Quim. Nova, Vol. 30, No.

1, 116-124, 2007 ESPECTROSCOPIA DE RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR DE 13C NO ESTUDO DE ROTAS BIOSSINTTICAS DE PRODUTOS NATURAIS

Reviso

Fernando Csar de Macedo Jnior* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas - SP, Brasil Recebido em 2/9/05; aceito em 19/1/06; publicado na web em 30/8/06

C NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY IN THE STUDIES OF BIOSYTHETIC ROUTES OF NATURAL PRODUCTS. During the last five decades, as a result of an interaction between natural product chemistry, synthetic organic chemistry, molecular biology and spectroscopy, scientists reached an extraordinary level of comprehension about the natural processes by which living organisms build up complex molecules. In this context, 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy, allied with isotopic labeling, played a determinant role. Nowadays, the widespread use of modern NMR techniques allows an even more detailed picture of the biochemical steps by accurate manipulation of the atomic nuclei. This article focuses on the development of such techniques and their impact on biosynthetic studies.

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Keywords: 13C NMR; isotopic labeling; biosynthetic routes.

INTRODUO Os organismos vivos produzem mirades de compostos orgnicos cuja grande maioria parece no participar diretamente do seu crescimento e desenvolvimento. No entanto, a apreciao crescente dos diversos efeitos biolgicos produzidos por estas substncias, tradicionalmente denominadas metablitos secundrios, tem incitado uma reavaliao dos seus possveis papis, especialmente no contexto de interaes ecolgicas. Alm disso, o reconhecimento das propriedades biolgicas de ampla variedade de produtos naturais, termo empregado como sinnimo de metablitos secundrios, tem alimentado uma busca intensa por novos frmacos, antibiticos, inseticidas e herbicidas. Por estes motivos, a qumica de produtos naturais foi alvo de intensas investigaes durante as ltimas dcadas, resultando no desenvolvimento de teorias biossintticas e em maior compreenso dos mecanismos de ao das enzimas. Estas descobertas tiveram um grande impacto sobre a imaginao dos qumicos orgnicos, e a mimetizao de processos bioorgnicos em laboratrio levou a importantes avanos nos mtodos sintticos. Muitos destes desenvolvimentos no teriam sido possveis sem a ao de brilhantes pesquisas sobre as rotas biossintticas de metablitos secundrios, onde a marcao isotpica tem desempenhado um papel fundamental. As primeiras aplicaes destes experimentos consistiam na incorporao de substratos enriquecidos em elementos radioativos, os radioistopos. O produto natural marcado era destrudo atravs de sequncias de degradaes complexas e seus fragmentos eram monitorados quanto emisso de radiao. Neste contexto, o uso de istopos estveis, aliado espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN), consistindo em um mtodo rpido e no destrutivo, surgiu como uma ferramenta poderosa para elucidao de mecanismos bioqumicos. Durante as primeiras aplicaes da RMN a problemas biossintticos1, no final dos anos 60, o destino de precursores enri*e-mail: fmacedo@ufba.br Endereo atual: IQ - UFBA, 40170-290 Salvador - BA

quecidos em 13C era monitorado a partir dos aumentos nas intensidades dos sinais de 13C-H satlites no espectro de RMN de 1H. Este mtodo2, entretanto, no fornece informaes de carbonos no ligados diretamente a hidrognios e, assim, foi rapidamente superado pela espectroscopia de RMN de 13C. A partir dos anos 70, o estudo de rotas biossintticas recebeu um grande impulso com os avanos no campo da espectroscopia de RMN provenientes da introduo de tcnicas pulsadas associadas transformada de Fourier. Estes desenvolvimentos facilitaram imensamente a obteno de espectros de 13C de produtos naturais, at ento, dificultada pela sua baixa sensibilidade. Hoje em dia, como um resultado de meio sculo de desenvolvimentos, muito mais respostas podem ser obtidas mediante a manipulao precisa de ncleos atmicos. CONSIDERAES SOBRE RMN DE 13C Infelizmente, sob o ponto de vista da determinao estrutural, a distribuio isotpica do carbono na natureza de apenas 1,1% em 13C (nmero quntico de spin, I = 1/2) conferindo RMN deste ncleo uma falta de sensibilidade intrnseca. A grande maioria dos tomos de carbono (98,9%) constituda pelo istopo magneticamente inerte, o 12C (I = 0). Outra conseqncia deste fato, no raramente esquecida, que uma amostra, mesmo de um composto orgnico simples, constituda por uma mistura complexa de isotopmeros. Ver, por ex. a distribuio isotopomrica de carbono no etanol mostrada na Tabela 1. Como pode ser verificado, a maior parte de uma amostra de etanol (97,81%), constituda pelo isotopmero 1, no detectada pela RMN. Os isotopmeros 2 e 3, apresentando um ncleo de 13C Tabela 1. Distribuio isotopomrica de carbono no etanol no 1 2 3 4 Isotopmero CH3-CH2-OH CH3-CH2-OH CH3-13CH2-OH 13 CH3-13CH2-OH
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Distribuio Natural 98,9% x 98,9% = 97,81% 1,1% x 98,9% = 1,08% 98,9% x 1,1% = 1,08% 1,1% x 1,1% = 0,01%

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em diferentes posies, so responsveis pelos sinais do etanol em experimentos convencionais de RMN de 13C. Os espectros de RMN de 13C so complexos e apresentam muitas linhas devido aos acoplamentos escalares com os ncleos de hidrognio (nJCH onde n o nmero de ligaes entre os ncleos acoplados). As baixas intensidades dos sinais de 13C so, portanto, ainda mais reduzidas devido aos seus desdobramentos em multipletos. O desenvolvimento de tcnicas de dupla ressonncia possibilitou a supresso do acoplamento JCH fornecendo espectro de 13C apresentando apenas singletos. A verso mais comum deste experimento consiste na irradiao dos ncleos de hidrognio durante todo experimento de RMN de 13C e conhecido por desacoplamento heteronuclear em banda larga. Sob estas condies as intensidades dos sinais de 13C so ainda mais aumentadas devido ao efeito NOE (Nuclear Overhauser Enhancement). Como este aumento proporcional ao nmero de hidrognios ligados diretamente, os diferentes carbonos da molcula sofrero diferentes variaes de intensidade em virtude do NOE. Outra contribuio importante para esta distoro surge dos diferentes tempos de relaxao apresentados pelos diferentes carbonos na molcula, levando perda de intensidade durante o experimento devido saturao. Estas so as principais fontes de distores que impedem a integrao de espectros de RMN de 13C {1H}, ou seja, correlacionar a intensidade de um sinal com o seu nmero de carbonos. Finalmente, os sinais satlites resultantes do acoplamento escalar 13C-13C (1JCC), esperado para o isotopmero 4, normalmente no so distinguidos do rudo nestes experimentos devido a sua pequena percentagem. Os valores dos acoplamentos escalares 1JCC aumentam proporcionalmente ao carter s dos tomos na ligao e geralmente encontram-se entre 35 e 220 Hz. O acoplamento 1JCC depende ainda do substituinte X no fragmento 13C-13C-X. A introduo de uma ligao a mais entre os pares de 13C de um sistema de spins diminui bastante os valores do acoplamento escalar. Assim, os valores de 2JCC so, em mdia, 10 vezes mais baixos que os acoplamentos a uma ligao. Em geral, as magnitudes dos acoplamentos so suficientemente diferentes, permitindo distinguir os pares de carbonos que se encontram acoplados. Alm do desdobramento dos sinais, os ncleos 13C acoplados apresentam-se ligeiramente blindados (de 0 a 0,03 ppm) devido ao efeito isotpico sobre os seus deslocamentos qumicos (Figura 1). A baixa abundncia natural do 13C oferece a oportunidade de enriquecimentos, possibilitando os estudos biossintticos atravs da marcao isotpica. No caso do 13C, um enriquecimento de cerca de apenas 1% significa duplicar a intensidade do sinal correspondente.

sio, caracterizando a marcao simples. Assim, o mapeamento da incorporao destes precursores em metablitos determinado pela comparao do espectro de RMN de 13C {1H} do metablito marcado com o espectro do composto no marcado. O Esquema 1 mostra os resultados da incorporao de precursores enriquecidos simplesmente em 13C em metablitos.

Esquema 1. Efeito da incorporao de acetato marcado simplesmente sobre o espectro de RMN de 13C

A simplicidade e elegncia deste mtodo podem ser ilustradas pelo estudo sobre a tenelina (Esquema 2), um metablito isolado do fungo Beauveria bassiana3. A incorporao de precursores simplesmente marcados mostrou que o esqueleto inteiro (exceto pelos dois grupos metila, C-15 e C-16, originados da metionina) foi formado pela condensao entre uma cadeia policetdica de dez carbonos e a fenilalanina. As marcaes das posies C-4 e C-6 do metablito pela [1-13C] fenilalanina e [2-13C] fenilalanina, respectivamente, indicam que o carbono carboxlico transferido de C-2 para C-3 do aminocido durante a biossntese.

Esquema 2. Proposta de biossntese da tenelina

Figura 1. Efeito isotpico do 13C sobre o deslocamento qumico em RMN de 13 C

MARCAO COM 13C Marcao simples Um dos mtodos de marcao com 13C mais empregados consiste na utilizao de precursores enriquecidos em apenas uma po-

A concluso a respeito do envolvimento da cadeia policetdica baseia-se no mecanismo de incorporaes sucessivas de unidades C-C intactas na construo destas cadeias. Neste processo, uma cadeia policetdica R-COSEnz estendida mediante sucessivas condensaes descarboxilativas com o grupo malonil de 3 carbonos, resultando em um aumento de dois carbonos a cada repetio do ciclo4 (Rota A; Esquema 3). Assim, a incorporao de acetato simplesmente marcado em um policetdio resulta em um padro apresentando posies marcadas e no marcadas alternadas. A utilizao de metionina marcada resultou no enriquecimento das metilas 15 e 16 possibilitando assim, a determinao de sua origem. Inicialmente, a reao da metionina com ATP catalisada pela metionina-adenosil-transferase transfere a metila marcada para a Sadenosilmetionina (SAM), um importante agente metilante biolgico. A C-metilao da cadeia policetdica pela SAM, por sua vez,

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catalisada por uma trans-metilase especfica. A reao sempre se processa via ataque eletroflico da metila reativa do on sulfnio a um metileno enolizvel conforme mostrado no Esquema 4.

Esquema 3. Etapas enzimticas de alongamento de uma cadeia policetdica

Esquema 4. Metilao biolgica de uma cadeia policetdica

Em uma outra aplicao da marcao simples, a estereoespecificidade da insero do grupo isopropila da valina durante a biossntese da cefalosporina (I; Esquema 5) e penicilina (II) foi estabelecida pela incorporao dos precursores quirais marcados: (2RS, 3R)-valina [4-13C] (III) e (2S, 3S)-valina [4-13C] (IV). Estes estudos5 permitiram concluir que os grupos isopropilas so incorporados com reteno de configurao.

{1H} do metablito enriquecido e no enriquecido apresenta srias limitaes. Pequenas flutuaes instrumentais inevitveis nos experimentos sucessivos de RMN de 13C causam variaes nas intensidades dos sinais, criando dificuldades bvias quando estes erros so das mesmas ordens que as diferenas de intensidades. Portanto, os enriquecimentos devem estar aproximadamente 0,5-1,0% em 13 C acima da abundncia natural para serem detectados pelo mtodo da diferena4. Experimento de RMN de 13C com desacoplamento descontnuo inverso (Inverse Gated Decoupling) utilizando-se altos intervalos de tempo entre as acumulaes capaz de contornar este problema. Nesta tcnica, o desacoplador ligado apenas durante a aquisio do sinal minimizando, assim, as variaes das intensidades dos sinais de 13C devido a efeitos NOE. Alm disso, os altos tempos entre as repeties das seqncias, estimados a partir dos tempos de relaxao (T1) dos carbonos da molcula, impedem a saturao dos sinais. Assim, as reas dos sinais nos espectros (obtidas por integrao direta) podem ser relacionadas quantitativamente com o teor de 13C. Este mtodo foi utilizado nos estudos biossintticos do terreinol6, um novo produto natural de Aspergillus terreus (Figura 2). Sua origem policetdica foi determinada atravs de experimentos de incorporao de D-glicose [1-13C], uma vez que a utilizao do acetato de sdio inibiu a produo do metablito de interesse inviabilizando os estudos de marcao isotpica com este precursor. A Figura 2 mostra o espectro obtido atravs do experimento com desacoplamento descontnuo inverso que revelou as posies enriquecidas a partir das integrais (Tabela 2). A origem biossinttica deste metablito foi interpretada luz dos mecanismos metablicos e das teorias biogenticas. De acorTabela 2. Dados de RMN de 13C do terreinol marcado com Dglicose [1-13C] Carbono 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 C 059,7 123,1 152,3 120,8 156,7 104,7 128,0 190,7 106,6 033,8 026,0 071,2 009,3 Integral (marcado) 1,2 2,3 1,3 2,3 1,2 2,3 0,9 2,6 1,1 2,4 1,1 2,3 1,5 Integral (no marcado) 1,1 1,1 1,2 1,4 1,2 1,3 1,0 1,4 1,4 1,2 1,2 1,3 1,3

Esquema 5. Incorporao de valina marcada na cefalosporina (I) e penicilina (II)

Apesar da existncia de vrias outras aplicaes bem sucedidas, a obteno dos valores de enriquecimentos isotpicos a partir da diferena entre as intensidades dos sinais no espectro de 13C

Figura 2. Espectro de RMN de 13C {1H} com desacoplamento descontnuo inverso do terreinol marcado (CD3OD; 125 MHz)

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do com a sequncia de etapas da via glicoltica, a clivagem oxidativa da glicose [1-13C] resultar em duas molculas de piruvato, sendo que apenas uma delas conserva uma posio enriquecida em 13C. A posterior condensao descarboxilativa entre o piruvato e a HSCoA formar a acetil-SCoA, em que a posio enriquecida est localizada no carbono 2 do grupo acetila, ou seja, na metila (Esquema 6). Portanto, a utilizao de glicose simplesmente marcada nas posies 1 ou 2 equivale, em termos de um padro de incorporao policetdico, ao acetato simplesmente marcado.

Esquema 6. Proposta de origem biossinttica do terreinol

A marcao de posies contguas 13 e 4 ajusta-se facilmente a um modelo biossinttico em que a metila aromtica inserida em uma cadeia policetdica via metilao mediada pela S-adenosilmetionina (SAM). A rota do carbono 1 da glicose marcada at a metila da SAM inicia-se a partir do desvio de um dos intermedirios da via glicoltica, o 3-fosfoglicerato, em direo sntese da serina, precursor clssico da metionina. O maior nmero de etapas envolvidas na formao da SAM, a partir do 3-fosfoglicerato em relao ao da rota deste ltimo at acetil-SCoA, explica o valor mais baixo de enriquecimento da metila em relao mdia das demais posies enriquecidas. Marcao dupla Como foi visto anteriormente, um composto com abundncia natural em 13C apresenta baixa probabilidade de dois tomos de 13C estarem adjacentes (0,01%) e assim, a observao dos sinais satlites resultantes do acoplamento escalar 13C-13C no espectro de RMN de 13C {1H} normalmente suprimida (Esquema 7a).

espectro do metablito enriquecido, caso a ligao em questo permanea intacta ao longo da rota biossinttica7 (Esquema 7b). Se, entretanto, a ligao quebrada, os carbonos originados do precursor marcado fornecero singletos aumentados4 (Esquema 7c). Portanto, a tcnica de marcao dupla com 13C apresenta maior sensibilidade, uma vez que pequenos satlites de 13C-13C acoplados podem ser detectados com mais preciso que os correspondentes enriquecimentos a partir de precursores simplesmente marcados. Em geral as magnitudes dos acoplamentos so suficientemente diferentes permitindo distinguir os pares de carbonos que se encontram acoplados. Deve ser enfatizado que o precursor marcado normalmente encontra-se altamente diludo na populao de acetato no marcado endgena, no se observando, portanto, acoplamentos JCC entre pares de carbonos contguos provenientes de diferentes unidades de acetato marcadas. Os seguintes exemplos ilustram a aplicao desta tcnica poderosa na deduo de processos biossintticos. Em um estudo8 para determinar a incorporao de acetato na estrutura da bicaverina (Esquema 8), a utilizao deste precursor duplamente enriquecido foi crucial uma vez que os baixos valores de enriquecimentos (<0,5%) inviabilizam o estudo com substncias marcadas em uma posio. O enriquecimento medido a partir das intensidades dos sinais satlites para cada posio foi de 0,4% e mostra o alcance deste procedimento em fornecer bons dados quantitativos em altas diluies. Todos os sinais no espectro de 13C da bicaverina marcada (com exceo para os grupos metoxilas que foram marcados a partir da metionina) foram acompanhados de enriquecimentos dos satlites. Portanto, o sistema de anis benzoxantona montado inteiramente por nove unidades intactas de acetato. O arranjo das unidades de acetato na bicaverina marcada consonante com a participao de uma cadeia policetdica de 18 carbonos com o padro a. O padro b, ou o envolvimento de um intermedirio simtrico tipo naftoquinona, excludo.

Esquema 8. Proposta de biossntese da bicaverina

Esquema 7. Efeito da incorporao de acetato marcado duplamente sobre o espectro de RMN de 13C

A introduo de precursores contendo unidades de 13C-13C aumenta as intensidades destes satlites e permite sua observao no

Estudos de marcao da aspirona, um metablito de Aspergillus melleus, forneceram o padro de incorporao, mostrado no Esquema 9, que sugeriu sua biossntese via uma clivagem do anel ou por rearranjo. A rota atravs do rearranjo mostrado foi amparada pela observao de um acoplamento 2JCC de 6,2 Hz entre C-2 e C-8 no espectro de RMN de 13C da aspirona enriquecida com acetato [1,213 C]. Esta foi a primeira observao de um acoplamento deste tipo em estudos biossintticos. Trabalhos mais recentes que levaram ao completo delineamento da biossntese da aspirona sero discutidos adiante. Muitas vezes o espectro de RMN de 13C {1H} de um metablito duplamente marcado apresenta padres complexos, devido sobreposio de sinais e ao rudo da linha de base. Nestes casos, a observao dos satlites 13C torna-se obscura e impossibilita o delineamento da biossntese em estudo. O experimento de RMN de 13C envolvendo a seqncia de

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pulsos INADEQUATE 2D9 tem sido extensivamente empregado10 para identificao de conectividades C-C contornando, assim, estas dificuldades.

de anel de um intermedirio cclico originado a partir de um pentacetdeo, como apresentado no Esquema 10.

Esquema 10. Proposta de biossntese da terrena

Esquema 9. Proposta de biossntese da aspirona

Neste experimento, o sinal intenso devido aos ncleos de 13C isolados eliminado atravs da alterao simultnea da fase do ltimo pulso de 90 e do detector, de modo a acompanhar apenas a pequena magnetizao correspondente ao sistema AX acoplado formado pelos pares de carbonos adjacentes 13C-13C. Este esquema resulta em dois padres de livre decaimento da induo (FID), cuja soma promove a eliminao do sinal indesejado. O INADEQUATE 2D quando aplicado a molculas com abundncia natural em 13C normalmente exige centenas de mg de amostra11 e o espectro obtido apresenta correlaes C-C contnuas, permitindo desenhar a estrutura de toda a cadeia carbnica. No entanto, quando molculas duplamente marcadas so empregadas, obtm-se espectros rapidamente com a utilizao de poucos mg de material. O espectro obtido, neste caso, apresenta apenas correlaes isoladas, correspondentes aos pares marcados 13C13 C de unidades incorporadas intactas. A Figura 3 mostra o espectro de INADEQUATE 2D da terrena marcada12 atravs de experimentos de incorporao de acetato [1,2. 13C] por culturas de Aspergillus terreus.

O INADEQUATE 2D foi crucial para a elucidao da biossntese da dioncofilina A, um alcalide de Triphyophyllum peltatum. Nestes estudos 13, foi estabelecida uma rota acetatopolimalonato para o esqueleto carbnico e consistiu na primeira observao deste caminho biossinttico para alcalides em plantas superiores. A anlise do espectro de INADEQUATE 2D da dioncofilina marcada com acetato [1,2- 13C] indicou que todo o esqueleto carbnico deriva do acetato e que ambas as metades da molcula apresentam um padro policetdico idntico (Esquema 11). Desta forma, a partir de seis unidades de acetato para cada metade, atravs de intermedirios -policarbonilados idnticos, tanto a parte naftalnica como a isoquinolnica do metablito so formadas por ciclizao. No caso da isoquinolnica, a ciclizao ocorre com incorporao do tomo de nitrognio. Finalmente, os dois fragmentos resultantes so unidos originando a dioncofilina A.

Esquema 11. Proposta de biossntese da dioncofilina A

Marcao mista A incorporao de uma mistura de precursores simplesmente marcados pode resultar na marcao de um metablito de forma que o acoplamento escalar 13C-13C seja observado. Esta informao til no delineamento de processos de condensao e ciclizao e sua obteno intensamente facilitada atravs de um estudo preliminar com precursores duplamente marcados. A tcnica de precursores mistos foi elegantemente empregada no estudo de atribuio dos sinais no espectro de 13C e demonstrou a origem biossinttica da brevetoxina B, uma potente neurotoxina produzida pelo dinoflagelado Gymnodinium breve14 (Esquema 12). A brevetoxina B biossintetizada a partir de acetato [1,2-13C] foi empregada para experimentos de RMN 2D (INADEQUATE) que levou ao esclarecimento das conectividades de 14 unidades de acetato utilizando-se apenas 1,5 mg de amostra. Experimentos adicionais envolvendo a utilizao de acetato [1-13C], [2-13C] e metionina [metila13 C] forneceram o padro de incorporao completo. Dos 50 tomos de carbono da brevetoxina B, 16 apresentaram

Figura 3. Espectro de INADEQUATE 2D da terrena marcada (CD3OD; 125 MHz)

Resultados de incorporao similares permitiram uma proposta biossinttica para a terrena, envolvendo uma etapa de contrao

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enriquecimento a partir de acetato [1-13C]; 30 de acetato [2-13C] e quatro a partir de metionina [metila-13C].

Esquema 13. Efeito da incorporao de 2H e 18O no deslocamento qumico do 13C Esquema 12. Incorporao de precursores marcados na brevetoxina

Mais recentemente, estas tcnicas de marcao foram empregadas na elucidao das rotas de vrios outros metablitos policetdicos complexos de dinoflagelados15. MARCAO COM 2H E 18O No final dos anos 80, iniciou-se uma nova revoluo em estudos biossintticos na medida em que os pesquisadores desenvolveram mtodos de identificar, purificar e manipular geneticamente enzimas individuais. Paralelamente, na rea da espectroscopia de RMN, outro grande avano ocorreu com o desenvolvimento de gradientes de campo e a implementao de estudos16 envolvendo precursores marcados com 2H e 18O4. A RMN de 2H tem sido empregada em muitas investigaes biossintticas, apesar de apresentar muitas desvantagens inerentes. Por constituir um ncleo com momento magntico quadrupolar, o 2 H (I = 1) apresenta linhas espectrais largas e isto, combinado com sua baixa constante magnetogrica (0,151H) e a estreita faixa de valores de deslocamentos qumicos, freqentemente resulta em espectros pouco resolvidos. Entretanto, em conseqncia da baixa abundncia natural do 2H (0,012%), so toleradas diluies muito acima daquelas permitidas em estudos com 13C. Isto torna a marcao com 2H particularmente til para se estudar a incorporao de intermedirios avanados em uma rota biossinttica. A falta de resoluo inerente da RMN de 2H pode ser superada pela anlise dos efeitos isotpicos provocados nos deslocamentos qumicos dos sinais de RMN de 13C. A utilizao do 13C como um ncleo delator tanto de hidrognio como de oxignio representa um dos maiores avanos em estudos biossintticos. Este mtodo consiste na observao da mudana no deslocamento qumico do 13C provocada pela substituio de um hidrognio ou por deutrio. Similarmente, a presena de 18O a um tomo de 13C pode ser detectada pelo deslocamento induzido no espectro de RMN de 13C4. O efeito de um tomo de deutrio diretamente ligado a um ncleo de 13 C sobre o espectro de RMN de 13 C consiste no surgimento de multipletos mais blindados em relao ao sinal normal (Esquema 13a). A presena de cada deutrio desloca a freqncia do sinal em 0,3 a 0,6 ppm e o acoplamento 1JCD produz o multipleto caracterstico4. Sinais deslocados originados de carbonos sem hidrognios diretamente ligados apresentam razes sinal/rudo reduzidas, devido pouca relaxao e ausncia de NOE. Esta uma desvantagem do mtodo, que ampliada ainda mais pela distribuio da intensidade entre os picos do multipleto. O desacoplamento de deutrio pode auxiliar nesta questo atravs da remoo do acoplamento 2H-13C.

Muitas das desvantagens associadas ligao direta do deutrio so evitadas com o posicionamento deste tomo a duas ligaes do ncleo de 13C relacionado (Esquema 13b). Uma vez que as constantes de acoplamentos geminais carbono-deutrio so muito pequenas, os sinais deslocados apresentam-se efetivamente como singletos, mesmo sem a aplicao de desacoplamento de deutrio. Isto resulta em um aumento da razo sinal/rudo quando comparado ao experimento de deslocamento correspondente4. Como mencionado anteriormente, a incorporao biossinttica de 18O tambm pode ser detectada pela observao do deslocamento isotpico induzido no espectro de RMN de 13C. O 18O pode ser convenientemente introduzido atravs de um precursor duplamente marcado (Esquema 13c) ou pelo crescimento sob atmosfera de 18 O2 (Esquema 13d). Os deslocamentos resultantes so da mesma magnitude dos deslocamentos isotpicos promovidos por -2H, ou seja, aproximadamente 0,05 ppm e somente se tornam observveis em espectrmetros de altos campos4. O desenvolvimento de experimentos de marcao com 18O e 2H conduziram a uma reavaliao da formao da aspirona. Estudos envolvendo a incorporao de acetato [1-13C, 18O] e 18O2 gasoso revelaram, surpreendentemente, que nenhum dos oxignios derivou do acetato, sendo trs provenientes da atmosfera e um do meio de cultura17. Estes resultados foram subseqentemente verificados em um dos poucos relatos18 de aplicaes de marcao com 17O e RMN de 17O em estudos biossintticos. O ncleo de 17O (spin 5/2) pouco sensvel e fornece linhas largas, devido relaxao quadrupolar4. A incorporao de acetato [2-13C, 2H3] na aspirona mostrou a reteno de dois hidrognios derivados do acetato em C-7, sugerindo que este carbono poderia ter participado de uma ligao olefnica em algum ponto ao longo da rota biossinttica. Para acomodar estes resultados, foi proposto um caminho envolvendo rearranjo mediado por epxido e reaes de fechamento de anel. Posteriormente, foi realizada uma srie de experimentos19 de incorporaes com os supostos intermedirios da construo da cadeia, marcados tanto com 2H como com 13C, que foram sintetizados na forma de seus tiosteres N-acetilcisteamina (NAC). Estes experimentos resultaram no completo delineamento da rota de montagem catalisada pela policetdio sintase e se mantm como o mais completo e bem sucedido estudo deste tipo. A incorporao de intermedirios -hidroxitiosteres, ou seja, o tioster NAC correspondente a V, estabeleceu que o processo de cetorreduo ocorre com a mesma estereoqumica absoluta que a biossntese de cidos graxos. Deste fato surgiu a proposta de que a policetdio sintase envolvida na biossntese da aspirona poderia ser derivada da cido graxo sintase que, presumivelmente, teria perdido sua capacidade de efetuar redues de enoila. Foi mostrado

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que as desidrataes ocorrem por uma eliminao sin. O produto final hexacetdeo VI do processo de montagem policetdica seria ento convertido na aspirona pela seqncia mostrada no Esquema 14, que inclui um rearranjo de epxido4.

responsvel pela produo dos cidos iniciadores da policetdio sintase (PCS), foram obtidas vrias outras avermectinas. A administrao dos cidos iniciadores naturais a este mutante restabeleceu a produo das avermectinas naturais, enquanto que a administrao de 40 cidos iniciadores no naturais levou a muitos novos anlogos das avermectinas modificados na posio C-25. A doramectina, um antiparasitrio extremamente efetivo comercializado como Dectomax, foi isolada aps administrao do cido cicloexilmetanico (Esquema 15). O tioster NAC XIII do intermedirio biossinttico dicetdico tambm foi incorporado 23 na doramectina atravs da linhagem mutante. Este consiste em um dos primeiros exemplos da incorporao de um anlogo de um precursor natural ligado PCS4.

Esquema 14. Biossntese da aspirona

Muito do atual estgio de entendimento da formao de metablitos policetdicos se deve a estudos usando tiosteres Nacetilcisteamina de intermedirios avanados, marcados em conjuno anlise detalhada de espectroscopia de RMN de metablitos enriquecidos. Os tiosteres N-acetilcisteamina so empregados porque mimetizam estruturalmente a terminao tiol do grupo fosfopanteteina encontrado na coenzima A4. Esta abordagem foi aplicada a vrios problemas biossintticos, dentre os quais se destacam os estudos envolvendo as avermectinas, uma famlia de produtos naturais20 produzida por Streptomyces avermitilis constituda por oito estruturas pentacclicas (Figura 4) contendo um anel macroldio de 16 membros.

Esquema 15. Incorporao de tiosteres NAC de intermedirios na doramectina

Certas estruturas cclicas presentes em alguns policetdios ocorrem via reao de Diels-Alder intramolecular e consistem em uma das primeiras evidncias da existncia de enzimas do tipo dielsalderase. Este processo foi proposto para vrios metablitos dentre os quais a nargencina A um dos mais profundamente estudados (Esquema 16).

Esquema 16. Etapa de cicloadio na biossntese da nargencina A

Figura 4. Estrutura das avermectinas

Estudos envolvendo administrao de tiosteres NAC marcados com 13C a culturas de Nocardia argentinensis demonstraram incorporaes regioespecficas na nargencina, que so consistentes com uma ciclizao intramolecular Diels-Alder de um intermedirio nonacetdico linear24. Recentemente, foi caracterizada a estrutura cristalina da primeira diels-alderase natural25. RMN DE OUTROS NCLEOS Embora este artigo se concentre nos desenvolvimentos da RMN envolvendo a deteco de 13C, estudos biossintticos baseados na observao de outros ncleos, tais como 15N, 19F, 2H, 3H, tm fornecido informaes importantes sobre mecanismos e estereosseletividades das reaes enzimticas26. Algumas destas aplicaes, envolvendo inovaes espectroscopicamente importantes, foram includas e sero exemplificadas a seguir. O ncleo de 15N apresenta spin 1/2, abundncia natural de 0,36% e baixa constante magnetogrica (0,101H). Embora a observao direta do 15N por espectroscopia de RMN seja possvel, a maioria

Estes oito compostos diferem estruturalmente devido variao de unidade iniciadora da policetdio sintase em C-25, ao padro de O-metilao em C-5 e ao padro de hidratao-desidratao em C-22/C-23. As avermectinas naturais e sintticas exibem uma potente atividade antiparasitria. Estudos de marcao21 mostraram que a aglicona da avermectina deriva de sete unidades de acetato e cinco de propionato. As unidades iniciadoras da policetdio sintase, isobutirato e 2-metilbutirato, derivam do catabolismo da L-valina e da L-isoleucina, respectivamente. Todos os tomos de oxignio, excluindo-se aqueles ligados a C-6 e C-25, so derivados dos seus precursores carboxilados. Atravs da utilizao de um mutante 22 da Streptomyces avermitilis, que apresenta carncia da atividade de descarboxilase

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Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de 13C

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dos estudos biossintticos tem detectado a incorporao de 15N atravs do seu acoplamento ao 13C via RMN de 13C unidimensional (1D). Entretanto, muitas vezes os fracos sinais satlites resultantes do acoplamento heteronuclear 15N-13C permanecem escondidos no rudo da linha de base. Recentemente, foi desenvolvido um novo mtodo27 para observao do acoplamento entre unidades 13C-15N, baseado em uma modificao do experimento de HMBC. Esta abordagem foi aplicada na elucidao da origem do anel tiazol da barbamida28, um metablito isolado de uma cianobactria marinha (Esquema 17).

Esquema 18. Transformaes em clulas de R. serpentina monitoradas in vivo por RMN de 1H

CONCLUSES Dentre as tcnicas de determinao de rotas biossintticas de produtos naturais, a RMN de 13C aliada marcao isotpica apresenta um papel de destaque. Paralelamente ao aumento da complexidade das estruturas dos compostos isolados, novos avanos instrumentais e seqncias de pulsos foram incorporados em uma evoluo sinergstica entre a RMN de 13C e nossa compreenso sobre os princpios biossintticos e os mecanismos de ao das enzimas. Novas perspectivas de investigaes biossintticas tm sido criadas como resultado de avanos instrumentais, como o aumento dos valores de campos magnticos dos espectrmetros, e desenvolvimentos de sondas ainda mais sensveis, permitindo, por ex., o monitoramento de transformaes de metablitos secundrios in vivo sem a necessidade de marcao isotpica. AGRADECIMENTOS O autor agradece profundamente Profa. A. J. Marsaioli (IQ UNICAMP) pelas discusses valiosas e pelo seu entusiasmo contagiante pela cincia natural. REFERNCIAS
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Esquema 17. Incorporao de [2-13C-15N] glicina na barbamida

Os autores esperavam detectar a incorporao da [2-13C-15N] glicina, precursor metablico da cistena no anel tiazlico do produto natural. Neste caso, foi observado que os hidrognios ligados ao 13 C se desdobraram em um dupleto de cerca de 180 Hz, devido ao acoplamento 1JCH (Figura 5). No espectro de H,N-HMBC este dupleto apresentou uma correlao com o deslocamento qumico do nitrognio, confirmando a incorporao da glicina duplamente marcada.

Figura 5. Representao esquemtica dos padres de acoplamentos esperados para o experimento H,N-HMBC

Novas perspectivas de investigaes biossintticas tm sido criadas como resultado de avanos instrumentais, como o aumento dos valores de campos magnticos gerados nos espectrmetros. Recentemente, tais progressos permitiram o monitoramento da transformao de compostos indlicos in vivo, sem a necessidade de marcao isotpica atravs de uma elegante combinao de experimentos de 1H de 1D e H,C-HSQC a 800 MHz29. Neste estudo, os autores utilizaram a RMN de 1H na sua verso unidimensional para acompanhar reaes rpidas, como a reduo da isatina e da velosimina (Esquema 18), por culturas de clulas de Rauvolfia serpentina, uma planta medicinal indiana. A sensibilidade do mtodo permitiu a obteno de espectros unidimensionais suficientemente resolvidos a cada 2 min. Esta transformao rpida foi seguida por um processo muito mais lento, consistindo na glicosilao do dioxindol e da hidroxilao do velosimol. Estas reaes lentas foram monitoradas por experimentos de H,C-HSQC e demonstraram a seqncia das etapas finais envolvidas na sntese de alcalide da classe sarpagina nesta planta.

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Macedo Jr.

Quim. Nova

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