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Ressonncia Magntica Nuclear na anlise de macromolculas

Marilena Meira

Macromolcula
Massa molecular elevada Unidades de repetio polmero Sintticos: Policarbonato, Poliuretano, Policloreto de vinila (PVC), Poliestireno, Polipropileno, Polietileno tereftalato (PET), etc. Naturais: Polissacardeos, Protenas, cidos nuclicos, Borracha natural, etc.

RMN na anlise de polmeros sintticos


RMN no estado slido. RMN em soluo. Mtodos tradicionais: RMN 1H, RMN 13C, DEPT, J-resolvido, COSY, COSY-DQF, TOCSY, NOESY, HMQC e HMBC. Mtodos multidimensionais.

Polissacardeos
So polmeros de unidades de monossacardeos. A celulose formada por unidades de betaglicose:

RMN na anlise de polissacardeos


Usualmente so suficientes experimentos mono e bidimensionais: RMN 1H, RMN 13C, DEPT, J-resolvido, COSY, COSY-DQF, TOCSY, NOESY, HMQC e HMBC. Polissacardeos complexos: Amostra marcada com 13C. Multidimensionais.

Peptdeo
Pepitdeo: condensao de 2 a 100 aminocidos atravs de ligaes peptdicas.

Estrutura bsica de um aminocido

AMINOCIDOS

Protenas
Protena: condensao de um grande nmero de alfa-aminocidos atravs de ligaes peptdicas. Peso molecular: 5.000 a 1.000.000 Da.

Estruturas das protenas


A B C D

A: Primria: seqncia linear de aminocidos. B: Secundria: arranjo espacial, aminocidos prximos. C: Terciria: arranjo espacial, aminocidos distantes. D: Quaternria: 2 ou mais cadeias de polipeptdeos.

Pontes de Hidrognio estabelecem as estruturas secundrias

Hlice alfa

Folha-beta

Estrutura terciria

RMN na anlise de protenas


Marcao com 15N, 13C. Marcao com deutrio. Multidimensionais. Espectrmetros de alto campo 900 1000 MHZ TROSY.

Objetivos da determinao estrutural de protenas


Mecanismos de reaes biolgicas. Drogas para processos biolgicos indesejveis.

HISTRICO
1946: F. Bloch e E. Purcell (Prmio Nobel de Fsica de 1952). Dcada de 50. RMN ambiente qumico. 1H. Baixa sensibilidade.

HISTRICO
1966: Ernst e Andrew: Tcnica de pulsos e transformada de Fourier (TF). Aumento da sensibilidade da tcnica. Espectros acumulados.

HISTRICO
1991: R. Ernst Prmio Nobel de Qumica: Desenvolvimento da RMN multidimensional. 1998: Kurt Wthrich - TROSY 2002: Kurt Wthrich Prmio Nobel de Qumica: Estruturas tridimensionais de macromolculas biolgicas em soluo por RMN.

TEORIA RMN
Espectroscopia de absoro. Campo magntico. Radiao eletromagntica: Radiofreqncia. Caractersticas estruturais da amostra. Determinados ncleos.

B0

Um ncleo absorve radiao de RF se tem nmero de spin diferente de 0.


P = I (I + 1). h 2
p

P = momento angular = . P = momento magntico

O nmero de spin pode assumir os valores: 0, 1/2, 1, 3/2, 2, 5/2, 3, 7/2, 4, 9/2, 5, 11/2, 6.

Nveis de energia em um campo magntico


Nmero de spin: nmero de orientaes em um campo magntico (2I + 1).

Para spin = :

Campo magntico: Ncleos na ausncia de campo magntico:

+1/2 -1/2
B0

orientados
aleatoriamente.

orientados paralelo
ou anti-paralelo

Pequeno excesso de populao no nvel com menor energia (mais estvel).

Variao de energia entre os nveis


E = .h.B0 2 E = .h.B0 2
A variao de energia entre os nveis diretamente proporcional a B0

Movimento de precesso
L
B0

Freqncia de Precesso ou freqncia de Larmor

Momento magntico total

M0 na direo Z (direo do campo B0)

Induo de Transio
Transio Aplicao de RF adequada Ou seja se 1 =L Ressonncia

RF

B0

Condio de Ressonncia
Para um ncleo isolado de spin 1= L = . B0 2 E = h. E = .h.B0 2 h. = .h.B0 2 = .B0 2

Aplicao de RF

Aplicao de RF: B1 perpendicular ao campo B0. Pulso de RF de 90 M na direo do plano xy. Magnetizao transversal.

Relaxao
Quando o pulso de RF cessa: Magnetizao eixo z com Mz=M0. Razo da populao estado de equilbrio. Spin-spin spin-rede

Relaxao transversal Relaxao longitudinal Energia do sistema no muda Troca energia com a rede

T1 e T2
T1 magnetizao longitudinal recupera 63% da sua magnitude inicial paralela a B0. T2 magnetizao transversal atinge 37% da sua magnitude aps a excitao inicial.

T2 e largura do pico
T2 curto Pico largo

T2 longo Pico estreito

Mecanismo de Relaxao: dipolo-dipolo


A B Acoplamento dipolo-dipolo: Spins nucleares espao campos magnticos relaxao.

Ncleos na mesma molcula ou em molculas vizinhas.

Mecanismo de Relaxao: dipolo-dipolo


RMN 13C: dipolo-dipolo < H > T1 > T1 < pico T1 para CH3: ~ s. T1 para C=O: > 1 min.
CH3

C - H.

C=O

Mecanismo de Relaxao: anisotropia do deslocamento qumico.


Deslocamento qumico:
B0

Proteo orientao da molcula. Reorientaes campos magnticos relaxao.

Influncia da mobilidade molecular


(movimento) = L
T1 curto. relaxao eficiente

T1 longo T1 curto T1 longo

Influncia do tamanho molecular e mobilidade em T1 e T2


Mais lenta

> c < mobilidade


Macromolculas lentos relaxao ineficiente T1 longo. Maior massa, mais lenta, menor T2 pico largo.

Desafios na anlise de macromolculas por RMN


Rpida relaxao T2: sinais alargados ou perda de sinal. Muitos picos. Baixa resoluo: sobreposio de sinais ou sinais no resolvidos. Grande quantidade de informao.

Desafios na anlise de macromolculas por RMN

Aumenta massa molecular problemas Muitos picos, sobreposio de sinais, sinais largos. Protenas de alto peso molecular: perda de sinal.

Desafios na anlise de macromolculas por RMN

Maior massa alargado.

menor mobilidade

menor T2

sinal

Solues aos problemas na anlise de macromolculas por RMN


Uso de maior campo magntico 900 MHz 1GHz. Amostras isotopicamente marcadas. Tcnica TROSY. Analises multidimensionais. Mtodos computacionais.

Efeito do campo magntico

Espectrmetros de RMN na anlise de macromolculas

Varian 900 MHz BRUKER 1 GHz Oxford 900 Mhz

Marcao isotpica
Protenas sintetizadas a partir de aminocidos marcados. Protenas biosintetizadas por bactrias crescidas em meio marcado. Exemplo: nica fonte de C:glicose-13C nica fonte de N: on amnio-15N

Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy TROSY


Aumenta sensibilidade e resoluo. Correlao heteronucleares H-X. Cancela: relaxao transversa devido a anisotropia do deslocamento qumico e acoplamento dipolo-dipolo Efeito em alto campo.

Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy TROSY

Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy TROSY


Seleo do componente do multipleto que relaxa mais lentamente.

N H HSQC sem desacoplar

HSQC desacoplado

TROSY-HSQC

Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy TROSY

TROSY Estudo de protenas marcadas com massa molecular de 900.000 D.

Determinao estrutural com ajuda de software


Parmetros: NOE, valores de deslocamentos qumicos, constantes de acoplamento. Clculos estruturais realizados por software. Atribuio dos sinais: CCPNmr Analysis, Sparky, NMRView, Xeasy. Atribuio automtica: MARS, SEASCAPE, UNIO, GARANT, CARA. Processamento: NMRPipe, TopSpin, Felix, Azara, Ansig. Clculos: XPLOR-NIH, CNS, ARIA, e-NMR. Validao: PSVS, QUEEN, CING. Anlise da dinmica: MODELFREE, TENSOR, ELAX.

RMN multidimensional na anlise de protenas

15N

N
13C 1H

RMN multidimensional
Maior dimensionalidade requerida quando: Maior nmero de picos Sobreposio de sinais. RMN Multidimensional: Resolve sobreposio de sinais. Automatizao de parmetros como o efeito Overhauser nuclear (NOE), o acoplamento spin-spin.

Visualizaes do espectro 3D

Visualizaes do espectro 3D
Representao 3D Projeo no plano H-C inferior
15N

15N

1H

13C

Projeo no plano N-C lateral

Projeo no plano H-N frente

Clculo estrutural
Deslocamento qumico: Ambiente qumico NOE: Distncias internucleares Constante de acoplamento: ngulos de toro.

Experimentos Homonuclear para anlise de protenas

COSY COSY: identifica multipletos acoplados NH com HA; HA com HB. TOCSY: identifica sistemas de spins de aminocidos. NOESY: H espacialmente prximos. Conecta seqncia de sistemas de spins.

COSY de protena
COSY: Identifica multipletos acoplados

R-COSY, DR-COSY e TOCSY

TOCSY de peptdeo

Sistema de spins caracterstico de cada aminocido.

Equao de Karplus: informaes sobre a estrutura de protena

Constante de acoplamento

Constantes de acoplamento

Constantes de acoplamento em anlises multidimensionais

Nuclear Overhauser Effect (NOE)


NOE: Interao (espacial) de 2 ncleos (5 ngstron). Dipolo-dipolo. Spins nucleares espao NOE proporcional a 1/r6 < distncia espacial > NOE. NOESY, ROESY

A B

15N-NOESY-HSQC

(3D)

NOESY

15N

H
15N

15N-NOESY-HSQC

(3D) :

Estrutura secundria de uma protena

HETCOR, HMQC, HSQC:


Experimentos diferentes, correlacionar C-H mesmo objetivo:

1H-15N1H-15N-HSQC

HSQC

correlaciona os ncleos de nitrognio N-15 com os hidrognios diretamente ligados a eles.

1H-15N-

HSQC

HMBC
HMBC: correlaciona hidrognios com carbonos atravs de J3 e J2.

Experimento 3D: HNCO

15N

13C 1H

Plano H - CO

Experimento 3D: HNCA


Projeo no plano H-CA
50

N CA H
55
13C A

60

65

Para cada N-H dois CA


10 9,5 9,0 8,5
1H

8,0

7,5

Experimento 3D: HN(CO)CA


Projeo no plano H-CA
55

N H CA

60
13C

65

10,5 10,0

9,5

9,0
1H

8,5

8,0

7,5

Para cada NH, 1 CA

Experimento 3D: HNCACB


CA = amarelo CB = azul

15N

13C 1H

Para cada NH 2 CA e 2 CB

Experimento 3D: HNCACB


Picos CA so negativos (verde) Picos CB so positivos (azul) ou vice-versa
Usualmente cada strip deve conter 4 picos: CAi, CBi do mesmo resduo que NH que so mais fortes e Cai-1, Cbi-1 do outro resduo que so mais fracos.

40
Em alguns casos os 4 picos no aparecem

55 60 65 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0

Plano HN, CACB

Experimento 3D: HN(CA)CO

174 176

178 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0

Projeo no plano HN-CO Cada HN, 2 CO.

CO

1H-15N

HSQC-TOCSY

TOCSY: H do mesmo sistema de spin

15N-NOESY-HSQC

(3D)

15N

H
15N

Plano HN - NOESY

13C-NOESY-HSQC
Cada strip contm NOEs de um grupo CH para todos os outros H espacialmente prximos 2,0

(3D)

4,0 6,0

8,0 10,0

NOESY
1H 13C

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

Determinao da conformao preferencial de um peptdeo

Seta contnua NOE Seta tracejada: COSY

Atribuio da seqncia de uma protena

Estrutura secundria e terciria: Contatos no seqnciais

ESPECTRMETRO BRUKER
XWIN-NMR verso 2.5 o programa de pulsos e parmetros dos espectrmetros Bruker. Bio Tool um pacote adicional: Contm vrios experimentos 3D com a seqncia de pulsos e parmetros comumente usados em anlise de protenas, DNA e RNA. A biblioteca de experimentos atualizada freqentemente pela BRUKER.

Experimentos disponveis em XWINNMR verso 2.5 BRUKER

ESPECTRMETRO VARIAN
VNMRJ o software da Varian que controla o espectrmetro de RMN adequado para anlises multidimensionais. Biopack um pacote adicional ao VNMRJ tendo um conjunto de seqncias de pulsos, macros de calibraes e parmetros para anlise de protenas, DNA e RNA. atualizado com freqncia pela Varian.

Experimentos Biopack

Experimentos Biopack

Para rodar um experimento multidimensional:


Calibrao do biopack: "Main menu">"Setup"->"Proteins"-"Calibrate". Abre janela com opes de calibrao. Digitao do nome do experimento na linha de comando do VNMR. Exemplo: Para HNCO digite: ghn_co Ajustes de parmetros bsicos: nt, ni, pw, sw.

Alguns experimentos e seqncias de pulsos disponveis em Biopack