CITOGENTICA MOLECULAR

Jorge Quintana Aguilar

El ao 1977 marca el inicio de la era de la citogentica molecular. Los avances en este campo de la citogentica son impresionantes. Con este tipo de estudio se puede lograr identificar defectos submicroscpicos del ADN y disminuir la brecha que existe entre la deteccin de una simple insercin o delecin de un nucletido, la insercin o delecin de varios de ellos y la observacin de estos defectos a nivel de la citogentica convencional. La importancia extrema de estos avances tcnicos motiv la realizacin de este captulo en el que se exponen las caractersticas y fundamentos que combinan instrumentos moleculares a partir del ADN recombinante y la citogentica.

TCNICAS DE HIBRIDACIN in situ

La tecnologa de "hibridacin in situ" (HIS) combina las tcnicas de citogenticas convencionales con tcnicas moleculares y est basada en la deteccin de secuencias especficas de cidos nucleicos, bien sea en cromosomas aislados o clulas interfsicas. Fue descrita originalmente por Pardue y Gall, John y cols., en 1969 utilizando istopos radiactivos para marcar las sondas, las cuales, combinadas con tcnicas de autoradiografa posibilitaron la deteccin de las secuencias hibridadas. En 1977, Rudkin y Stollar describieron un mtodo inmunocitoqumico basado en la utilizacin de anticuerpos anti ADN anti ARN marcados con sustancias fluorescentes detectables microscpicamente. Este procedimiento se conoce como tcnica de "hibiridacin in situ fluorescente" (FISH) o "hibiridacin no isotpica". Actualmente existen dos mtodos de FISH, llamados directos e indirectos. Los mtodos directos permiten realizar la visualizacin microscpica de la seal inmediatamente despus de realizada la HIS. El marcaje directo emplea nucletidos marcados con sustancias fluorescentes. Los mtodos indirectos se basan en la utilizacin de sondas unidas a molculas tales como la biotina o digoxigenina marcadas con una sustancia fluorescente que permite su 75

visualizacin al microscopio con luz ultravioleta. Estos mtodos se pueden combinar con tcnicas inmunocitoqumicas basadas en reacciones antgeno - anticuerpo para aumentar la intensidad de las seales fluorescentes. La Biotina 11 - dUTP y la digoxigenina 11 - dUTP son dos ejemplos de bases anlogas que pueden ser incorporadas al ADN en lugar de dTTP. La biotina (vitamina H) tiene la ventaja de poseer una gran afinidad por las protenas avidina y estreptoavidina, dando lugar a uniones casi irreversibles. La digoxigenina es un derivado de la digitoxina procedente de la Digitalis purprea y D. lanata que resulta altamente eficiente en reacciones antigeno anticuerpo en clulas. Existe una amplia variedad de sondas disponibles comercialmente. Otra alternativa para la obtencin de sondas se basa en la amplificacin del ADN en vectores y su marca posterior por medio de la tcnica conocida como "nick translation". Mediante la FISH pueden detectarse diferentes tipos de secuencias en el genoma humano, de acuerdo con las sondas utilizadas. Algunas de ellas se citan a continuacin. . Sondas de secuencias nicas o copia simple: se utilizan para la deteccin de secuencias especficas en regiones subtelomricas y otros sitios tiles para la identificacin de alteraciones submicroscpicas, como por ejemplo, 15q11-q13. . Sondas centromricas: se basa en la utilizacin de sondas a satlites que permiten la deteccin de secuencias altamente repetitivas localizadas en regiones pericentromricas. Una desventaja de estas sondas es la hibridacin cruzada entre regiones homlogas de diferentes cromosomas, por ejemplo entre los cromosomas 13/21 y 14/22. . Sondas de secuencias para regiones especficas: se basa en la deteccin de secuencias altamente repetitivas localizadas en determinadas regiones de los cromosomas, como por ejemplo, la regin Yq12. . Sondas para el pintado de cromosomas completos (WCP): detectan secuencias de eucromatina en determinados brazos o cromosomas completos.

MTODOS DE HIBRIDACIN in situ

La metodologa general utilizada para la FISH sobre ADN descrita por Pinkel y cols., en 1986, se basa en los principios siguientes. . Preparacin de lminas y extensiones. . Pretratamiento del material extendido.

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. . . . .

Desnaturalizacin del ADN. Hibridacin. Lavados post hibridacin. Marca de la sonda. Observacin al microscopio.

A continuacin se describen los aspectos bsicos esenciales de los protocolos de laboratorio, en relacin con la hibridacin in situ ADN - ADN. Para ello se requiere de preparaciones de clulas, cromosomas, o ambos, de ptima calidad. Preparacin de lminas y extensiones: se recomienda la limpieza de lminas portaobjetos con alcohol ter (1:1) y realizar fijacin de las extensiones. Pretratamiento del material extendido: Se utiliza la ARNasa para eliminar el ARN endgeno. El HCl permite la extraccin de protenas e hidrlisis parcial del ADN - blanco. Las proteasas provocan la digestin de la cubierta protenica del ADN - blanco mejorando la accesibilidad de la sonda. Desnaturalizacin del ADN: en caso de que se utilicen sondas de doble hlice es necesario realizar la desnaturalizacin del ADN - sonda y el ADN - blanco. La desnaturalizacin se realiza mediante pH extremadamente alcalino o por calor. Hibridacin: mltiples factores influyen sobre la hibridacin. La velocidad de hibridacin aumenta proporcionalmente con la concentracin del ADN. Adems, la cantidad de hbridos obtenidos ser mayor cuanto ms largo sea el tiempo de hibridacin. Por otra parte, el dextrn sulfato es importante tambin porque al hidratarse facilita obtener una mayor concentracin relativa de la sonda. Lavados post hibridacin: los lavados astringentes permiten eliminar el llamado "ruido de fondo" (HIS no especfica) mediante la utilizacin de soluciones salinas poco concentradas a altas temperaturas. Marca: se pueden realizar diferentes tipos de marcas mediante sistemas que utilizan principalmente la biotina digoxigenina. Las sondas de ADN marcadas con biotina pueden detectarse por la va de la avidina la cual es una glicoprotena unida a la fluorescenaisotiocianato (FITC) que es la sustancia fluorescente. La avidina tiene 4 sitios de unin con la biotina, lo cual resulta en un complejo muy estable. Para aumentar la seal fluorescente se puede realizar la amplificacin con un anticuerpo anti-avidina (obtenido de cabras) el que posteriormente se pone en contacto nuevamente con avidina marcada con FITC. Observacin al microscopio: la observacin al microscopio requiere de una fuente de luz ultravioleta y de un sistema de filtros adecuados de acuerdo con las longitudes de onda de las seales fluorescentes. Adems, se utilizan programas automatizados, los cuales permiten realizar el anlisis utilizando diferentes colores simultneamente (FISH multicolor), as como tambin mediante anlisis de la intensidad de las seales fluorescentes (Figuras 7.1 y 7.2). 77

Figura 7.1. FISH sobre clulas en interfase utilizando sonda centromrica para cromosomas X (Oncor). Obsrvese el marcaje de 2 cromosomas X.

Figura 7.2. FISH sobre clulas en interfase y cromosomas utilizando sonda centromrica para cromosomas 18 (Oncor) en un caso de trisoma 18.

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Otros procedimientos, tales como el cariotipo espectral (SKY), la microdiseccin y pintado reverso de cromosomas, la hibridacin genmica comparativa (CGH) se desarrollan actualmente principalmente en el campo de las investigaciones Las tcnicas de citogentica molecular se han aplicado a los estudios de cartografa gentica y de expresin gnica.

RESUMEN
Ms que sintetizar los aspectos tratados mencionar la utilidad de la tecnologa de citogentica molecular en el diagnstico de las enfermedades genticas: - Anlisis de clulas interfsicas. Permite realizar marcas fluorescentes en clulas interfsicas sin necesidad de realizar cultivos para la obtencin de cromosomas lo cual posibilita realizar diagnsticos prenatales rpidos de las aneuploidas ms comunes. - Diagnstico de alteraciones submicroscpicas tales como los sndromes de microdeleciones o por defectos de genes contiguos. - Anlisis de marcadores cromosmicos de origen desconocido. Los estudios moleculares resultan particularmente tiles para precisar el origen y composicin del material gentico en estos casos. - Reordenamientos complejos en casos de clulas tumorales y hemopatas malignas. Cuando se presentan translocaciones complejas que involucran a ms de dos cromosomas pueden detectarse con precisin los sitios de roturas e intercambios del material gentico.

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