modulador: BF. AB es responsable de la expresin en los msculos indirectos de vuelo mientras que TX la activa en el resto de la musculatura. BF es responsable de modular los niveles de expresin de la mPM en los msculos torcicos de la mosca. Este elemento une el factor de transcripcin PDP1, que parece ser esencial en la expresin de la mPM. Las protenas musculares se acumulan en cantidades diferentes en los distintos msculos pero manteniendo siempre una estequiometra muy precisa. En este trabajo demostramos que el aumento de los niveles de expresin en los msculos indirectos de vuelo de Drosophila de un componente del filamento fino: la Troponina T, produce una disminucin de su sntesis y de la del resto de componentes del filamento fino. Este fenmeno interfiere con la formacin de los sarcmeros provocando graves alteraciones en la estructura y funcin de estos msculos. Estos resultados sugieren que la Troponina T es un componente clave en un mecanismo de regulacin feedback que controla la expresin de las protenas del filamento fino.
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CARACTERIZACIN DE RATONES KNOCK-OUT PARA EL GEN DE AE2 . Autor: RECALDE MAESTRE SERGIO. Ao: 2003. Universidad: NAVARRA. Centro de lectura: CIENCIAS. Centro de realizacin: UNIVERSIDAD DE NAVARRA. Resumen: La familia de los intercambiadores de aniones independientes de sodio est constituida por cuatro miembros (Ae1, Ae2, Ae3 y Ae4) que median el intercambio de C1-/HCO3- en la membrana celular, participando en la regulacin del

pHi y volumen celular y en el flujo transepitelial de iones. El gen Ae2 (Slc4a2) es el miembro de esta familia que presenta una expresin ms generalizada habindose descrito en la mayora de los tejidos. Para estudiar el papel que la protena Ae2 desempea en los diferentes tejidos se ha generado un modelo de ratn con el gen Ae2 parcialmente delecionado (ratones Ae2-/-). Estos ratones son viables aunque dependiendo la cepa utilizada, presentan una mortandad perinatal relativamente elevada. Se ha observado que los ratones machos Ae2-/- son infrtiles mientras que las hembras s llegan a ser frtiles. El anlisis histopatolgico de los testculos de los ratones Ae2-/- muestra azoospermia debida a una interrupcin de las espermiognesis en el estadio VII. Adems se observ un aumento del nmero de cuerpos apoptticos en los tbulos semniferos y en el epididimo. Por otra parte, el epitelio epididimal presenta alteraciones compatibles con una metaplasia escamosa. Estudios en el estmago demostraron que la funcin y morfologa gstricas estn severamente alteradas presentando hipoclorhdria, hiperplasia de clulas G e hipergastrinemia, incremento de la divisin celular de la mucosa y un aumento de la degeneracin de las clulas oxnticas. Por ltimo, se ha observado que los ratones Ae2-/- presentan un insuficiente control renal del equilibrio cido/base, as como alteraciones en el proceso de formacin y resorcin del sistema seo.
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ANLISIS FUNCIONAL DE GENES TARDOS DE LA RUTA BIOSINTTICA DE LA PIMARICINA DE STREPTOMYCES NATALENSIS ATCC 27448 . Autor: VAZ MENDES MARTA. Ao: 2002. Universidad: LEON. Centro de lectura: BIOLOGA . Centro de realizacin: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS. Resumen: La primaricina es una molcula prototipo de los macrlidos polienos utilizada en la industria alimentaria y en oftalmologa en la prevencin de infecciones fngicas. La agrupacin gnica responsable de la biosntesis de este antibitico en S.natalensis ATCC 27448 ha sido secuenciada. La secuencia ha desvelado la presencia de cinco genes que codifican para la sintasa de la pimaricina (PIMS), pimSO- pimS4, y 13 genes adicionales posiblemente relacionados con la modificacin, regulacin y secrecin de la pimaricina. En esta tesis, se realiza un estudio funcional de los genes de pimD, pimK y pimE. El gen pimD codifica para una citocromo P-450 monooxifenasa funcional implicada en la epoxidacin en C4-C5 de la pimaricina. La inactivacin gnica de pimD result en la obtencin del mutante S.natalensis 6D41. La caracterizacin de este mutante mostr que produca 4,5desepoxipimaricina retiene cierta actividad biolgica aunque siete veces inferior que la de la pimaricina. La purificacin de la protena codificada por pimD, PimD. El gen pimK codifica para una glucosiltransferasa responsable de la introduccin del residuo de micosamina en el anillo macrocclico de la pimaricinolida. La inactivacin de pimK result en la obtencin del mutante S.natalensis 1D62 que produce 15desmicosamina-4,5-desepoxipimaricina. Este nuevo compuesto, un precursor de la pimaricina, no present actividad biolgica. Al contrario de algunos polienos, el residuo de micosamina resulta ser esencial para la actividad de la pimaricina. Los

resultados obtenidos han permitido concluir que los ltimos pasos de la ruta biosinttica de la pimaricina, se realizan de una forma secuencial actuando PimD despus de PimK. El gen pimE codifica para una protena precursora de una colesterol oxidasa funcional. La inactivacin de este gen origin la cepa no productora de pimaricina, S.natalensis 1D31.
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MIP-1BETA(CCL4): ESTUDIO DE SU REGULACIN TRANSCRIPCIONAL Y EVALUACIN DE LAS IMPLICACIONES DEL POLIMORFISMO A NIVEL DEL LOCUS B. Autor: ADREANI RIZO PATRICIA. Ao: 2002. Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA. Centro de lectura: CIENCIAS. Centro de realizacin: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIN CONTINUADA. Resumen: Las Quimiocinas constituyen un pequeo grupo de molculas estructuralmente relacionadas, que se caracterizan por regular el trfico de varios tipos de leucocitos en condiciones fisiolgicas y patolgicas. En general las quimiocinas se han clasificado en cuatro grupos, en funcin de los residuos de cistena que se encuentran en el extremo N-terminal de la protena madura. Los cuatro grupos son: Las XC quimiocinas alfa-quimiocina, las CC quimiocina s betaquimiocinas, las C quimiocinas gamma-quimitocina y finalmente la CX3C quimiocina *-quimiocina. Dentro del grupo de las beta-quimiocinas, se encuentran MIP-1alfa y MIP-1beta, que se localizan en el cromosoma 17q 11.2. Las quimiocinas ejercen sus efectos biolgicos, a travs de la unin con sus receptores que se encuentran expresados en la superficie de diversos grupos leucocitarios. Se ha descrito la utilizacin de tres receptores para MIB-1beta: CCR5, CCR8 y CCR9, siendo el CCR5 el que le otorga propiedades antiviriales, ya que este representa uno de los correceptores del VIH-1. Se ha descrito que MIB-1beta sta codificada por dos loci, el Locus A y el locus B; y que ste ltimo define un polimorfismo en la quimiocina. Esta forma polimrfica se caracteriza por la delecin de 15 pb en el exn 3, que se origina a partir de un cambio de base (A260 - G), provocando que se sintetice una protena con 5 aminocidos menos. Para determinar la incidencia de este polimorfismo dentro de la poblacin sana, se estudi la distribucin allica en 200 individuos sanos a travs de la tcnica de PCR-SSP, confirmadas posteriormente por las tcnicas de PCR-SSO post-hibridacin y secuenciacin; revelando que la frecuencia del alelo cannico representa un 83,5, mientras que la frecuencia del alelo polimrfico representa un 16,5%. As mismo el estudio fue realizado en una poblacin de pacientes con enfermedades tiroideas autoinmunes, pacientes diabticos, pacientes con hepatitis C, observando que existe una correlacin entre la frecuencia genmica y la frecuencia allica de estos pacientes respecto a la poblacin normal. Sin embargo, en los pacientes con VIH se observaron diferencias claras y estadsticamente significativas respecto a los individuos sanos. Para estudiar los niveles de expresin de MIP-1alfa y de MIP1beta, utilizamos un protocolo que, aprovechando pequeas diferencias a nivel de la

secuencia nucleotdica, combina RT-PCR y restriccin con MspI para estimar semicuantitativamente los nivles de ARNm de los loci codificantes para cada una de las dos quimiocinas. El aspecto ms relevante de esta tcnica, es el uso de un fragmento de ADN recombinante, que acta de Estndar Interno, tanto para MIP1alfa como para MIP-beta, a la vez que contiene un lugar de restriccin para MspI. De esta manera acta como control de la amplificacin y de la digestin. Esta metodologa se aplic para determinar las posibles diferencias que pudieran existir en los niveles de expresin de los loci A y B de MIP-1beta, en la lnea celular U-937 tras su estimulacin con PMA, LPS e ionomicina, as como tambin entre individuos sanos y pacientes VIH+ (de diferentes genotipos) en PBMCs y linfocitos T CD8+, estimulados con PHA e IL-2. El estudio mostr que los loci A y B se regulan de manera diferente en las clulas U-937 y las cinticas de expresin de mRNA son equivalentes en PBMCs y linfocitos T CD8 de pacientes VIH+ y en controles. En trminos generales el locus B contribuye de manera minoritaria a la sntsis de mRNA de MIP-1beta y la cintica de induccin del mRNA de los linfocitos T CD8, se ve retrasada y heterocigotos y homocigotos (bb). Por otro lado, los niveles de expresin del receptor CCR5 en linfocitos T CD4+ son diferentes a los que prsentan los controles. Finalmente, podemos concluir que MIP-1beta ejerce un efecto diferencial sobre sus clulas diana debido a las distintas iso- y alo-formas que presenta.
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EXPRESIN Y MODULACIN DE GENES DEL DESARROLLO SEO: LOS CASOS DE LA FIBRODISPLASIA OSIFICADORA PROGRESIVA (FOP) Y DELA HETEROPLASIA SEA PROGRESIVA (POH) . Autor: TARRS DE VEH MARC . Ao: 2002. Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA. Centro de lectura: CIENCIAS. Centro de realizacin: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIN CONTINUADA. Resumen: El estudio de los procesos moleculares implicados en la regulacin de la osteognesis se ha realizado en base a dos enfermedades humanas diferentes, las cuales estn caracterizada por la formacin ectpica de hueso de naturaleza distinta: la FOP (la fibrodisplsia osificadora progresiva) con formacin de hueso endocondral y la POH (la heteroplsia sea progresiva) con formacin de hueso de origen intramenbranoso. Uno de los enigmas por resolver en la biologa del esqueleto hace referencia a las seales moleculares que son necesarios y suficientes para inducir una adecuada formacin del esqueleto. Aunque no se ha identificado del gen que causa la FOP, los resultados obtenidos, pueden, de hecho, ayudar a identificar el gen mutado mediante una atencin central a porciones del camino de transduccin de senyal de las BMPs. Aqu es donde el gen responsable de la FOP tiene mas posibilidades de encontrarse ya que nuestros resultados indican de la existencia de un defecto en la sealizacin entre el estimulo de BMP-4 y sus cognados antagonistas noggin y gremlin, es muy probable que la mutacin responsable de la FOP se ubique en uno de los genes codificadores de protenas mediadoras o reguladoras del camino de sealizacin de BMP-4. En el estudio relacionado con la

POH, se ha demostrado que existen mltiples formas del gen GNAS1/gnas que se expresan en clulas preosteoblsticas MC3T3-E1 de ratn y tambin en LCLs humanas. Cuando las clulas se orientan hacia un linaje osteognico se observan notables diferencias en la expresin de los transcritos de gnas. La inhibicin de las isoformas Nesp55 y de la nueva forma de Gsalfa y una activacin progresiva de las isoformas Xlalpha, antisentido y Gsalfa con el exon 3 excluido, en conjunto, puede proporcionar un mecanismo coordinado que involucre la unidad transcripcional de gnas en el proceso de diferenciacin osteognica de las clulas pluripotentes, sugiriendo la predisposicin de las hMCS a dirigirse a linajes osteognicos o adipognicos est gobernada por mltiples interacciones entre los diferentes transcritos de gnas. Adems, nuestros resultados indican que niveles reducidos hasta la mitad de los transcritos GNAS1 en individuos FOP podran influir en los procesos "downstream" que conducen hacia un fenotipo osteognico compotente. Este trabajo de investigacin ha permitido situar en un mismo plano de estudio procesos de osteognesis de naturaleza distinta, los cuales se desencadenan por caminos de transduccin de seal alternativos. Las rutas de transduccin de seal de factores TGF-beta (BMP-4) y protenas G se entrecruzan las unas con las otras (Cross-talking). Mutaciones en los genes codificadores de protenas mediadoras o reguladoras del camino de sealizacin de BMP-4 y defectos en las rutas de sealizacin de receptores acoplados a protenas G pueden contribuir directa o indirectamente a la patognesis de muchas enfermedades con formacin heterotpica de hueso.
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ASOCIACIONES DE LOS GENES DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y DE LAS CARACTERSTICAS CLNICAS DE LOS PACIENTES CON ESCLEROSIS MLTIPLE DE LA PROVINCIA DE MLAGA . Autor: FERNNDEZ SNCHEZ VICTORIA EUGENIA . Ao: 2001. Universidad: MALAGA. Centro de lectura: MEDICINA. Centro de realizacin: FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE MLAGA. Resumen: INTRODUCCION La esclerosis mltiple EM han sido asociada con el haplotipo HLA de clase II, DR2 (DRBI*501, DQA1*0102, DQB1*0602) en todas las poblaciones estudiadas excepto en la poblacin de Cerdea donde la EM se encuentra asociada exclusivamente con DR4. Otras poblaciones (Turqua, Islas Canarias) muestran una asociacin secundaria con DR4 (DRB1*04 DQA1*03 DQB1*0302). Las asociaciones de los genes HLA con las manifestaciones clnicas de la enfermedad permanece controvertido. Adems,la EM presenta una recurrencia familiar del 10-20%. La posibilidad de que la EM familiar tenga rasgos clnicos distintivos es objeto de controversia. Existen escasos datos sobre la prevalencia y las caractersticas clnicas de la EM familiar en Espaa. El 30% de pacientes con EM tratados con interfern beta (IFNB) no muestran una clara respuesta positiva al tratamiento. OBJETIVOS 1,- Investigar la hiptesis de que la EM familiar es una enfermedad similar a la EM espordica en la provincia de Mlaga. 2,- Investigar las posibles asociaciones HLA de clase II (DRB1, DQA1 y DQB1) con la EM en Mlaga.

3,- Investigar las posibles asociaciones del los alelos y haplotipos HLA de clase II con las caractersticas clnicas de la EM. 4,- Investigar las posibles diferencias clnicas basales y de antgenos de histocompatibilidad HLA entre los pacientes sin beneficio clnico del tratamiento con IFNB y los que s lo presentan. MATERIAL Y MTODOS PACIENTES: Desde 1990 una cohorte de 634 pacientes consecutivos con EM han sido seguidos prospectivamente en el Hospital Regional Universitario Carlos Haya de Mlaga. Durante el periodo 1998-2000 genotipamos 149 pacientes con EM. Todos tenan progenitores espaoles caucasoides, eran residentes en Mlaga y tenan una EM clnicamente definida segn los criterios de Poser. Se buscaron activamente las familias con ms de un caso de EM, encontrndose 34 casos (5,4%) en 19 familias.Adems, estudiamos 72 pacientes en tratamieto con IFNB durante un mnimo de un ao y los clasificamos en dos categoras: respondedores en 2 ms brotes y/o progresin de 0,5 ms puntos en la escala EDSS tras un ao de tratamiento. Analizamos las caractersticas clnicas de todos los pacientes: sexo, edad, edad de comienzo, sntomas de comienzo, forma clnica segn la clasificacin de Lublin, duracin de la enfermedad, EDSS e ndice de progresin. CONTROLES: 160 controles sanos fueron seleccionados del banco de donantes de sangre y fueron apareados por edad y sexo. Todos eran residentes permanentes en Mlaga. MTODOS DE GENOTIPOS HLA DE CLASE II: Analizamos las subregiones de HLA clase II DRB1, DQA1 y DQB1 mediante la reaccin en cadena de la polimersas y con hibridacin inversa con series especficas de sondas de oligonucletidos (PCR/SSO, Inno-Lipan, Innogenetics) para DRB1 y DQB1 con cebadores secuencias especificos (PCR/SSP, Dynal) para los subtipos de DRB1 y el locus DQA1. ANLISIS ESTADSTICO: Los datos clnicos y de HLA fueron introducidos en una base de datos y analizados con el programa estadstico SPSS, versin 9.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Las frecuencias de los alelos DRB1, DQA1 y DQB1 de los pacientes y los controles fueron comparadas utilizando x2 con la correccin de Boinferroni para comparaciones mltiples. Las comparaciones entre el genotipo HLA y las caractersticas clncias se realizaron mediante el test de x2 para las variables categoras: sexo, sntoma de comienzo, forma clnica, respuesta al taratamiento con IFNB y mediante los tests de T Student o Mann-Whitney para las variables cuantitativas: edad de comienzo, edad en el momento del estudio, tiempo de evolucin de la enfermedad, puntuacion EDSS en el momento del estudio y el ndice de progresin. Se realiz un anlisis multivariante mediante un modelo de regresin logstica que inclua los alelos HLA de clase II como variables independientes, y la condicin de pacientes con EM o control como variable dependiente. RESULTADOS Las caracteristcas clnicas de los pacientes genotipados era similares a las de la cohorte completa de Mlaga. Se detectaron asociaciones positivas entre la EM y los alelos HLA de clase II DRB1*1501 (45,6% vs 21,3%, p corregida (pc) = 0,001, odds ratio (OR) = 3,1 (IC 95% = 1,89-5,11)), DQA1*0102 (51% vs 29,4%, pc = 0,001, OR = 2,3 (IC 95% = 1,48-3,) y DQB1*0602 (45% vs 20,6%, pc = 0,001, OR = 3,1 (IC 95% = 1,90-5,18) y el ahplotipo DR2 (DRB1*1501 DQA1*0102 DQB1*0602) (43,6% vs 20%, pc= 0,002, OR = 3,09 (IC 95% = 1,86-5,12). Ninguno de los alelos o haplotipos HLA clase II estaba significativamente asociado a ninguna de las caractersticas clnicas estudiadas en nuestros pacientes con EM. No se detectaron diferencias significativas entre las caractersticas clnicas ni en las distribuciones de los alelos y haplotipos HLA de clase II de nuestros pacientes con EM familiar y espordica 52 (72%) de los pacientes era respondedores y 20 pacientes (27%) eran no-respondedores al IFNB.Las caractersticas clnicas basales eransimialres en ambos grupos, excepto la puntuacin media EDSS al comienzo del tratamiento, que era significativamente mayor (p= 0,001) en el grupo de pacientes no-repondedores )3,9 +- 1,2) que la de los respondedores (2,4 +- 1,01). Ninguno de los alelos haplotipso Hla de clase II estaba

significativamente asociado con la respuesta al IFNB.

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ACTIVIDAD Y EXPRESIN GNICA HISTIDINA DESCARBOXILASA EN ENTEROCITOS AISLADOS: INFLUENCIA DE LA CIRUGA, NUTRICIN Y GLUTAMINA. Autor: MARTNEZ MORENO JOS MANUEL. Ao: 2001. Universidad: MALAGA. Centro de lectura: MEDICINA. Centro de realizacin: FACULTAD DE MEDICINA DE MLAGA. Resumen: Los objetivos del presente trabajo son: determinar la actividad HDC y la expresin gnica en enterocitos aislados de la mucosa de yeyuno e leon de cerdos domsticos sanos. Estudiar la morfometria de las vellosidades intestinales, actividad y expresin gnica de la HDC a nivel transcripcional (ARNm) en enterocitos aislados sometidos a NE, NPT, SBP, reseccin intestinal baja del 75% y glutamina oral o parenteral. Estudiar la relacin entre la actividad enzimtica HDC y la morfometra de las vellosidades intestinales. El tejido utilizado fueron fragmentos de 15-20 centmetros de leon y yeyuno tomados antes de la manipulacin quirrgica y 7,14 y 42 das despus de la operacin. Los enterocitos se obtuvieron por rascado de la mucosa intestinal con un bistur. Para la morfometra se realizaron cortes de 7 mm., y se tiern con hematoxilina-eosina. La actividad HDC se determin midiendo la produccin CO2 marcado con carbono 14, procedente de histidina marcada con carbono 14 en el carbono 1. Para determinacin de la expresin gnica se empleo la RT. PCR aditiva.
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ALTERACIONES DE LOS GENES SUPRESORES TUMORALES P16/INK4A, P14/ARF Y P53 Y DEL REPARADOR MGMT EN MUESTRAS CITOLGICAS DE PACIENTES CON LEUCOPLASIA Y/O CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS: IMPLICACIONES EN LA CARCINOGNESIS ORAL . Autor: LPEZ MARTNEZ MNICA. Ao: 2001. Universidad: PAIS VASCO. Centro de lectura: CIENCIAS. Centro de realizacin: FACULTAD DE CIENCIAS. Resumen: La alta incidencia del cncer oral en la Comunidad Autnoma del Pas Vasco en comparacin con otros registros espaoles, 24,1/100.000 casos en hombres y 3,1/100.000 en mujeres, apunta hacia la necesidad de futuras acciones preventivas en este aspecto. En este sentido, la deteccin de alteraciones

moleculares implicadas en la tumorignesis del cncer oral de clulas escamosas (COCE), tales como la inactivacin de los genes supresores tumorales p16/INK4a, p14/ARF y p53 y del reparador del ADN MGMT, podra constituir un factor pronstico de la evolucin de las lesiones orales premalignas hacia cncer oral. El anlisis de muestras citolgicas de la cavidad oral en pacientes con lesiones precancerosas y cancerosas ha permitido la deteccin de alteraciones en estos genes implicados en la carcinognesis oral. El mtodo de anlisis molecular de las clulas desprendidas de la mucosa oral, desarrollado en este estudio, ha demostrado ser un procedimiento fiable y poco agresivo para la deteccin de clulas malignas en pacientes con riesgo de desarrollar un carcinoma de clulas escamosas. Este mtodo en combinacin con los datos clnico-patolgicos convencionales en pacientes con riesgo de desarrollar un carcinoma oral puede permitir establecer unos criterios ms fiables sobre la actitud terapetica y pronstica de una lesin precancerosa. Del mismo modo, posibilitara realizar un mejor seguimiento de los pacientes tratados de un COCE.
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SNDROME DE WILLIAMS: CLONACIN POSICIONAL DE GENES DELECIONADOS Y EVALUACIN EVOLUTIVA DE LA REGIN CROMOSMICA 7Q11.23 . Autor: LUIS JIMENZ OSCAR DE. Ao: 2001. Universidad: AUTONOMA DE MADRID. Centro de lectura: CIENCIAS. Centro de realizacin: FACULTAD DE CIENCIAS UNIV. AUTNOMA DE MADRID (MDULO CX). Resumen: El sndrome de Williams-Beuren (SW) consiste en una afectacin multisistmica en el desarrollo que afecta a los sistemas nervioso central, cascular, endocrino y al tejido conectivo. Los pacientes presentan un patrn de personalidad y cognitivo caracterstico. La base molecular del SW consiste en una delecin heterozigota en la banda cromosmica 7q11.23, definindose un intervalo tpico delecionado de 1.6 Mb encontrado en la gran mayora de los pacientes estudiados. El intervalo tpico delecionado contiene hasta 15 genes en copia nica. Solamente para el gen de la elastina ha sido demostrada una correlacin entre fenotipo SW (alteraciones vasculares como la estenosis artica suplavalvular y alteraciones del tejido conectivo) y hemizigosis. La hemizigosis para el gen de la LIM quinasa I ha sido relacionado con los problemas de cognicin visuoespacial, como parte necesaria pero no suficiente de un problema multifactorial. Para el resto de genes descritos en el intervalo, la correlacin entre hemizigosis y fenotipo SW an no ha sido aclarada. El intervalo tpico es flanqueado por tres regiones de secuencias repetidas en bajo nmero de copias, denominadas duplicones. El duplicn centromrico se localizan a 5' del primer gen delecionado del intervalo, el duplicn medial se localiza a 3' del ltimo gen delcionado del intervalo, y el duplicn telomrico se localiza a 3' del medial, en orientacin invertida respecto a los dos primeros (en tndem entre s). Cada duplicn mide aproximadamente 320 kb y contiene tres bloques gnicos diferenciados, denominados A (110 Kb), B (120 Kb) y C (80-100 Kb). Los duplicones presentan una alta identidad de secuencia entre ello,

haciendo sta regin susceptible a reordenamientos cromosmicos locales. Est propuesto que la delecin hemizigota surge por alineado inter- o intracromosmico incorrecto entre los bloques B de los duplicones centromrico y medial durante la meiosis. El estudio por cartografiado comparativo del genoma de otras especies es un herramienta que permite tanto el estudio de las relaciones evolutivas entre las especies como la validacin de una especie como modelo animal de un sndrome humano. En el caso del SW, en el cromosoma 5 de ratn (bandas G1-G2) ha sido descrito un grupo sintnico con 7q11.23 que no presenta duplicones y que contiene en copia nica y en el mismo orden todos los genes del intervalo crtico y de los duplicones humanos. En la evolucin entre ratn y primates no se ha descrito la presencia de duplicones flanqueando la regin de SW, pero s se han aportado previamente indicios respecto a su posible presencia en primates. Los objetivos de sta tesis son el clonaje y caracterizacin de genes delecionados en 7q11.23 y de sus correspondientes ortlogos murinos, la delimitacin del intervalo delecionado y del punto de rotura en 7q11.23 y la caracterizacin de la aparicin de los duplicones en la evolucin de los primates. En el presente trabajo se han identificado, clonado posicionalmente y caracterizado los genes WBSCR14 y GTF2IL de la regin cromosmica 7q11.23 humana. Tambin han sido identificados, clonados posicionalmente y caracterizados sus correspondientes ortlogos murinos, Wbscr14 y Gtf2il: El gen WBSCR14 es de copia nica y se encuentra en el interior del intervalo critico delecionado en el SW. Se sita entre los genes TBL2 y STX1A, en sentido transcripcional de telmero a centrmero. La estructura genmica abarca 33 Kb con 17 exones, 16 intrones y una regin promotora inserta en una isla CpG. El mRNA consta de 3270 pb y codifica una secuencia polipeptdica de 852 aa que contiene, entre otros, un dominio bHLHLz que define a WBSCR14 como un nuevo miembro de la familia de factores de transcripcin Mlx (Cairo y col., 2001). Se expresa preferente en hgado adulto y durante el desarrollo fetal. Se ha caracterizado un nuevo microsatlite polimrfico intragnico con una heterocigosidad del 40%. El ortlogo murino Wbscr 14 presenta un mRNA de 3131 pb codificando una protena de 864 aa con los mismos dominios y un patrn de expresin que se incrementa durante el desarrollo fetal siendo similar en el animal adulto. Ha sido cartografiado en la banda G1 del cromosoma 5 de ratn, regin sintnica con 7q11.23 humana. WBSCR14 podra participar en funciones de regulacin del desarrollo de vertebrados (regulacin heptica y desarrollo fetal heptico tardo) y estar implicado en alguno de los aspectos fenotpicos del SW. El gen GTF2IL existe en tres copias localizadas en los bloques B de cada duplicn que flanquean el intervalo delecionado, conjuntamente con los genes GTF21 y NCF1, en direccin transcripcional opuesta a ambos. La estructura genmica de cada locus abarca 56 Kb en las que contiene 16 exones, 15 intrones y una regin promotora aparentemente sin caja TATA. El mRNA consta de 3471 pb codificando una secuencia aminoacdica deducida de 949 aa (copia media) y 967 aa (copias centromrica y telomrica). La protena presenta dos repeticiones internas derivadas de GTF21 con estructura HLH, un dominio zinc-finger de tipo C2H2 y una significativa homologa con transposasa (Buster 1), lo cual sugiere posibles acciones directas sobre el ADN, quiz como factor de transcripcin. Una copia queda delecionada en pacientes con SW (la centromrica en la mayora de los casos). Presenta un patrn de expresin ubicuo tanto durante el desarrollo como en estado adulto en los tejidos analizados y hay constancia slo de expresin de las copias medial y telomrica. El ortlogo murino Gtf2il es de copia nica y su mRNA de 3251 pb codifica una secuencia aminoacdica deducida de 936 aa con los mismos dominios. Presenta un patrn de expresin ubicuo en los tejidos analizados, prcticamente basal durante el desarrollo y preferente en hgado y testculo en estado adulto. Dado que la(s) copia(s) funcional(es) del gen no quedan delecionadas en pacientes con SW, es improbable que participe en el fenotipo, si

bien su funcin podra complementar de alguna manera la prdida de GTF21 y GTF2IRDI. Se han caracterizado los puntos de rotura cromosmicos para un paciente concreto afecto de SW cuyo cromosoma delecionado haba sido separado en hbridos somticos. El fragmento de unin se localiza en la regin intergnica entre GTF2IL y NCF1. Por genotipado y Southern Blot, se han refinado los puntos de rotura en un cierto nmero de pacientes adicionales, y parecen ocurrir en NCF1/P1 o en la regin intergnica descrita. Ensayos recientes no includos en esta tesis han demostrado la variabilidad en el punto exacto de rotura entre pacientes, si bien todos se concentran en el bloque B. Estos resultados indican la existencia de una predisposicin preferente de este bloque para el malalineamiento cromosmico, pero la ausencia de puntos calientes para la recombinacin desigual dentro del intervalo. Ello descarta la posibilidad de establecer un test molecular simple como herramienta para detectar fragmentos de unin y diagnsticar el SW. El estudio llevado a cabo en distintas especies de primate sobre la presencia y nmero de copias de los genes GTF2l, GTF2lL, NCF1, POM121 y STAG3 ha permitido establecer en la existencia de todos ellos en copia nica hasta hace 35 millones de aos. El bloque A que contiene secuencias relacionadas con STAG3, se detecta duplicado en gorilas y probablemente triplicado en chimpancs. Los bloques B y C no aparecen duplicados hasta los seres humanos. En discusin con datos publicados anteriormente, se ha propuesto que la estructura final de los duplicones que flanquean la delecin aparece como tal en humanos, sugirindose un cambio evolutivo reciente. Se ha establecido un modelo de formacin y expansin de los duplicones basado en el modelo de evolucin cromosmica propuesto previamente por diversos autores para el cromosoma 7 humano, y en la expansin por duplicaciones previas del bloque A que posteriormente mediaron la dos duplicaciones de bloques B y C hasta las tres copias.
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ANLISIS DE LOS DOS PROMOTORES ALTERNATIVOS DEL GEN DE LA ATPASA DE CALCIO DEL RETICULO SARCO/ENDOPLASMICO DE ARTEMIA FRANCISCANA . Autor: MARTNEZ LAMPARERO ANA. Ao: 2001. Universidad: AUTONOMA DE MADRID. Centro de lectura: CIENCIAS. Centro de realizacin: INSTITUTO DE INVESTIGACIN BIOMEDICAS ALBERTO SOLS. Resumen: La ATPasa de calcio del retculo sarco/endoplsmico (Sarco/Endoplasmic Reticulum CaATPase, SERCA) es una protena integral de membrana implicada en el transporte de calcio desde el citoplasma al retculo sarcoplsmico de las clulas musculares o al endoplsmico de las no musculares. Esta protena presenta en el crustceo Artemia franciscana dos isoformas distintas que se expresan en diferentes tejidos. Una de ellas est codificada por un mRNA de 4.5 kb que se expresa en msculo y la otra por un mRNA de 5.2 kb que se expresa en la totalidad de los tejidos. Cada uno de estos mRNAs se transcribe desde uno de los dos promotores alternativos que posee este gen. El estudio de los dos promotores que presenta este

gen en el curstceo Artemia franciscana ha sido el objetivo de esta Tesis. Se ha intentado identificar y caracterizar las principales regiones reguladoras presentes tanto en el promotor muscular (Pr 1) como en el promotor no muscular (Pr 2). Por un lado se han realizado estudios de unin de protenas nucleares de Artemia a los promotores mediante tcnicas de proteccin a digestin por Dnasa I. Ambos promotores presentan zonas protegidas cuando se incuban sondas de dichos promotores con extractos de nauplias. Estas regiones no aparecen cuando se incuban dichas sondas con extractos de quistes, lo que sugerira la existencia de distintos factores de transcripcin en embriones enquistados y en nauplias. Tambin se han realizado ensayos funcionales mediante tcnicas de expresin transitoria en clulas de mamferos. Los dos promotores son activos en clulas de mamfero, si bien el promotor muscular presenta una ms baja actividad. En clulas de insecto la actividad de ambos promotores es muy baja. Los estudios realizados han permitido detectar en el promotor no muscular regiones reguladoras de la actividad transcripcional situadas a 1.2-1.4 kb del origen de transcripcin, una activadora, en la zona ms distal del promotor, y una represora situada en una regin ms proximal respecto al inicio de transcripcin. Este tipo de estudios no permiti detectar ninguna regin reguladora del promotor muscular en clulas de mamfero, lo cual podra justificar la escasa actividad del promotor en estas clulas.
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OBTENCIN Y EVALUACIN DE HBRIDOS DE TRIGO Y CEBADA Y APLICACIN DEL ANFIPLOIDE TRIGO X CEBADA A NUESTRA AGRICULTURA . Autor: JIMNEZ FERNNDEZ M. DOLORES. Ao: 2001. Universidad: CORDOBA. Centro de lectura: INGENIEROS AGRNOMOS. Centro de realizacin: E.T.S.I.A.M.. Resumen: Los tritrdeos son hbridos obtenidos por el cruzamiento entre una cebada silvestre y diferentes tipos de trigo potencialmente dotados de un alto contenido proteico. En este trabajo se ha procedido a la identificacin de este material desde dos puntos de vista fundamentalmente: A,- CITOLGICO Se ha determinado el contenido proteico y de ARNr de distintas combinaciones genmicas realizadas indistintamente con los genomios A, B, D, propios del trigo y los H y R propios de cebada y centeno respectivamente. As mismo se han establecido estadsticamente las posibles relaciones entre estos contenidos y otros parmetros como el rea nucleolar, nmero mximo de nucleolos, nmero medio de nucleolos y ADN. B,- BIOQUMICO Se ha procedido a la caracterizacin bioqumica de generaciones avanzadas de tritrdeo. Para ello se han determinado del contendio proteico de las semillas, el contenido en fibras cido y neutro detergente (ADF y NDF), el perfil aminoacdico, el fraccionamiento proteico y el contenido en nitrgeno no proteico (NNP). La fraccin proteica gliadina result ser la mayoritaria por lo que se procedi tambin a la determinacin de los aminocidos de la misma. Entre todos ellos se han estudiado estadsticamente sus correlaciones. Nuestros estudios revelan la potencialidad de este nuevo material en cuanto al contenido proteico.

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ESTUDIO DE LA SEALIZACIN POSITIVA DE GENES DE LA RUTA DE ASIMILACIN DE NITRATO DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII . Autor: LLAMAS AZA ANGEL. Ao: 2001. Universidad: CORDOBA. Centro de lectura: CIENCIAS . Centro de realizacin: FACULTAD DE CIENCIAS. Resumen: Adems de nutriente, el nitrato es una molcula seal que regula una serie de procesos metablicos y de diferenciacin. Como seal positiva, el nitrato regula la expresin de genes implicados en su propia asimilacin, como son los trasnportadores de nitrato y nitrito (TN, Tni), la nitrato reductasa (NR) y la nitrito reductasa (NiR). En cuanto a procesos de diferenciacin, el nitrato interviene en la morfognesis de la raz. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el profundizar en los mecanismos de sealizacin positiva de la ruta de asimilacin de nitrato de Chlamydomonas reinhardtii. Mediante mutagnesis insercional, con un gen que confiere resistencia al antibitico Zeomicina (ble) se ha pretendido identificar posibles nuevos genes relacionados con la sealizacin positiva del nitrato, se ha demostrado: 1,- Que el gen ble no es un marcador selecionable adecuado para mutagnesis insercional en Chlamydomonas, debido al efecto mutagnico de la Zeomicina. 2,- El gen Nit2 es esencial para la expresin de la NR. Se ha realizado un estudio de la actividad de promotores de varios genes de la ruta de asimilacin de nitrato (Nia1, Nrt2;1, Nar1) fusionados al gen reportero de la Arilsulfatasa como sensor de la sealizacin positiva. Se ha comprobado que el fenmeno de autorregulacin de Nia1 se explica por una sealizacin persistente del nitrato debido a la ausencia de NR y a la presincia de un sistema de transporte de alta afinidad. Demostrndose que son los distintos sistemas de transporte de nitrato y/o nitrito, dependiendo de su afinidad capacidad, y especificidad para transportar nitrato o nitrito, as como otras caractersticas de inhibicin por otros factores ambientales, son los que regulan la concentracin intracelular de nitrato y as la expresin de los genes que activa. El gen Nit2 tiene una regulacin muy precisa, est sujeto a represin por amonio pero no a induccin por nitrato, y es esencial para sentir el nitrato intracelular. Se ha Estudiado el nitrito como seal en los genes de la asimilacin de nitrato, se ha comprobado que el nitrito per se es una seal positiva para la expresin de los genes Nar1 y Nrt2;1 pero no para Nia1.
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REGULACIN DE LA EXPRESIN DEL GEN TRL DROSOPHILA: CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE LA REGIN PROMOTORA . Autor: KOSOY DAROQUI ANA. Ao: 2001.

Universidad: BARCELONA. Centro de lectura: BIOLOGA. Centro de realizacin: FACULTAD DE BIOLOGA. Resumen: El factor Gaga est involucrado en una gran variedad de procesos relacionados con transcripcin en Drosophila. La regin genmica correspondiente con el promotor TRL fue obtenida y una visin mnima del promotor TRL fue definido utilizando transfecciones transitorias en clulas Sa. Mediante anlisis de footprinting con DNAsaI de esta regin localizamos mltiples lugares de unin para Gaga sugiriendo un papel regulatorio potencial para Gaga sobre su propio promotor. El estudio demostr que Gaga regula negativamente su promotor. Esta represin es dependiente de la unin Gaga al DNA. Un fragmento de 400 pares de bases del promtor del TRL es capaz de mediar represin en un promotor heterlogo. Nuestros resultados abren la posibilidad de observar efectos de represin mediados para Gaga.
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AMPLIFICACION ISOTERMICA DE ACIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS PARA ANALISIS DE ALTERACIONES GENETICAS EN ADN GENOMICO. Autor: LAGE MARTIN JOSE MANUEL. Ao: 2000. Universidad: GRANADA. Centro de lectura: MEDICINA . Centro de realizacin: FACULTAD DE MEDICINA. Resumen: Diversas tcnicas para el diagnstico del cncer necesitan muestras de ADN procedentes de un reducido nmero de clulas. Estas clulas pueden ser extradas del conjunto heterogneo de clulas que constituyen el tumo mediante microdiseccin, que garantiza la homogeneidad de las clulas de inters. Hasta la fecha se handesasrrollado diveros mtodos de amplificacindel ADN genmico procedente de estas clulas de inters, ya que en caso contrario resultara insuficente el ADN genmico original para abordar el diagnstico. Estos mtodos se fudamentan en la tcnica de amplificacin mediante PCR o "reaccin en cadena de la polimerasa". En el desarrollo de esta tesis se muestra la optimizacin de un mtodo de amplificacin isotrmica como alternativa a los mtodos derivados de la PCR, Este mtodo, por su simplicidad, podra facilitar su uso en anlisis diagnsticos que requiriesen un elevado nmero de muestras, ya que sera fcilmente automatizable. Para comprobar la homogeneidad de la reaccin se realiz un anlisis preliminar mediante la tcnica de array-CGH, estableciendo una comparacine ntre un ADN genmico no amplificado,y un ADN aplificado de una lnea celular de cncer de mama. Igulamente se desarrollaron microarrays de ADN complementario con los que evaluar sobre un mayor nmero de genes la homogeneidad de la amplificacin isotrmica de ADN genmico.
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ACTIVIDAD DEL SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA EN RELACION CON SUSJ POLIMORFISMOS GENETICOS.

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