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1. Metabolismo de Fixao de CO2 1.

1 Generalidades O tecido fotossinttico mais ativo em plantas superiores chama-se mesfilo e faz parte das folhas. O cloroplasto uma organela celular responsvel pela fotossntese. composto por um sistema bem organizado de membranas denominadas de tilacides. As clorofilas esto contidas nesse sistema de membranas, o que fornece a colorao verde ao cloroplasto. Os tilacides, quando esto associados entre si, formam pilhas na forma de moedas conhecidas como grana, sendo que cada pilha denominada granum. Estas pilhas ficam apoiadas nas lamelas. Todo esse conjunto de membranas encontra-se mergulhado em um fludo gelatinoso que preenche o cloroplasto, chamado de estroma, onde h enzimas, DNA, pequenos ribossomos e amido. Ao centro das membranas dos tilacides encontra-se o lmen. As molculas de clorofila e carotenides encontradas nas membranas dos tilacides reunem-se em grupos formando estruturas chamadas de "complexos de antena" ou "antena". ainda na membrana do tilacide que se encontram as molculas responsveis pelo transporte de eltrons: cadeia transportadora de eltrons. 1.2 Histrico Na dcada de 1920, postulou-se que a energia da luz transferida para o CO2 e que o CO2, ativada desta forma, reage com gua para formar os carboidratos, acompanhada pela liberao de oxignio. De acordo com este hiptese, o oxignio liberado pela fotossntese era derivado do CO2. Em 1937, Robert Hill, mostrou que realmente um redutor formado no curso da fotossntese. Ele foi o primeiro a ter sucesso em isolar cloroplastos com alguma atividade fotossinttica. Quando esses cloroplastos foram iluminados na presena de compostos frricos (Fe3+), o oxignio foi liberado acompanhado por reduo do Fe3+ para Fe2+.

Desde CO2 no estava envolvido na reao descrita por Hill, esta experincia provou que a diviso fotoqumica da gua pode ser separada da reduo do CO2. A reao total fotossinttica de assimilao de CO2 pode ser dividida em duas reaes parciais: 1. A chamada reao da fase clara, em que a gua dividida pela energia do fton para fornecimento do poder redutor (na forma de NADPH) e energia qumica (na forma de ATP), e 2. A chamada reao da fase escura, no qual o CO2 assimilado na custa deste poder redutor e ATP. A reao de assimilao de CO2 ser o ponto central deste captulo.

1.3 Gerao do poder redutor e de energia para promover a assimilao do CO2 Na membrana interna dos cloroplastos esto os fotossistemas com vrias molculas de clorofila dispostas de maneira a formar uma espcie de antena com a finalidade de captar luz. Os fotossistemas so de dois tipos: * Fotossistema I - p700: o responsvel pela produo de NADPH. O fotossistema I recebe eltrons provenientes de toda a cadeia transportadora de eltrons. Esse fotosistema absorve luz no comprimento de 700 nanmetros e tambm chamado de transporte cclico de eltrons. * Fotossistema II - p680: Nesse fotossistema ocorre a quebra da gua, tambm chamada de fotlise da gua, ou ainda, reao de Hill. Cada molcula de gua produz dois prtons H+ e dois eltrons no excitados que so direcionados para o centro de reao do fotossistema e posteriormente encaminhado ao fotossistema I para reduo do NADP. Neste transporte acclico, os eltrons da gua "empurrados morro acima" at o NADP, por meio do esforo combinado dos ftons absorvidos por cada um dos fotossistemas (FSI e FSII), constituem-se na maior parte do chamado esquema Z. De qualquer forma, tanto o transporte cclico quanto o acclico de eltrons, geram entre ambas as superfcies da membrana tilacide um gradiente de prtons que descarregado por meio da atividade de uma ATP sintase levando a formao de ATP a partir de ADP e fsforo inorgnico.

O transporte de eltrons entre FS II e o complexo citocromo-b/f mediada por plastohidroquinona (PQH2) e entre o complexo citocromo-b/f e FS I por plastocianina (PC). A diviso do gua ocorre no lado luminal da membrana, e a formao de NADPH e ATP ocorre no lado do estroma. O gradiente eletroqumico de prtons bombeados para o lmen controla a sntese de ATP. Conforme visto at agora, a fotossntese pode ser descrita como um processo no qual a energia luminosa absorvida pela clorofila origina o transporte de eltrons (converso da energia luminosa em energia eltrica), o qual por sua vez gera energia

qumica, esta acumulada nas molculas de ATP e NADPH2 - poder assimilatrio ou poder redutor. Este por sua vez utilizado nas etapas seguintes da fotossntese, representada pela assimilao do carbono ("reaes bioqumicas do escuro "ou" reaes do escuro"), ligando o CO2 em um aceptor, reduzindo-o assim a CH2O. 1.5 Assimilao de CO2 Quando cloroplastos so adicionados a um meio isotnico contendo um tampo, bicarbonato e fosfato inorgnico, e a luz est incidindo observa-se a produo de oxignio. A gua dividida em oxignio pela reao de luz descrita anteriormente, e os resultantes equivalentes (NADPH e ATP) so usados para assimilao de CO2. Com intactos cloroplastos, no h liberao de oxignio, na ausncia de CO2 ou fosfato, demonstrando que a reao de luz nos cloroplastos intactos est acoplada a assimilao de CO2. O produto principal de assimilao dos cloroplastos a dihidroxiacetona fosfato, uma triose fosfato. A sntese de triose fosfato do CO2 requer energia na forma de ATP e equivalentes redutores na forma de NADPH, que foram fornecidas na reao clara da fotossntese. A reao em cadeia para a formao da triose fosfato de CO2 foi chamado anteriormente de reao escura da fotossntese, pois no requer luz, por si s e, teoricamente, tambm deve ser capaz de continuar no escuro. O fato , no entanto, que em folhas esta reao no proceder durante a escurido, j que algumas das enzimas da reao em cadeia, devido a processos de regulao, so ativos apenas durante o perodo de iluminao. Estudo realizado por Calin na dcada de 1950 revelaram que a fixao de CO2 se d por um processo cclico, que tem sido chamado ciclo de Calvin. A via da pentose fosfato redutora outro termo que ser usado em alguns trechos deste ensaio. Este nome deriva do fato de que a reduo ocorre e pentoses so formadas no ciclo. 1.6 Ciclo de Calvin O ciclo de Calvin pode ser subdividido em trs sees: 1. A carboxilao do C5 do acar ribulose 1,5 bisfosfato, levando formao de duas molculas de 3-fosfoglicerato; 2. A reduo do 3-fosfoglicerato para triose fosfato e 3. A regenerao da ribulose 1,5 bisfosfato (aceptor de CO2 a partir triose fosfato). 1.6.1 Ribulose-difosfato-carboxilase/oxigenase catalisa a fixao de CO2 A reao fundamental para a assimilao fotossinttica de CO2 a ligao do CO2 atmosfrico ao aceptor ribulose 1,5-bifosfato (RuBP) para formar duas molculas de 3-fosfoglicerato. A reao muito exergnica e, portanto, praticamente irreversvel. catalisada pela enzima ribulose bisfosfato carboxilase / oxigenase (abreviado Rubisco), assim chamada porque a mesma enzima tambm catalisa uma reao com O2. Na reao de oxigenase, O2 reage de uma maneira similar como CO2. Os produtos finais da reao de oxigenase so 2-fosfoglicolato e 3-fosfoglicerato. Embora a concentrao de CO2 necessria para saturao da enzima (Km [CO2]) seja muito menor do que a de O2 (Km [O2]), a velocidade da reao de oxigenase muito alta, j que a concentrao de O2 no ar equivale a 21% e a de CO2 de apenas 0,035%. A catlise da carboxilao de RuBP por rubisco muito lento. Isso significa que, apenas cerca de trs molculas de CO2 e RuBP so convertidos por segundo em um stio cataltico da rubisco. Devido ao nmero

extremamente baixo de atividade de rubisco, grandes quantidades de enzimas so necessrias para catalisar os fluxos necessrios para a fotossntese. A rubisco pode representar 50% do total de protenas solveis nas folhas. A Rubisco a nica enzima que permite a fixao do CO2 atmosfrico para a formao de biomassa. Este enzima , portanto, um pr-requisito para a existncia de vida presente na terra.

A rubisco formada por 08 subunidades maiores e 08 subunidades menores. Todas as subunidades maiores de rubisco contem uma lisina. A rubisco est ativa somente quando o grupo amino lateral da lisina reage com o CO2 para formar um carbamato, ao qual um on MG++ est ligado. A ativao devido a uma mudana na conformao da protena. A conformao ativa estabilizada pela formao do complexo com o MG++. Esta carbamilao um pr-requisito para a atividade da rubisco. Note-se que o CO2 ligado como carbamato diferente do CO2 que um substrato da reao de carboxilao da rubisco. A ativao da rubisco requer ATP e

catalisada pela enzima rubisco ativase. A forma, inativa da rubisco liga RuBP muito firmemente, resultando em um bloqueio da enzima. Sobre o consumo de ATP, a ativase libera o RuBP fortemente vinculado e, portanto, permite a carbamilizao da enzima livre.

A rubisco inibida por vrios hexose fosfato e 3-fosfoglicerato, que se ligam ao stio ativo em vez de RuBP. Um inibidor muito forte 2-carboxiarabinitol 1-fosfato (CA1P). Esta substncia tem uma estrutura muito semelhante ao de 2-carboxi-3 ketoarabinitol 1,5 -bisfosfato, que um intermedirio da reao carboxilao. CA1P tem uma afinidade 1000 vezes maior do que RuBP para o stio de ligao da rubisco. Em um nmero de espcies, CA1P se acumula nas folhas durante a noite, e bloqueia um grande nmero de stios de ligao da rubisco e, portanto, inativa a enzima. Durante o dia, CA1P removido pela rubisco ativase e degradada por uma fosfatase especfica, que hidrolisa o resduo de fosfato de CA1P e, portanto, elimina o efeito inibidor sobre rubisco. 1.6.2 A reduo de 3-fosfoglicerato Para a sntese de dihidroxiacetona fosfato, o produto da carboxilao, 3fosfoglicerato fosforilada a 1,3-bisfosfoglicerato pela enzima fosfoglicerato quinase com o consumo de ATP.

A reduo de 1,3-bisfosfoglicerato a gliceraldedo-3-fosfato catalisada pela enzima gliceraldedo fosfato desidrogenase. Um gliceraldedo fosfato desidrogenase no citosol catalisa a converso de gliceraldedo fosfato em 1,3-bisfosfoglicerato. Em contraste com a enzima citoslica, que principalmente catalisa a oxidao de gliceraldedo fosfato com NAD + como aceptor de hidrognio, a enzima cloroplasto usa NADPH como um doador de hidrognio. Este um exemplo dos diferentes papis que o NADH / NAD + e NADPH / NADP + desempenham no metabolismo das clulas eucariticas. Considerando que o sistema NADH especializada na coleta de equivalentes redutores a ser oxidado para a sntese de ATP, o sistema NADPH principalmente rene equivalentes redutores para

serem doados a processos sintticos. Normalmente, a relao reduzida / oxidada cerca de 100 vezes maior para o sistema NADPH do que para o sistema de NADH. O grau relativamente elevado de reduo do sistema NADPH nos cloroplastos permite a reduo muito eficiente de 1,3-bisfosfoglicerato para gliceraldedo-3-fosfato. Triose fosfato isomerase catalisa a isomerizao de gliceraldedo fosfato para dihidroxiacetona fosfato. Esta um converso de uma aldose para uma cetose. O equilbrio da reao fica para a cetona. 1.6.3 Regenerao de ribulose 1-5 difosfato Da fixao de trs molculas de CO2 no ciclo de Calvin, seis molculas de 3fosfoglicerato so formadas e so convertidas em seis molculas de triose fosfato. Destes, apenas uma molcula de triose fosfato o ganho real, que fornecido para a clula para vrios processos biossintticos. Os restantes das cinco trioses fosfatos so necessrios para se regenerar trs molculas de ribulose 1-5-bifosfato para que o ciclo de Calvin possa continuar.

As duas trioses fosfato, dihidroxiacetona fosfato e gliceraldedo fosfato so condensados em uma reao reversvel formando frutose 1,6-bifosfato, catalisada pela enzima aldolase. A enzima transcetolase transfere um resduo de carboidrato com dois tomos de carbono a partir de frutose-6-fosfato para o gliceraldedo 3-fosfato, gerando Xilulose 5-fosfato e eritrose 4-fosfato em reao uma reversvel. Nesta reao, tiamina pirofosfato, est envolvido como o grupo prosttico. Aldolase mais uma vez catalisa a condensao, desta vez de eritrose 4-fosfato com dihidroxiacetona fosfato para formar sedoheptulose 1,7-bisfosfato. Posteriormente, a enzima 1,7-bisfosfatase sedoheptulose catalisa a hidrlise irreversvel da sedoheptulose 1,7-bisfosfato. Esta reao similar hidrlise da frutose 1,6-bifosfato, embora as duas reaes sejam catalisadas por diferentes enzimas. Mais uma vez, um resduo de carboidrato com dois tomos de C transferido pela transcetolase da sedoheptulose 7-fosfato para dihidroxiacetona fosfato e este forma a ribose 5-fosfato e Xilulose 5-fosfato. As trs pentoses fosfatos formadas so agora convertidos em ribulose 5 fosfato. A converso de Xilulose 5-fosfato catalisada por epimerase ribulose fosfato. A converso

da aldose ribose 5-fosfato para a cetose ribulose 5-fosfato catalisada por ribose fosfato isomerase. As trs molculas de ribulose 5-fosfato formadas dessa maneira so convertidos para o aceptor de CO2, ribulose 1,5-bisfosfato sobre consumo de ATP pela ribulose-fosfato quinase. Esta reao irreversvel.

O esquema na figura apresenta um resumo das vrias reaes do ciclo de Calvin. Existem quatro passos irreversveis no ciclo, marcado pela setas em negrito: A carboxilao, a hidrlise da frutose bifosfato, hidrlise de bifosfato sedoheptulose e fosforilao de ribulose 5-fosfato. Assim, a fixao de uma molcula de CO2 exige um total de duas molculas de NADPH e trs molculas de ATP.

1.7 Via oxidativa da Rubisco Os cloroplastos tambm contm as enzimas de uma via oxidativa de pentose fosfato. Esta via, que ocorre em ambos os reinos vegetal e animal, oxida uma hexose fosfato a uma pentose fosfato com a liberao de uma molcula de CO2. Esta via fornece NADPH para processos biossintticos. Glicose 6-fosfato oxidado pela glicose 6-fosfato desidrogenase a 6fosfogluconolactona. Esta reao altamente exergnica e, portanto, no reversvel. 6fosfogluconolactona hidrolisado por lactonase. O gluconato-6-fosfato, assim, formado oxidado pelo enzima gluconato 6-fosfato desidrogenase a ribulose 5-fosfato. Nesta reao, o CO2 liberado e NADPH formado. Na via oxidativa, Xilulose 5-fosfato formada a partir ribulose 5-fosfato pela ribulose fosfato epimerase e de ribose 5-fosfato por ribose-fosfato isomerase. Estes dois produtos so ento convertidos pela transcetolase a sedoheptulose 7-fosfato e gliceraldedo 3-fosfato. Esta seqncia de reao uma inverso da via pentose fosfato redutora. A seqncia de reao ainda um recurso especial da via oxidativa: transaldolases transfere um resduo C3 no fosforilado de sedoheptulose 7-fosfato para gliceraldedo 3-fosfato, formando frutose-6-fosfato e eritrose 4-fosfato. Eritrose 4fosfato reage com mais Xilulose 5-fosfato via transcetolase para formar gliceraldedo 3fosfato e frutose 6-fosfato. Desta forma dois hexose fosfatos e um triose fosfato so formadas por trs pentose fosfatos. Na via oxidativa, duas molculas de NADPH so obtidos a partir da oxidao da glicose 6-fosfato com a liberao de uma molcula de CO2, enquanto que na via redutora a fixao de uma molcula de CO2 exige no apenas duas molculas de NADPH, mas tambm trs molculas de ATP.

1.8 Regulao das vias oxidativa e redutora da pentose fosfato As enzimas da via redutora, bem como da via oxidativo da pentose fosfato esto localizados no estroma do cloroplasto. O simultneo funcionamento de ambas as vias metablicas, em que uma molcula de CO2 reduzida a um resduo de carboidratos custa de trs ATP e dois NADPH, que seria ento reoxidadas pela via oxidativa, produzindo duas molculas de NADPH e um CO2, representaria um ciclo ftil em que trs molculas de ATP so desperdiados em cada volta. Este impedido por regulao metablica, que garante que as enzimas-chaves da via pentose fosfato redutora sejam ativas apenas durante iluminao e desligado no escuro, enquanto que a enzimas-chaves da via pentose fosfato oxidativa seja ativa somente no escuro. Um sinal importante para o estado de ativao na fase de clara fornecida pelo transporte de eltrons como equivalentes redutores na forma de tioredoxina reduzida. Esses equivalentes redutores so transferidos da ferredoxina para tioredoxina pela enzima ferredoxina-tioredoxina redutase. Tioredoxinas formam uma famlia de pequenas protenas, de cerca de 100 aminocidos, que contm como um grupo reativo a seqncia Cys-Gly-Pro-Cys, localizado na periferia da protena. Devido grupos de cistena vizinhas, a tioredoxina pode estar presente em dois estados redox: o reduzido com dois SH-grupos e o oxidado em que o duas cistenas esto ligados por uma ponte de dissulfeto (SS). Eles funcionam como protena de dissulfeto oxido-redutases, reduzindo pontes dissulfeto em protenas-alvo. O envolvimento de tioredoxina na fase clara da fotossintese pela regulao das enzimas do cloroplasto pode ser encarado como uma funo especial para alm das suas funes metablicas em geral. No cloroplasto, as enzimas ribulose fosfato quinase, sedoheptulose 1,7bisfosfatase e a frutose 1,6-bisfosfatase so convertidas de um estado inativo para um estado ativo por tioredoxina reduzida e so, portanto, ativado por luz. Por outro lado, tioredoxina reduzida inativa glicose 6-fosfato desidrogenase, a primeira enzima da via oxidativa das pentoses fosfato. Um adicional regulao pela luz do ciclo de Calvin baseado no efeito da concentraes do prton e Mg++ no estroma sobre a atividade de enzimas do cloroplasto. Quando cloroplastos isolados so iluminados, a acidificao do espao tilacide acompanhado por uma alcalinizao e um aumento na concentrao de Mg++ no estroma. A fixao de CO2 por cloroplastos isolados mostra um ideal a cerca de pH 8,0,

com um declnio acentuado em direo faixa cida. Uma dependncia pH quase idntica encontrada com a luz ativando as enzimas frutose 1,6-bisfosfatase e sedoheptulose 1,7 bisfosfatase. As atividades de vrias enzimas do estroma tambm so regulados por nveis de metablitos. A frutose 1,6-bisfosfatase e sedoheptulose 1,7 - bisfosfatase so inibidas por seus produtos correspondentes, frutose 6-fosfato e sedoheptulose 7-fosfato, respectivamente. Isso pode diminuir a atividade dessas enzimas quando seus produtos se acumulam. A ribulose fosfato quinase inibida por 3-fosfoglicerato e tambm pela ADP. A inibio pelo ADP importante para a coordenao das duas reaes quinase do via redutora das pentoses fosfato. Considerando que a ribulose fosfato quinase catalisa uma reao irreversvel, a reao da fosfoglicerato quinase reversvel. Se ambas as reaes foram competir por ATP em uma forma irrestrita, no caso de uma escassez de ATP, as fosforilao irreversveis de ribulose 5-fosfato teram uma vantagem, resultando em um desequilbrio do ciclo de Calvin. A diminuio da atividade da ribulose fosfato quinase em um nvel elevado de ADP pode impedir isso. Finalmente, observa-se uma forte inibio de frutose 1,6bisfosfatase e de 1,7 sedoheptulose bisfosfatase por glicerato. O glicerato um intermedirio na reciclagem de fosfoglicolato formado pela atividade oxigenase da rubisco. Esta inibio permite a acumulao de glicerato para retardar a regenerao da RuBP e sua carboxilao. Alm disso, rubisco objeto de regulao. Experimentos com as folhas inteiras demonstraram que o grau de ativao de rubisco correlaciona com a intensidade da iluminao e da taxa de fotossntese. A ativao de rubisco comandado atravs de uma regulao do Rubisco ativase. Rubisco-ativase ativado por tioredoxina reduzida e tambm dependente da relao ATP/ADP. Quando h aumento da relao ATP/ADP no estroma, a atividade do ativase tambm sobe. especulado que esta a forma como a atividade de rubisco ajustado para o fornecimento de ATP pela reao de luz da fotossntese. No entanto, muitas observaes sugerem que isto no pode ser o nico mecanismo de regulao pela luz da rubisco. Tem sido sugerido que rubisco ativase regulada por um gradiente de prtons dependente da luz atravs da membrana tilacide. Alm disso, a atividade de rubisco inibida pelo prprio produto 3-fosfoglicerato. Desta forma, a atividade de rubisco poderia ser diminudo quando seu produto se acumula. Figura 6.27 mostra um esquema dos diversos fatores que influenciam a regulao das enzimas das vias pentose redutora e oxidante. Um abundncia de processos de regulamentao garante que as vrias etapas de ambos cadeias de reao sejam ajustadas umas s outras e demanda da clula.

1.8 Formas de fixao de CO2 pelas plantas H trs tipos de assimilao fotossinttica de CO2 pelas plantas clorofiladas, segundo as quais estas so classificadas em plantas C3, C4 e CAM. 1.8.1 Plantas C3 (Ciclo Calvin) A denominao C3 advm do fato da maioria das plantas verdes formar primeiro um produto estvel da cadeia bioqumica da fotossntese, 3-fosfoglicerato, uma molcula com trs carbonos. De forma bastante simplificada, a fotossntese C3 envolve a adio de uma molcula de CO2 - reao de carboxilao - em uma molcula aceptora constituda de cinco carbonos e dois tomos de fsforo, a ribulose 1,5 difosfato (RUDP). Rubisco (ou seja, ribulose 1,5 difosfato carboxilase-oxigenase), a enzima responsvel pela carboxilao no ciclo de Calvin. A RUDP sofre uma srie de mudanas envolvendo gasto de NADPH e ATP - reaes de reduo - originando no final do processo a glicose. Ao mesmo tempo, atravs de reaes de regenerao, novas molculas de RUDP so formadas, garantindo a continuidade da fixao do carbono. Nas plantas C3, a taxa de liberao de CO2 na presena de luz maior do que no escuro. Este aumento na produo de CO2 (no respiratrio) decorre do fato da Rubisco desempenhar alm da funo de carboxilao, tambm uma funo da oxigenao. A funo carboxilase favorecida por teores elevados de CO2; temperaturas e intensidades luminosas moderadas. J a funo oxigenase, favorecida por temperaturas e intensidade luminosas elevadas. 1.8.2 Plantas C4 As plantas C4 so assim chamadas por formarem como primeiro produto da fotossntese o cido oxalactico (4C), o qual rapidamente reduzido a cido mlico e

cido asprtico, ambos com 4C, porm mais estveis. Estruturalmente, outra diferena entre as plantas C3 e C4 a presena nestas ltimas de uma camada proeminente de clulas clorofiladas envolvendo os feixes condutores da folha ("anatomia Kranz"). Nestas plantas, alm da presena da Rubisco, confinada s clulas da bainha Kranz, encontrada nas clulas do mesfilo foliar a fosfoenolpirvico carboxilase, uma enzima com afinidade muito maior pelo CO2 do que a primeira. A compartimentao espacial das duas enzimas faz com que o CO2 fixado pela fosfoenolpirvico carboxilase se transloque, via malato e aspartato at a bainha dos feixes, onde ocorre a descarboxilao com a entrada do carbono no ciclo de Calvin-Benson.

1.8.3 Plantas CAM Plantas do deserto ou habitats sujeitos a secas peridicas fecham os estmatos durante o dia, assimilando o CO2 durante a noite (fosfoenolpirvico carboxilase; malato/4C). A descarboxilao do malato acumulado no vacolo durante a noite permite que o CO2 liberado durante o dia seja incorporado ao ciclo de Calvin (Rubisco). Embora bioquimicamente este processo de fixao de CO2 seja igual ao realizado pelas plantas C4, uma das diferenas mais acentuadas entre ambos a ocorrncia da compartimentao temporal nas plantas CAM.