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METODOLOGIAS DE VALIDAO NA CALIBRAO DE


INSTRUMENTOS VOLUMTRICOS

Elsa Batista, Eduarda Filipe, Miguel Azevedo
Instituto Portugus da Qualidade, Rua Antnio Gio, 2 - 2829 Caparica


Palavras Chave: Gravimetria, Validao, Incerteza, Material volumtrico de vidro,
Micropipetas

Resumo

Este trabalho tem como objectivo a validao do mtodo gravimtrico aplicado calibrao
de material volumtrico de vidro e micropipetas utilizados em laboratrios analticos, atravs
de vrios tipos de metodologias experimentais, onde o volume de cada instrumento
volumtrico assim determinado atravs do clculo da massa de gua destilada contida ou
escoada desse instrumento, em condies ambientais controladas.

Introduo

Os instrumentos volumtricos so essenciais para qualquer laboratrio ou indstria que
pretenda uma correcta medio do volume, podendo ter uma grande influncia no resultado
final de um ensaio onde a medio do volume apenas um pequeno componente de uma srie
de etapas experimentais.

A calibrao de instrumentos volumtricos, visando a quantificao de diferenas, entre o
valor nominal e o valor verdadeiro, do ponto vista tecnolgico de grande interesse, porque
contribui para a compreenso dos erros sistemticos do processo analtico de medio, sendo
assim possvel proceder sua correco.

Na determinao do erro de medio dos instrumento volumtricos utilizado o mtodo
gravimtrico, que consiste na determinao da massa de lquido escoado ou contido no
instrumento a calibrar e que posteriormente convertida em volume atravs de frmulas
adequadas descritas na literatura.

Neste trabalho o mtodo gravimtrico, aplicado determinao do volume, foi validado
utilizando diferentes metodologias de acordo com os instrumentos a calibrar (bales
volumtricos, provetas, pipetas, buretas, picnmetros e micropipetas) e as condies de
trabalho do laboratrio, utilizando diferentes operadores, diferentes lquidos de calibrao,
diferentes tempos de estabilizao e procedimentos experimentais distintos.

Foram tambm realizados testes de desempenho aos vrios instrumentos volumtricos
utilizados de forma a se avaliar a possvel variao de resultados perante situaes que se
encontram fora do mtodo experimental validado.

O balano de incertezas para cada uma das metodologias apresentado adoptando os modelos
matemticos de E. Batista et al [1].
2
Validao do Mtodo

A validao confirmao, atravs de evidncia objectiva, de que foram satisfeitos os
requisitos para uma utilizao ou aplicao especficas. [2]

No processo de validao o mtodo avaliado em termos da sua representatividade,
reprodutibilade e repetibilidade . As tcnicas de validao baseiam-se [3]:

Na utilizao da calibrao;
Em comparaes interlaboratoriais incluindo o uso de materiais de referncia e mtodos
de referncia;
No pessoal qualificado e o seu julgamento profissional;
Na modelao e simulao.

Poderemos caracterizar os diferentes procedimentos de validao atravs de uma abordagem
cientfica ou comparativa. No caso de ser uma validao cientfica pode ser baseada em
informao publicada na literatura ou publicaes do laboratrio sobre o desenvolvimento do
mtodo. O laboratrio tem de demonstrar que os factores relevantes foram analisados e esto
sobre controlo dentro da incerteza associada com o mtodo. Para a validao comparativa o
mtodo de teste ser aceite comparando os resultados com outros obtidos atravs de um
mtodo j validado que foi desenvolvido para o mesmo propsito. Se isto no for possvel a
performance do teste pode ser avaliada por comparaes interlaboratoriais. O mtodo pode
ser considerado validado se os resultados obtidos estiverem dentro dos limites esperados para
a incerteza.

No caso especifico da calibrao de instrumentos de volumtricos a validao do mtodo
gravimtrico pode ser efectuada utilizando ambos os procedimentos.

Mtodo Experimental

A gravimetria a determinao da massa de gua escoada ou contida no recipiente a calibrar
na qual se realizam duas pesagens uma com o recipiente cheio e outra com o recipiente vazio,
utilizando gua como lquido de calibrao, temperatura de referncia de 20 C.

Para determinar qual o volume correspondente massa escoada ou contida utiliza-se a
seguinte formula descrita na ISO 4787 [4].

( ) ( ) [ ] 20 1 1
1
20

|
|
.
|

\
|

= t I I V
B
A
A W
E L




Nesta equao temos:

V
20
- volume, temperatura de 20 C, em ml
I
L

- resultado da pesagem com o recipiente cheio com gua, em g
I
E

- resultado da pesagem com o recipiente vazio, em g

W
- massa volmica da gua, temperatura de calibrao t, em g/ml
3

A
- massa volmica do ar, em g/ml
(para temperaturas muito prximas de 20 C e presso atmosfrica normal pode ser
usado o valor mdio de 0,0012 g/ml)

B

- massa volmica de referncia das massas da balana
(para massas conformes com a OIML 33, normalmente utilizados, este valor de
8,0 g/ml)
- coeficiente de expanso cbica do material de que feita a esfera, em C
-1

t - temperatura da gua utilizada na calibrao, em C

Clculo da incerteza

Para se calcular a incerteza do volume obtido deve-se ter em conta os factores que vo
influenciar essa medio ou seja os componentes de incerteza.

O clculo da incerteza na calibrao de equipamento volumtrico semelhante ao descrito no
trabalho de E. Batista et al [1]

onde os componentes da incerteza so os seguintes:

a incerteza da pesagem, u(m);
a incerteza da massa volmica da gua u(
w
), dos pesos da balana u(
B
) e do ar u(
A
);
a incerteza da temperatura u(t);
a incerteza do menisco u
men
;
a incerteza do coeficiente de expanso cbica do material u();
a incerteza da evaporao u
evap
no caso especifico de micropipetas.

Assim a frmula para o clculo da incerteza combinada a seguinte:
2
1
2 2
2
20 2
2
20 2
2
20 2
2
20 2
2
20 2
2
20
20
) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (
(
(

(
+ |
.
|

\
|

+
|
|
.
|

\
|

+
|
|
.
|

\
|

+
|
|
.
|

\
|

|
|
.
|

\
|

+ |
.
|

\
|

=
men B
B
A
A
w
w
V u t u
t
V
u
V
u
V
u
V
u
V
m u
m
V
V u



A incerteza combinada de seguida multiplicada por um factor de converso k (normalmente
igual a 2 para um nmero de graus de liberdade superior a 50) para se obter a incerteza
padro expandida que corresponde a um intervalo de confiana de 95% [5].

Resultados Experimentais

Validao do mtodo de calibrao de material volumtrico de vidro

Sendo a gravimetria um mtodo normalizado necessrio verificar se o laboratrio efectuou
uma anlise do funcionamento do mtodo para a calibrao de material volumtrico de vidro
nas condies de trabalho do laboratrio dentro da incerteza associada com o mtodo. Assim
foram realizados ensaios com diferentes operadores, diferentes lquidos de calibrao e
diferentes tempos de estabilizao.





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Diferentes operadores

De forma a se poder verificar a reprodutibilidade do mtodo foram calibrados diferentes tipos
de material volumtrico de vidro por dois metrologistas diferentes. Os resultados so
apresentados na tabela seguinte:

Tabela 1 Estudo de reprodutibilidade


Balo de 100 ml Pipeta de 10 ml Bureta de 50 ml Picnmetro de
50 ml
Proveta de 25 ml

Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Metrologista 1 99,985 0,004 10,003 0,003 50,034 0,004 49,886 0,003 25,085 0,004
Metrologista 2 99,990 0,003 10,001 0,005 50,027 0,004 49,886 0,003 25,089 0,003
Variao 0,005 0,002 0,007 0,000 0,003

Os valores mdios do volume so bastante semelhantes entre si tendo em conta a incerteza de
cada resultado o que indica que o mtodo reprodutvel.

Diferentes lquidos de calibrao

Com este estudo pretende-se verificar a variao no valor do volume e da incerteza na
calibrao do material volumtrico com a utilizao de diferentes lquidos de calibrao, tais
como a gua e nonano.

Tabela 2 Estudo da influncia do lquido de calibrao

Balo de 100 ml Pipeta de 10 ml Bureta de 50 ml
Picnmetro de
50 ml
Proveta de 25 ml

Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
Volume
(ml)
Incerteza
(ml)
gua 99,985 0,004 10,003 0,003 50,014 0,004 49,886 0,003 25,085 0,004
Nonano 99,966 0,020 9,991 0,011 49,999 0,011 49,863 0,015 25,061 0,011
Variao 0,019 0,012 0,015 0,013 0,014

Verifica-se que existe uma sobreposio dos valores obtidos se tivermos em conta a sua
incerteza, apesar disso pode-se afirmar que existe uma clara diferena entre os volumes
obtidos quando se utiliza o nonano em vez da gua. Esta diferena deve-se possivelmente ao
facto da determinao da densidade do nonano s ser possvel numa gama restrita de
temperaturas o que provoca a necessidade de extrapolao para a gama de trabalho e
consequente diminuio da exactido de resultados. A incerteza tambm maior no caso do
nonano devido a uma maior variao de temperatura durante os ensaios provocada pela
instabilidade do lquido e pela sua maior capacidade de absorver calor.
5
Diferentes tempos de estabilizao

De acordo com a norma ISO 4787 o tempo de estabilizao do material no laboratrio antes
de uma calibrao deve ser de 24 h. Com este estudo pretende-se verificar que este dado
aplicvel s condies existentes no laboratrio. Foi colocado um balo de 500 ml a 50 C e
uma pipeta de 10 ml a 0 C durante 24 h e verificou-se a variao do volume com diferentes
tempos de estabilizao. O ensaio ao tempo zero corresponde a um tempo de estabilizao
de 24 h.

Variao do volume com o tempo de
estabilizao- balo 500 ml
500,05
500,10
500,15
500,20
500,25
500,30
0 10 20 30 40
Tempo de estabilizao (horas)
V
o
l
u
m
e

(
m
l
)

Figura 1 Balo de 500 ml colocado a 50 C
Variao do volume com o tempo de
estabilizao pipeta de 10 ml
9,94
9,95
9,96
9,97
9,98
9,99
10,00
10,01
10,02
0 10 20 30 40
Tempo de estabilizao (horas)
V
o
l
u
m
e

(
m
l
)

Figura 2 Pipeta de 10 ml colocada a 0 C

Verificou-se que no caso do balo houve uma diminuio inicial do volume devido
evaporao que ocorre devido temperatura do vidro ser ainda elevada com pouco tempo de
estabilizao. Ao longo do tempo este volume vai aumentando e estabiliza perto das 24 h.

No caso da pipeta no existem diferenas significativas entre os diferente perodos de
estabilizao mas o que mais se aproxima do valor inicial o tempo de estabilizao de 24 h.

Validao do mtodo de calibrao de micropipetas

A calibrao de micropipetas pode ser efectuada atravs de quatro mtodos gravimtricos
diferentes descritos em normas ISO. Neste pretende-se demostrar qual o melhor mtodo a
utilizar sendo este validado por comparao com os outros.

Diferentes mtodos experimentais

O primeiro mtodo, o mtodo normal, baseado na ISO 4787 e na ISO 8655 [6] onde se
determina-se o peso do recipiente de medida seco e pipeta-se o volume pretendido. Pesa-se o
recipiente com gua e por diferena determina-se o valor do volume da micropipeta. O
recipiente limpo depois de cada adio de liquido sendo o procedimento repetido dez vezes.

O segundo mtodo o mtodo de evaporao baseado apenas na norma ISO 8655.
Determina-se o peso do recipiente com 3 mm de gua (m
0
). Liga-se um cronmetro e pipeta-
6
se o volume pretendido. O recipiente pesado novamente (m
1
), pipetando-se de seguida o
volume pretendido (m
2
). A massa obtida por diferena (m
1
-m
0
, m
2
-m
1
, , m
10
-m
9
) uma
medida do volume da micropipeta. Faz-se de seguida uma correco evaporao
deixando-se o recipiente na balana durante o tempo indicado pelas dez medies,
adicionando o valor mdio obtido a cada um dos ensaios.

O terceiro mtodo o mtodo sem evaporao, tambm baseado na norma ISO 8655 mas
onde no se contabiliza as perdas por evaporao. Determina-se o peso do recipiente com
3 mm de gua e pipeta-se o volume pretendido. Pesa-se o recipiente com gua e por diferena
determina-se o valor do volume da micropipeta. Repetem-se os ensaios dez vezes sem limpar
o recipiente. Regista-se o valor da massa em cada medio.

O ltimo mtodo o mtodo sem evaporao utilizando leo. Este mtodo bastante
semelhante ao terceiro e tambm baseado na ISO 8655. Coloca-se no recipiente 5 mm de
leo, determina-se o seu peso e pipeta-se o volume pretendido de forma a que a gua fique
por baixo do leo que possui uma densidade menor. Pesa-se novamente o recipiente e
determina-se o volume da micropipeta repetindo-se o procedimento. Regista-se o valor da
massa em cada medio.
Foram realizados cinco ensaios para cada micropipeta de 5 l e de 100 l, para os quatro
mtodos. Cada ensaio compreende dez medies.


Micropipeta de 5
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
1 2 3 4 5
Ensa
V
o
l
u
m
e

(

l
)
Com Evaporao Sem Evaporao
Normal Com Oleo

Figura 3 Calibrao de uma micropipeta de 5 l
Micropipeta de 100
98,0
98,5
99,0
99,5
100,0
100,5
101,0
101,5
102,0
1 2 3 4 5
Ensa
V
o
l
u
m
e

(

l
)
Com Evaporao Sem Evapora
Normal Com oleo

Figura 4 Calibrao de uma micropipeta de 100 l

Como se pode observar pelas figuras 3 e 4, o mtodo com maior repetibilidade e com a menor
incerteza o mtodo sem evaporao. Este tambm o mtodo mais rpido e mais fivel
visto que no temos tempos de espera durante o procedimento. Alm disso no necessita de
correces ao volume ou limpeza do recipiente com solventes de forma a se remover o leo
utilizado.





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Ensaios de desempenho

Foram efectuados vrios ensaios de desempenho a instrumentos volumtricos de forma a se
avaliar as possveis alteraes dos resultados quando o instrumento utilizado correntemente
nos laboratrios dos clientes, simulando condies de funcionamento que esto fora do
procedimento validado.

Micropipetas

Foram efectuados dois ensaios de desempenho a uma micropipeta de 1000 l para se avaliar a
sua resposta em condies de fadiga e sem substituio das pontas. No primeiro caso foram
realizadas 100 medies consecutivas. No caso das pontas a micropipeta foi calibrada sempre
com a mesma ponta cinco vezes. Cada ensaio tem dez medies.

Ensaio de Fadiga - 100 medies
consecutivas
985,0
987,0
989,0
991,0
993,0
995,0
997,0
999,0
1001,0
1003,0
1005,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ensaio
V
o
l
u
m
e

(

l
)
Figura 5 Ensaio de Fadiga
Figura 6 Ensaio das pontas

Como se pode observar pelas figuras, no ensaio de fadiga a micropipeta necessita de algum
tempo para recuperar depois de uma utilizao continuada. O volume vai diminuindo ao
longo das 100 medies (figura 5) possivelmente devido a uma deficiente aspirao do
lquido, pois o mbolo no consegue voltar posio inicial.

Para o ensaio das pontas (figura 6), verifica-se que se a mesma ponta for utilizada em todas as
medies, no existe alterao de volume, mas mais seguro proceder sua substituio em
cada medio, porque se existir algum defeito de fabrico, que pode influenciar o resultado,
pode no ser identificado durante os ensaios. Outro problema que pode ocorrer se no houver
substituio de pontas o da contaminao no caso de medies qumicas ou biolgicas.

Material volumtrico de vidro

O material de vidro dilata com o calor devido ao seu coeficiente de expanso. do
conhecimento geral que o material volumtrico usado em laboratrio normalmente seco em
estufas. Foi ento verificar-se a influncia do tempo de aquecimento no aumento do volume
do instrumento a calibrar colocando-se um balo de 500 ml e uma pipeta de 10 ml numa
estufa a 50 C durante 5 h, 24 h, 48 h, 72 h e 92 h.
Ensaio das pontas
990,0
992,0
994,0
996,0
998,0
1000,0
1002,0
1004,0
1006,0
1 2 3 4 5
Ensaio
V
o
l
u
m
e

(

l
)
8

Variao do volume com a
temperatura- balo de 500 ml
500,14
500,16
500,18
500,20
500,22
500,24
500,26
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo (horas)
V
o
l
u
m
e

(
m
l
)
Figura 7 Balo de 500 ml
Variao do volume com a
temperatura-pipeta de 10 ml
9,98
9,99
10,00
10,01
10,02
10,03
10,04
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo (horas)
V
o
l
u
m
e

(
m
l
)
Figura 8 Pipeta de 10 ml

Verifica-se em ambos os casos um aumento gradual do volume com o tempo de exposio a
50 C.

Concluso

De acordo com os resultados obtidos pode concluir que o mtodo gravimtrico aplicado
calibrao de instrumentos volumtricos foi validado atravs de ensaios com diferentes
operadores, diferentes lquidos de calibrao, diferentes tempos de estabilizao e diferentes
procedimentos experimentais. Verifica-se tambm que necessrio algum cuidado no
manuseamento deste tipo de instrumento visto que os ensaios de desempenho indicam
claramente que as micropipetas no devero ser utilizadas continuamente sem nenhum
intervalo de espera, devido fadiga do mbolo, que ir levar a resultados de medio de
volume incorrectos e que o aquecimento do material de vidro em estufas provoca uma
alterao de volume que pode ser significativo para alguns ensaios analticos.

Referncias

(1) E. Batista, A. Sabrosa, M.C. Ferreira, I. Castanheira, A.M.H. van der Veen, Uncertainty
Calculation in the Calibration of Volumetric Laboratory Glassware, IX Congresso
Internacional de Metrologia, Brasil (2000);
(2) ISO 9000:2000 Sistemas de gesto da qualidade. Fundamentos e vocabulrio (2000);
(3) S. Ellison, A. Williams, Measurement uncertainty and its implications for collaborative
study method validation and Method performance parameters, Accred Qual Assur, 3:6-
10 (1998);
(4) ISO 4787 Laboratory glassware - Volumetric glassware - Methods for use and testing of
capacity (1984);
(5) Guia para a expresso da incerteza de medio nos Laboratrios de Calibrao, IPQ
(1998);
(6) ISO 8655-1/2/6 - Piston-operated volumetric apparatus (2002);
(7) E. Batista, L. Pinto, E. Filipe, A.M.H. van der Veen, - Calibration of micropipettes : test
methods and uncertainty calculation, Congresso de Metrologia, Toulon (2003).