UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZAN

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD E.A.P. DE MEDICINA HUMANA

Ao del Centenario de Machu Picchu para el Mundo

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FACULTAD DE CIENCIAS MDICAS E.A.P DE MEDICINA HUMANA

OBSERVACIONES MICROCPICAS, MORFOLOGA MICROBIANA EXAMEN EN FRESCO Y COLORACION SIMPLE

DOCENTE: Tec. Md. Lucy Mendoza Vilca. ALUMNO: PARRA ARTEAGA, M. Pal AO : Segundo SEMESTRE: II

HUNUCO-PER 2011
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA MDICA

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OBSERVACIONES MICROCPICAS, MORFOLOGA MICROBIANA, EXAMEN EN FRESCO Y COLORACION SIMPLE

I. OBSERVACIONES MICROCPICAS La visualizacin de los microorganismos es el camino de diagnstico microbiolgico ms evidente. Desgraciadamente el pequeo tamao de los patgenos y su enorme homologa estructural generan complicaciones. Para paliar el problema del tamao se utilizan sistemas de ampliacin de imagen, lupas y microscopios. Las tinciones diferenciales y las especficas de determinadas estructuras bacterianas nos ayudan a discriminar siquiera someramente entre unos grupos bacterianos y otros. Normalmente la visualizacin microscpica de los microorganismos slo nos orienta en la identificacin. nicamente en casos muy puntuales la deteccin de estructuras completamente especficas puede ofrecer un diagnstico definitivo. Las bacterias tienen un tamao medio de un micrmetro (10-6 metros). Las levaduras son unas tres o cuatro veces mayores. Los virus son mucho ms pequeos, se mueven en el orden de 20 a 250 nanmetros (10-9 metros). Los parsitos tienen una variabilidad enorme de tallas; los protozoos son los ms pequeos y tienen el tamao aproximado de una clula eucariota (10-20 micrmetros). Las tenias son las ms grandes y pueden alcanzar varios metros de longitud. Exceptuando tenias y trematodos la visualizacin de patgenos requiere tcnicas de ampliacin de la imagen. Los microscopios pticos ofrecen hasta 100 aumentos, y permiten ver bacterias, hongos y protozoos. Para ver virus es necesaria una resolucin mucho mayor que slo alcanza el microscopio electrnico. Entonces, La Observacin Microscpica constituye la primera etapa del estudio de los microorganismos y tambin del diagnstico microbiolgico ya que permite conocer algunas caractersticas de los microorganismos, como ser: forma, disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc. Las observaciones microscpicas de los microorganismos, como bacterias, suelen hacerse con objetivos de mayor aumento y de inmersin. La observacin al microscopio ptico con distintas coloraciones y de los cultivos bacterianos, tienen un rol importante en la identificacin de las bacterias y su ubicacin taxonmica. Las fotomicrografas con aquellos microscopios que tienen incorporada una cmara fotogrfica, permiten usualmente visualizar los microorganismos en dos planos y las
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imgenes generalmente a 1000 aumentos. stas se encuentran principalmente en un atlas o como fotografas sueltas ilustrando manuales. Las imgenes a ms de 1000 aumentos suelen requerir el uso de microscopios electrnicos de transmisin o de barrido (scanning). Con este ltimo se obtiene imgenes tridimensionales, en muchos casos de gran ayuda para el mejor conocimiento de los microorganismos.

II. MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA 1. DEFINICIN:

Las bacterias o procariotas, son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisin binaria (divisin simple). Muchos tienen vida libre. Contienen informacin gentica, sistemas de produccin de energa y sistemas biosintticos necesarios para el crecimiento y reproduccin. Las bacterias integran el reino procariota (pro de primitivo y cariota de ncleo). Las bacterias son microorganismos unicelulares, siendo entonces clulas procariotas. Existen dos grupos de procariotas evolutivamente distintos, las eubacterias y las arquebacterias.

2. TAMAO:
Las bacterias presentan una amplia diversidad de tamaos, que va desde 0.5 a 2 micrmetros y algunas pueden llegar a 10 micras. No son visibles por supuesto al ojo humano y se visualizan con microscopio ptico (MO) o electrnico (ME). Las bacterias pueden ser observadas al MO sin ser coloreadas si se las coloca en glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el ndice de refraccin. Para observarlas con el microscopio ptico se usa el objetivo de inmersin (100X), sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersin) en el preparado a observar. Las bacterias se pueden observar sin colorear utilizando la tcnica de microscopa de campo oscuro en la que utilizando un condensador especial se ven sobre un fondo

3. MORFOLOGA: a. Microscpica
La forma de las bacterias al microscopio est determinada por la rigidez de su pared celular. Bsicamente, se diferencian segn su forma en cocos (esfricas u ovaladas), bacilos (cilndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral).

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FORMAS BSICAS DE LAS BACTERIAS. Cocos Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

Divisin a lo largo del mismo plano, forma esfrica llama Coco 2 cocos juntos: Diploco cos 4 - 20 en cadenas: Estreptococos cortas formando cadenas Divisin a lo largo de 2 planos diferentes: Ttradas regularmente: Sarcinas irregularmente: Estafilococos Divisin a lo largo de 3 planos

Bacilos grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma vara:

de se

Dos juntos:

bacilos

Empalizadas, Cadenas de bacilos: Estreptobacilos Bacilos X, V o Y lado con lado o en figuras en

llaman Bacilos

Diplobacilos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

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Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.

b. Macroscpica
La mayora de las bacterias se multiplican rpidamente y son visibles como colonias cuando se las siembra en medios de cultivo slidos adecuados. Requieren una incubacin de aproximadamente 24 horas en una atmsfera que favorezca su desarrollo, a temperatura ptima. Existen excepciones como M. tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a ocho semanas de incubacin. Una colonia est constituida por los descendientes de una o unas pocas clulas. Las caractersticas de la colonia tambin dependen de la movilidad de la bacteria. El tamao puede variar desde 0.5 mm (Haemophilus sp. o N. gonorrhoeae) a ms grandes como las enterobacterias. La forma de la colonia puede ser circular (Staphylococcus), irregular o filamentosa (Bacillus). Los bordes pueden ser ondulados (caractersticos de los bacilos largos como Bacillus anthracis), en sierra o dentados (Yersinia pestis) o lisos (por ejemplo

Proteus vulgaris o Escherichia coli). La superficie de la colonia tambin es

orientadora y puede ser: plana, convexa, mamelonada, umbilicada (S. pneumoniae). En relacin al pigmento que adquieren, ste puede ser: verde ( P. aeruginosa), amarillo (S. aureus), grisceo (N. meningitidis). Tambin es diferente el comportamiento frente a la luz: brillante (Streptococcus) u opaca (Staphylococcus). Pueden presentar olores particulares como el frutal de P.

aeruginosa o el putrefacto de los anaerobios.

Por ltimo hay que destacar la consistencia: mucoide (M), liso (S) o rugoso (R). Las colonias M tienen aspecto acuoso, brillante, propio de las bacterias capsuladas o que forman cubiertas polisacridas como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus

pneumoniae, Haemophilus influenzae. Los polmeros capsulares pueden ser

especficos de grupo y son generalmente antignicos. Entre las bacterias patgenas, las formas capsuladas suelen ser ms virulentas. Por otra parte, las colonias S son de aspecto homogneo, de textura uniforme y son caractersticas de microorganismos de tipo salvaje recientemente aislados de su hbitat natural como las enterobacterias. Las colonias R son de aspecto granulado, en general son cepas mutantes que carecen de protenas o polisacridos de superficie. Las formas R de enterobacterias, por ejemplo, generalmente no son virulentas, en oposicin a la mayor resistencia de las bacterias procedentes de colonias S de tipo salvaje. Un cuarto tipo de colonia es la L y se asocia a la ausencia de la pared celular como

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resultado de la exposicin a antibiticos; en general estas formas vuelven a sintetizar la pared celular una vez que el frmaco se extrae del medio.

4. ESTRUCTURA:
Una clula bacteriana tpica tiene las siguientes estructuras: Material gentico ADN, circular y cerrado, bajo forma de un cromosoma nico que no est rodeado de membrana nuclear, esta caracterstica es la diferencia fundamental con la clula eucariota, la cual posee siempre membrana nuclear. Presentan adems ribosomas, citoplasma y membrana. Por fuera est la pared bacteriana, estructura compuesta por peptidoglucano (a excepcin de los

Mycoplasmas). Las diferentes estructuras bacterianas las podemos dividir, segn

sean constantes en las clulas o no, en estructuras permanentes y variables. Estructuras permanentes: - membrana celular - ribosomas - material gentico Estructuras variables: - pared celular - cpsula - flagelo - fimbrias o pilis - esporas Al decir estructuras variables queremos decir que estas estructuras existen en algunas bacterias y no en todas, y aun en un mismo grupo bacteriano o una misma cepa bacteriana las puede presentar o no, dependiendo de las condiciones en donde se desarrolle. Las estructuras variables no son necesarias para la vida de la clula bacteriana. a. MATERIAL GENTICO: ADN bacteriano: Carece de una membrana nuclear, tampoco posee nuclolo, ni aparato mittico, y nunca configura una masa cromosmica definida. El material gentico est compuesto de una estructura fibrilar, constituida por un ADN circular de doble cadena, enrollado sobre s mismo. Si bien se asocia a protenas bsicas, estas no son verdaderas histonas. Los mesosomas son, al parecer, invaginaciones de la

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membrana citoplasmtica y participan en la divisin celular y en la replicacin de ADN; el ADN se fija al mesosoma en la etapaprevia de la divisin celular. Plsmidos: Constituyen el material gentico extracromosmico. Estn constituidos por secuencias cortas de ADN circular bicatenario, que pueden existir y replicarse independientemente del ADN cromosmico y son heredados por las clulas hijas. Aunque no son esenciales para la vida de la bacteria, generalmente proveen a sta una ventaja selectiva, por ejemplo: resistencia a los antibiticos, nuevas capacidades metablicas, patognicas (cuando codifican para factores de virulencia como toxinas, etc.) u otras numerosas propiedades. Pueden transferirse de bacteria a bacteria mediante un proceso denominado conjugacin. b. RIBOSOMAS: La clula bacteriana presenta ribosomas libres en el citoplasma con coeficiente de sedimentacin de 70S. Se presentan tambin como polirribosomas que son cadenas de ribosomas asociados a ARN mensajero y en parte en relacin con el ADN cromosmico. Contienen todos los componentes que permiten la sntesis proteica. Las clulas poseen ms ribosomas si estn creciendo en medios ricos. El alto contenido de ARN determina gran afinidad por los colorantes bsicos. c. MEMBRANA CELULAR: Estructura delgada que rodea a la clula de 8 nm de espesor. Es una estructura vital, si se altera, la clula pierde su vitalidad. Composicin: es similar a la mayor parte de las membranas biolgicas. Una doble capa fosfolipdica en donde el cido graso hidrofbico se orienta hacia el interior y el glicerol hidroflico hacia el exterior de la clula. A diferencia de la clula eucariota no posee esteroles (excepto los micoplasmas). Algunos antibiticos, cuyo blanco de ataque en la clula bacteriana es la membrana celular, actan inmediatamente que la clula se pone en contacto con stos. Los antibiticos de este tipo, son por su mecanismo de accin, txicos para los tejidos humanos y poco utilizados en medicina clnica. Funcin: Delimita el interior del exterior celular, es una barrera osmtica muy importante, interponindose a la libre difusin entre el medio ambiente interno y externo Es una membrana con permeabilidad selectiva, a travs de la cual ingresan los nutrientes y salen los productos de desecho. El transporte de solutos

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se realiza muchas veces por un sistema de transporte activo, como se analizar al estudiar el metabolismo bacteriano. En la membrana celular estn los sistemas de fosforilacin, oxidacin y transporte de electrones (citocromos) para la produccin de energa. Dentro de las diversas actividades enzimticas vinculadas a las protenas de la membrana citoplasmtica, podemos sealar su participacin en la biosntesis del ADN, de los constituyentes de la pared, etc. Los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmtica que forma vesculas, tbulos o lamelas. Aunque se han investigado durante aos, su funcin exacta an se desconoce; pueden estar involucrados en la formacin de la pared celular durante la divisin celular o en la replicacin del cromosoma y su distribucin a las clulas hijas. d. PARED CELULAR: Estructura rgida presente como ya se dijo en la mayora de las bacterias, se sitan por fuera de la membrana citoplasmtica. Es una estructura vital para las bacterias que las poseen. Si sta se destruye o se impide su formacin, la clula pierde su viabilidad. El peptidoglicano, principal constituyente de la pared, es un polmero constituido por unidades repetidas del monmero formado por: dos derivados de carbohidratos, N-acetil Glucosamina y N-acetil Murmico (N-Ac.G, NAc. M), unidas por enlaces beta 1-4 y asociados a cortas cadenas peptdicas a travs del N-acetil Murmico. El espesor de la pared en los diferentes microorganismos, oscila entre 0,150 um y 0,500 um de (um=micra). Podemos imaginar entonces la pared celular, como una macromolcula gigante constituida por peptidoglicano, que en forma de bolsa rodea toda la clula, representando del 10 al 40 % del peso de la bacteria. Unido al N-acetil murmico se encuentra un tetrapptido como. Los tetrapptidos de una cadena de peptidoglicano se unen con los de la otra a travs de puentes peptdicos. Los aminocidos que formanlos tetrapptidos son los siguientes: L-Alanina, Acido DGlutmico, Acido mesodiaminopimlico (o L-Lisina) y DAlanina. Podramos resumir de la siguiente manera la sntesis del pptidoglicano: En el momento de la divisin celular se debe formar la nueva pared celular. Las autolisinas, enzimas roducidas por la propia bacteria, forman brechas en la "vieja pared" de la clula en divisin. A nivel de esas brechas o aberturas es donde se agrega el peptidoglicano de la nueva pared en formacin. La mayor parte de la informacin se ha obtenido de la sntesis del peptidoglicano de Staphylococcus

aureus y la explicacin que sigue se restringir a este organismo. En el citoplasma

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se une el N-acetil Murmico a un transportador lipdico de membrana: el bactoprenol, luego se une la Nacetil Glucosamina y, finalmente, el puente de pentaglicina. El bactoprenol transporta el bloque formado a travs de la membrana citoplasmtica. Una vez en el espacio periplsmico, estos bloques son colocados en las brechas ya formadas. El paso final y fundamental para una correcta funcin de la pared es la unin los monmeros de peptidoglicano entre si. Esta unin la realizan enzimas denominadas transpeptidasas. A este paso se lo conoce como transpeptidacin. La Penicilina y sus derivados, los antibiticos ms usados en Medicina, actan precisamente inhibiendo la sntesis de la pared celular, llevando a la lisis de la bacteria. La unin de los puentes peptdicos se pueden hacer como ocurre en la mayora de las bacterias por uniones directas transpetdicas entre la D-Alanina de un puente peptdico y el cido diaminopimlico (DAP) de otro tetrapptido adyacente. En Staphylococcus aureus la reaccin de transpeptidacin se efecta mediante un puente de pentaglicina, el cual une la L-Lysina de un tetrapptido con la D-Alanina de otro tetrapptido adyacente. Existen diferencias en el espesor de esta estructura bsica, el peptidoglicano de las bacterias Gram positivas tienen una capa gruesa de 0,02 a 0,06 m en forma de multicapas, mientras que las bacterias Gram negativas y las bacterias cido alcohol resistentes la tienen ms fina, de 0,01 m. Al peptidoglicano se le unen otros componentes que son, por lo tanto, tambin integrantes de la pared. Son diferentes en las bacterias Gram positivas, negativas y cido alcohol resistentes. e. CPSULA Cuando existe est ubicada por fuera de la pared celular. Las bacterias producen material capsular que, cuando se asocia ntimamente a la superficie celular recibe el nombre de cpsula. Si su adherencia es dbil y de grosor variable, se conoce como limo. Generalmente es de naturaleza polisacrida (a excepcin de la cpsula del Bacillus anthracis que es peptdica). No es una estructura vital para la clula, su prdida no se relaciona con la prdida de viabilidad celular, pero s con cambios de la morfologa colonial y con la prdida de la virulencia bacteriana. La virulencia de algunos patgenos se correlaciona con la presencia de cpsula, como por ejemplo: Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b. La cpsula protege a la bacteria de la fagocitosis, principal mecanismo de defensa que pone en juego el husped ante la presencia de bacterias capsuladas. Una respuesta efectiva para defenderse de este tipo de bacterias implica la produccin de
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anticuerpos que se unan especficamente a la cpsula facilitando la opsonizacin y la fagocitosis. De su capacidad antignica se desprende el uso de la cpsula para la produccin de diferentes vacunas que estimulan la formacin de anticuerpos especficos. Ejemplos de ellas son las vacunas: anti neumoccica, anti Haemophilus influenzae tipo b y anti meningoccica A, B y C. Las bacterias que producen cpsula forman en los medios slidos colonias acuosas, mucoide (M) o lisas (S), en cambio, las cepas rugosas (R) no producen cpsula. La prdida de la capacidad de formar cpsula por mutacin S a R se correlaciona con la prdida de la virulencia y el aumento de la susceptibilidad a la destruccin por los fagocitos; aunque no afecta la viabilidad. Muchas cepas bacterianas producen cpsula o limo cuando son aisladas en cultivo por primera vez a partir de un husped. Con los reaislamientos sucesivos, dejan de producirla, lo que indicara que la presencia de la cpsula no ofrece ventaja selectiva in vitro. Su produccin est regulada genticamente, de forma que las bacterias la presentan cuando es necesaria para la supervivencia dentro del husped. La presencia de cpsulas tambin se puede demostrar por tincin negativa con tinta china. La tinta china no penetra la cpsula pero delimita un contorno refringente alrededor del cuerpo bacteriano en un fondo oscuro. Los antgenos capsulares son muy tiles en la clasificacin e identificacin de diferentes bacterias, por ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

influenzae, Neisseria meningitidis, etc.

f. FRIMBIAS O PILIS: Las fimbrias son estructuras filamentosas proteicas similares a los flagelos en su composicin y morfologa, pero no participan en la motilidad y son menos abundantes y ms cortas. Es una estructura variable que la poseen algunas bacterias. Las fimbrias o pilis comunes se relacionan con la adherencia de las bacterias a superficies inertes o vivas. De gran importancia en este sentido es la adherencia especfica que presentan muchas bacterias a determinados epitelios, jugando un papel fundamental en la colonizacin. Esto se debe a que las fimbrias encuentran en las clulas epiteliales receptores especficos para ellas. A modo de ejemplo, las cepas de Neisseria gonorrohoeae patgenas son aquellas que poseen fimbrias que se adhieren especficamente al epitelio uretral del hombre o al crvix uterino en la mujer.Las cepas de E. coli capaces de causar infeccin urinaria tienen fimbrias que les permiten una adhesin especfica al epitelio del aparato urinario. Tambin E. coli enteropatgena clsica (EPEC) tiene fimbrias
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que le permiten adherirse especficamente al epitelio intestinal para luego producir los cambios a ese nivel que determinarn la instalacin de la diarrea. Existen otros pilis llamados sexuales que son ms largos y se presentan en nmero de dos o tres por clula. Estos pilis sexuales intervienen en el intercambio gentico entre bacterias, de all su nombre. El apareamiento de dos bacterias y la transferencia de ADN a travs del pili sexual se conoce como conjugacin. Se transfiere material gentico de una clula donadora a una receptora y se transfiere slo pequeos sectores de ADN, en general un plsmido o una porcin de cromosoma movilizada por unplsmido. La clula donadora tiene un plsmido llamado conjugativo que posee la informacin gentica para que esa clula 10 produzca el pili sexual que le permita la unin a la clula receptora. Una vez unidas los pilis sexuales se retraen, permitiendo que las clulas se unan y pase el ADN de la clula donadora a la receptora, formndose, al parecer, una verdadera unin entre las membranas de las clulas que forma un puente para el pasaje de ADN. La clula receptora est estrechamente emparentada con la donadora y posee un receptor especfico para los pilis sexuales.

g. FLAGELOS:
Los flagelos son filamentos largos, delgados, helicoidales, de longitud y dimetro uniforme. Son responsables de la motilidad de las bacterias. Presentan flagelos fundamentalmente: bacilos Gram positivos y Gram Negativos. El flagelo est compuesto de 3 partes, el filamento, el gancho y el cuerpo basal. El filamento es externo con respecto a la clula y se une al gancho en la superficie celular. El gancho est fijado al cuerpo basal, que a su vez est anclado en la membrana plasmtica. El cuerpo basal est compuesto de un cilindro y dos o ms juegos de anillos contiguos a la membrana plasmtica, el peptidoglicano y, en el caso de las bacterias Gram negativas, a la membrana externa. Los flagelos pueden variar en nmero desde uno, unos pocos o varios cientos como en algunas cepas de E. coli. Segn el nmero de flagelos y su topografa en la clula podemos hablar de monotricas cuando tienen un flagelo nico, lofotricas cuando presentan un penacho de varios flagelos polares, anfitricas si los flagelos se encuentran en ambos polos y peritricas cuando los flagelos estn distribuidos sobre toda la superficie celular.Esporos: algunas bacterias producen en su interior esporos o endosporas. Estas estructuras son muy resistentes al calor, la desecacin, la radiacin, los cidos, y los desinfectantes qumicos. Los producen algunas familias
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de bacilos Gram positivos. El esporo se forma en la clula vegetativa en ciertas condiciones como son la escasez de nutrientes. En lugar de dividirse la clula, sufre una compleja serie de fenmenos que dan lugar a la formacin de la espora. Una espora puede permanecer en ese estado durante muchos aos pero puede convertirse de nuevo en una clula vegetativa y volver a multiplicarse, fenmeno denominado germinacin de la espora. El descubrimiento de que hay bacterias que forman esporos fue de gran importancia para la microbiologa. El conocimiento de que existen estas formas altamente termoresistentes fue esencial para el desarrollo de mtodos adecuados de esterilizacin de medicamentos, alimentos, medios de cultivo microbiolgicos, etc. El ciclo vital de una bacteria productora de esporos se Los esporos son impermeables a los colorantes, entonces se pueden observar como regiones no teidas dentro de clulas que han sido coloreadas con colorantes Bsicos como el azul de metileno. Existen adems coloraciones especiales para teir los esporos. Si observamos una espora al microscopio electrnico se ve que presenta numerosas capas. La capa ms externa es una delicada y delgada cubierta llamada exosporium. Le sigue la cubierta de la espora, que est compuesta de una capa o ms de una sustancia parecida a la pared celular. Por debajo de la cubierta se encuentra la corteza y dentro de ella, el ncleo o corazn que contiene la pared de la bacteria que dio origen al esporo, la membrana citoplasmtica y la regin nuclear. Las esporas son ricas en cido dipicolnico e iones calcio y hay evidencias que esta asociacin cumple una funcin importante para conferir la excepcional resistencia al calor de los esporos. h. CUERPOS DE INCLUSIN Y PRODUCTOS DE ALMACENAMIENTO: Son grnulos de material orgnico o inorgnico, algunas veces rodeados de membrana. En general funcionan como almacenamiento de compuestos energticos que son usados como fuente de energa (polisacridos, lpidos, polifosfatos). El glucgeno constituye el principal elemento almacenado por las enterobacterias (40% de su peso). Algunas pseudomonas acumulan carbono como cido poli-hidroxibutirato y las micobacterias contienen grnulos de polifosfato. Con frecuencia las inclusiones pueden verse directamente con el microscopio de luz sin tinciones especiales. i. ESPOROS Algunas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva de resistencia, denominada endospora o espora. Se desarrollan dentro de clulas
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bacterianas vegetativas (por eso la denominacin de endospora) de los gneros Bacillus y Clostridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales estresantes como el calor, la desecacin, la radiacin ultravioleta, los cidos y los desinfectantes qumicos. Debido a su resistencia y al hecho de que varias especies de bacterias formadoras de esporas son agentes patgenos peligrosos, las esporas tienen gran importancia en microbiologa alimentaria, industrial y mdica. El conocimiento de estas formas altamente resistentes al calor (pueden sobrevivir a la coccin durante una o ms horas) fue esencial para el desarrollo de mtodos adecuados de esterilizacin para medicamentos, alimentos, medios de cultivo microbiolgicos, etc. En el ambiente las endosporas permiten la supervivencia de las bacterias cuando la humedad o los nutrientes son escasos. Se pueden observar con el microscopio ptico y electrnico. Como las esporas son impermeables a la mayora de los colorantes, se observan como reas incoloras dentro de las clulas coloreadas. Existen adems coloraciones especiales para teir los esporos

III. EXAMEN EN FRESCO

Los exmenes en fresco permiten visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teirlos, y por tanto vivos. Los microorganismos en general no presentan demasiado contraste respecto al medio que les rodea. A pesar de ello es posible verlos sin necesidad de teirlos gracias a la refringencia que despiden y sobre todo a su capacidad de movimiento en medios lquidos. La visualizacin de bacterias en fresco puede realizarse mediante la tcnica de la gota pendiente. Consiste en colocar una gota de la solucin con la bacteria en suspensin en un cubreobjetos que se coloca invertido sobre un portaobjetos excavado. Con el objetivo de 40 aumentos pueden detectarse las bacterias en movimiento por la refringencia que desprenden. Es una tcnica que apenas se utiliza en el diagnstico microbiolgico, porque ofrece muy poca informacin en cuanto a la estructura y composicin de las bacterias. Solamente puede tener utilidad en la comprobacin de la motilidad de los microorganismos. Los exmenes en fresco si constituyen un arma potente de diagnstico en las infecciones producidas por parsitos intestinales. Pueden detectarse huevos, quistes y trofozoitos que por sus caractersticas morfolgicas pueden generar por si solas un diagnstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse antes de realizar la preparacin en fresco con el fin de aclarar y concentrar los parsitos. Las infecciones producidas por Tricomonas vaginalis, un protozoo flagelado responsable de infecciones
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urogenitales, tambin se diagnostican mediante la visualizacin en examen en fresco directo del exudado uretral. Procedimiento e Importancia: Se realiza colocando el material a estudiar entre porta (lmina) y cubre objetos (laminilla), observndose posteriormente en objetivo de mediano aumento (40X) o sea, sin aceite de inmersin. Un hecho a tener en cuenta es que se trabaja con bacterias vivas, que no sufren artificio de fijacin ni coloracin, por lo que se deben extremar los cuidados para evitar la contaminacin. Esta tcnica nos permite apreciar la existencia de bacterias, su morfologa; y si presentan la propiedad de movilidad. Ello, a pesar de ser de gran importancia, puede resultar dificultoso de diferenciar del movimiento browniano tpico de las bacterias o de las corrientes lquidas presentes en la preparacin, por lo que generalmente se utilizan otras tcnicas para detectar esta propiedad. El examen en fresco tambin puede ser utilizado con tcnicas especiales, por ejemplo la tincin con tinta china nos permite identificar la presencia de una bacteria capsulada. Tambin puede utilizarse el examen en fresco en otro microscopio que no sea el de campo claro, como por ejemplo el de campo oscuro es el utilizado para la deteccin de

Treponema pallidum.
Esta tcnica no es de uso rutinario en los laboratorios porque las bacterias son difciles de visualizar debido a que su citoplasma es incoloro y presenta poca diferencia con el ndice de refraccin del vidrio y del agua, aportando adems las tcnicas de fijacin y coloracin mayor cantidad de datos.

IV. COLORACIN SIMPLE

Las coloraciones en microbiologa se utilizan para observar la morfologa bacteriana. Los tipos de coloraciones se dividen de acuerdo a la complejidad y a la afinidad estructural; en estas tinciones se observa morfologa, estructura y agrupamientos de microorganismos. 1. COLORANTE: Los colorantes son productos qumicos sintticos del tipo de la anilina capaces de combinarse con una gran variedad de sustancias impartindoles color. El color es impartido por su estructura qumica. Los colorantes de alquitrn de hulla usan bases de anillos aromticos tales como benceno, naftaleno o antraceno. Varios grupos qumicos son ligados a los anillos
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aromticos para impartir los diferentes colores. Los grupos productores del color son llamados cromforos, siendo los ms comunes p-quinona y diazo. Ciertos grupos qumicos llamados auxocromos, tales como los grupos amino e hidroxilo ayudan a fortalecer a los cromforos. Las propiedades cidas o bsicas de los colorantes permiten su fcil clasificacin en: Acidos: Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un ncleo colorante con carga (-), es decir el grupo inico que imparte el color tiene carga negativa, o, es un anin. Estos colorantes tien material citoplasmtico, no son muy usados en Microbiologa. P or ejemplo: eosina, rojo congo, fucsina cida Bsicos: En los que el ion que lleva el color tiene carga (+). Estos colorantes tienen afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los ms usados en microbiologa, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen cido ribonucleico en todo el protoplasma de la clula bacteriana, stas se tien fcilmente. Ej. Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta. Neutros: Se obtienen cuando se mezclan colorantes cidos y bsicos, donde la carga elctrica de stos es cero. P ej. Giemsa, derivado de sal de amonio y eosina. Caractersticas de un colorante: CROMFORO Un cromforo es la parte o conjunto de tomos de una molcula responsable de su color. Tambin se puede definir como una sustancia que tiene muchos electrones capaces de absorber energa o luz visible, y excitarse para as emitir diversos colores, dependiendo de las longitudes de onda de la energa emitida por el cambio de nivel energtico de los electrones, de estado excitado a estado basal. Cuando una molcula absorbe ciertas longitudes de onda de luz visible y transmite o refleja otras, la molcula tiene un color. Un cromforo es una regin molecular donde la diferencia de energa entre dos orbitales atmicos cae dentro del rango del espectro visible. La luz visible que incide en el cromforo puede tambin ser absorbida excitando un electrn a partir de su estado de reposo. En las molculas biolgicas tiles para capturar o detectar energa lumnica, el cromforo es la semimolcula que causa un cambio en la conformacin del conjunto al recibir luz.
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Tipos de cromforos Los cromforos se presentan casi siempre en una de dos formas: sistemas conjugados pi o complejos metlicos. En la primer forma, los niveles de energa que alcanzan los electrones son orbitales pi generados a partir de series de enlaces simples y dobles alternados, como sucede en los sistemas aromticos. Entre los ejemplos ms comunes podemos encontrar a los colorantes retinianos, (usados en el ojo para detectar la luz), varios colorantes de alimentos, colorantes azoicos para tela, licopeno, -caroteno, y antocianinas. Los cromforos de complejos metlicos surgen de la divisin de orbitales "d" al vincular metales de transicin con ligantes. Algunos ejemplos de estos cromforos se encuentran en la clorofila, usada por los vegetales para la fotosntesis, la hemoglobina, la hemocianina, y en metales coloreados como malaquita y amatista. Una caracterstica comn en bioqumica son los cromforos formados por cuatro anillos de pirrol, que pueden ser de dos tipos:
o

Pirroles en cadena abierta, no metlica: fitocromo, ficobilina, y bilirrubina. Pirroles en anillo (porfirina), con un ion metlico en el medio: hemoglobina, clorofila

AUXOCROMO

En qumica, son grupos o radicales positivos de tomos, que intensifican la accin de un grupo de tomos no saturados que, estando presentes en una molcula de una sustancia qumica, hacen que esta sea coloreada. Es decir son grupos cargados positivamente que intensifican una sustancia o cromforo en la sntesis de colorantes. Por definicin un auxocromo es un grupo funcional que no absorbe por si solo en la regin del ultravioleta pero que tiene los efectos de desplazar picos de los cromforos hacia longitudes de onda larga adems de aumentar sus intensidades. Muchos de estos grupos o radicales, son cidos y bases que originan colorantes cidos y bsicos, y que fijan eficazmente el colorante. Un ejemplo lo podemos encontrar en el in diazonio que es un cromforo fuerte generado por una base y cuya frmula es
+

donde R representa

cualquier grupo funcional y N es el auxocromo del in diazonio.

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Algunos ejemplos de auxocromos son: cidos: -COOH, -OH, -SO3H. Bsicos: -NHR, -NR2, -NH2. CROMGENO: Que produce color. Ejemplo: bacteria cromgena. Nombre dado a ciertas sustancias incoloras por s mismas, pero capaces, bajo diversas influencias (oxidacin) de originar productos coloreados. Ejemplo: cromgeno de la urobilina.

2. TINCIN SIMPLE
Las tinciones suponen la muerte de los microorganismos. No puede detectarse la capacidad de movimiento en las preparaciones teidas. Todas las tinciones tienen un paso previo de fijacin al portaobjetos que se realiza con calor o con lavado en alcoholes (metanol). A continuacin se aplican sustancias coloreadas que tien la superficie de los microorganismos. Las tinciones se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien diferenciales cuando usan ms de uno y tien de forma especfica distintas estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las ms utilizadas ya que ofrecen ms informacin diagnstica. Entonces se llama Tincin Simple porque nada ms usa un solo colorante, que puede ser azul de metileno, cristal violeta o carbolfucsina. Con este tipo de tincin se pude crear un contraste con el medio donde ests haciendo el frotis o tincin y vas a poder observar la morfologa y la disposicin bacteriana. La importancia est en que es muy fcil de aplicar. Las tcnicas de coloracin simple pueden ser positivas cuando el colorante es fijado por las clulas apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tie y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro. Todas las tinciones tienen el mismo esquema de realizacin. Pueden variar los colorantes, los tiempos de exposicin o las tcnicas de fijacin: Extensin. Consiste en obtener una pelcula fina de la muestra sobre el portaobjetos. Si se parte de medio lquido simplemente se extiende una pequea gota. Si se trata de una colonia nos ayudaremos de suero fisiolgico estril.

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Fijacin. Tras secar el porta las bacterias deben adherirse al cristal. Debe intentar conservarse lo ms posible las estructuras nativas del microorganismo. Puede utilizarse calor (flameado), o bien alcoholes.

Coloracin. Aplicacin de los colorantes. Su eleccin depende del tipo de tincin. Es necesario controlar la concentracin y el tiempo de exposicin para que los microorganismos queden suficientemente teidos y el fondo suficientemente claro

Lavado del exceso de colorante con agua. Tras el secado est listo para ver en el microscopio.

Preparacion del Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos.

o o

Azul de metileno................................................................................1 g Agua destilada...............................................................................100 ml

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