EXPERIMENTO 7

PURIFICACION DE LA ENZIMA INVERTASA DE LEVADURA

REQUISITOS Revisar la participacin de la invertasa en los procesos biolgicos, su clasificacin segn E.C, importancia industrial. Consultar la aplicacin de la dilisis, precipitacin y resinas intercambiadoras de iones en la purificacin de protenas

OBJETIVOS Purificar por precipitacin, dilisis y resinas intercambiadoras la invertasa de levadura y en cada etapa de purificacin calcular: actividad especfica, actividad total y % de rendimiento enzimtico.

1.

FUNDAMENTO

Entre las enzimas ms antiguamente conocidas se encuentran los que hidrolizan la sacarosa. En 1860, Bertheelot, que se hallaba trabajando en la purificacin de un enzima procedente de la levadura que hidrolizaba la sacarosa, le llam "ferment inversif", en razn de la inversin (de + a -) de la rotacin ptica durante la hidrlisis de la sacarosa. Ms recientemente se han usado los nombres de invertasa, sucrasa, sacarosa y -fructofuranidasa para denominar la enzima hidrolizante de la sacarosa. Muchos fructofuransidos son susceptibles de hidrlisis por esta enzima, pero la sacarosa es el mejor sustrato. La reaccin hidroltica se mide observando el cambio de la rotacin ptica o de poder reductor al incubar sacarosa con la enzima. Este experimento usa el procedimiento de anlisis a tiempo fijo que consiste en detener la reaccin con lcali y medir a continuacin el poder reductor por medio del mtodo Somogyi-Nelson 87

Figura 1

Reaccin de hidrlisis de la sacarosa

CH2OH

CH2OH CH2OH

o o

o
CH2OH

CH2OH

o +
OH CH2OH

sacarosa

glucosa

fructosa

En este experimento se rompen las clulas de levadura desecadas por autolisis y se determina la actividad especfica y total del autolisado bruto una vez eliminado el debris celular. La enzima bruta se purifica luego por eliminacin del material contaminante (protenas y otras molculas) en forma de sus respectivos picratos y fraccionamiento con acetona de la preparacin resultante. Finalmente se pasar por una resina intercambiadora aninica. Se calcular para cada etapa del fraccionamiento la actividad especfica, actividad total y % de rendimiento. 2. MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS

Levadura desecada CO3HNa 0,1M Bao termosttico de agua Centrfuga Tampn acetato sdico 0,05M pH 4,7 (haga los clculos para preparar este (Buffer). Sacarosa 0,3M Solucin de cido pcrico Acetona EDTA Na2 al 0,1% pH 7,2 Sal comn Material y dispositivos para dilisis Tampn tris-HCl 0,05 pH 7,5 (con y sin NaCl a diversas concentraciones). Reactivos de Somogyi-Nelson (para azcares reductores) Reactivos de Lowry (para protenas). 88

2.1.

Preparacin del enzima bruto

2.1.1. Levadura: Mezcle 50 g., de levadura desecada con 150 ml., de CO3HNa 0,1 M en una fiola de un litro hasta que la solucin ablande todos los acumulo. Tpese entonces el frasco con una torunda de algodn y colquese en un bao de agua manteniendo la temperatura entre 40 a 45C; djese autolisar la preparacin durante 24 horas. 2.1.2. Centrifugacin: Centrifguese la mezcla despus dela autolisis a 1500 r.p.m. durante 15 minutos a temperatura/ambiente, o por debajo de ella, para sedimentar el debris celular. Decntese el lquido sobrenadante claro y de color mbar en una probeta; antese el volumen y virtase la solucin sobre un vaso mantenido entre 0 a 2C en bao de hielo. 2.1.3. Enzima bruto: Esta solucin constituye el enzima original bruto, fraccin I. Es necesario determinar la actividad especfica y total de esta preparacin mediante el anlisis de determinados diluciones del enzima, la concentracin de protenas y el volumen total. (Guarde para esto un volumen de 2 ml de la Fraccin I a 0C). 2.2. Purificacin de la enzima bruta

2.2.1. Homogenizacin: Todas las operaciones han de efectuarse manteniendo la temperatura entre 0 y 2C. Adase el homogeneizado bruto, fro (Fraccin I) 0,35 volmenes de la solucin de cido pcrico, enfriada en hielo, en un vaso tambin introducido en hielo y agtese suavemente para asegurar una distribucin homognea. 2.2.2. Reposo: Mantngase la mezcla a 0C durante 1 hora; seprese entonces el precipitado por centrifugacin a 10.000 xg durante 10 minutos a baja temperatura. Descrtese el precipitado. Mdase el volumen de la solucin amarilla sobrenadante en una probeta enfriada; tmense 4 ml de esta solucin (Fraccin II) y gurdese a 0C para posteriores ensayos. 2.2.3. Enfriamiento: Sumrjase un vaso que contenga la fraccin II en un bao de hielo y sal, enfriando la solucin hasta 0C. Virtase entonces sobre ella 3 volmenes de acetona enfriada en congelador (- 15C) a lo largo de 3 minutos, aadindola lentamente mientras se agita 89

suavemente con varilla de vidrio. Adase ms sal al bao de hielo y djese la mezcla 15 minutos en l. Decntese a continuacin lo que se pueda de la solucin sobrenadante separndola del precipitado gomoso. 2.2.4. Dilisis: Decntese la solucin sobrenadante y redisulvase el precipitado en una cantidad mnima de solucin EDTA-Na2 al 0,1% pH 7,2 enfriada con hielo. Dialcese esta solucin a 0C contra grandes volmenes de H2O fra que debe cambiarse varias veces durante 24 hasta que pierda el color la solucin del recipiente de la dilisis. Retrese entonces el enzima (Fraccin III) guardndose a OC hasta el paso siguiente. 2.3. Preparacin de la columna de DEAE-celulosa

2.3.1. Resina: Esta resina tiene la capacidad de asociar aniones en virtud de las cargas positivas que posee, y tambin tiene la capacidad de intercambiar los aniones fijados segn el pH y la fuerza inica de las especies que compiten por las cargas. En nuestro caso la resina quedar equilibrada a un pH y fuerza inica tales que la enzima, al ser introducida en la resina, es capaz de fijarse a la misma, pudiendo luego desplazarla con un cambio de pH o de concentracin de iones de la columna. 2.3.2. Eluir: Una vez obtenida la fraccin III y habiendo separado una alcuota de 1 ml., esta debe quedar disuelta en buffer Tris-HCl 0,05M pH 7,5 (Buffer de la columna), para ser introducido todo el volumen restante en al columna de DEAE celulosa previamente empacada y equilibrada con el mismo Buffer. Deje que la FIII penetre lentamente en la columna, recogiendo el lquido que vaya saliendo. No deje secar la columna en la parte superior. 2.3.4. Tampn Tris-HCl 0,05M: Haga pasar 10 ml de Tapn Tris-HCl 0,05M pH 7,5 recogiendo el lquido que sale en fracciones de 5 ml c/u. (proceso de lavado). El flujo de lavado debe ser menor de 15 gotas por minuto.

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2.3.5. Aumento fuerza inica: Para eluir la invertasa que est fijada por interacciones de carga a la resina, introducimos un Tampn Tris-HCl 0,05M pH 7,5 al cual se le incrementar la fuerza inica con NaCl, a las siguientes concentraciones:

Tris-HCl 0.05M pH 7,5 (Volumen en ml) 10 10 10 10

NaCl (Concentracin en M) 0,025M 0,050M 0,150M 0,200M

El flujo de elusin debe ser igual al flujo de lavado, y se debe recoger el lquido eluyente en tubos de ensayo debidamente marcados, dejando caer 5 ml en cada tubo. Una vez recogidas todas las fracciones, deben guardarse en fro hasta medirle actividad enzimtica y cantidad de protenas. 2.4. Medida de la actividad especifica de la enzima

La actividad enzimtica de la invertasa adems de indicarnos su recuperacin puede servir como un ndice de la calidad y rendimiento de nuestro trabajo durante el proceso de purificacin. 2.4.1. Dilucin: Se utilizar el mtodo de anlisis a tiempo fijo, para lo cual es necesario determinar la dilucin enzimtica adecuada a fin de poder cuantificar nuestra actividad por el mtodo de Somogyi-Nelson. Qu concentracin de sustrato utilizar para esa medida? 2.4.2. Tampn acetato: Coloque 0,95 ml de tampn acetato 0,05M pH 4,7 en un tubo de ensayo y 0,05 ml., de la muestra cuya actividad enzimtica se quiere probar. 2.4.3. Incubar: Djese equilibrar no menos de dos minutos a 25C, y adase entonces 1 ml de sacarosa 0,3M, equilibrada tambin a 25C y djese incubar las muestras durante 5 minutos. Detngase la incubacin aadiendo 1 ml de reactivo cprico alcalino y agitando el contenido. (No olvide hacer lo mismo con los patrones y el blanco). Luego siga el procedimiento restante para determinacin de azcares reductores con el mtodo Somogyi-Nelson (ver mtodo).

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2.5.

Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry

2.5.1 Prepare las siguientes soluciones: Solucin A: Na2 CO3 2% en NaOH 0,1N Solucin B1 : CuSO4 1% en H2O Solucin B2 : Tartrato de sodio-potasio 2% en H2O Solucin Folin diluida 1:1 con H2O Solucin C: B1 + B2 + A (1:1:100) Solucin de albmina (patrn) 1 mg/ml. 2.5.2. Clculos segn el mtodo de Lowry: Efecte los clculos segn el cuadro siguiente. La actividad enzimtica y la cantidad de protenas debe medrsele a las fracciones F1, F2, F3 y los tubos que salen de la columna DEAE-Celulosa (incluyendo el "lavado"). MUESTRA PROBLEMA X ml H2O 0,6-Xml SOL . C 3 ml 10 min * SOL. FOLIN 0,3 ml 30 min ** DO600nm DO600nm

2.6.

Clculo y tratamiento de datos

Es necesario que se tome nota de todos los resultados obtenidos para luego ser analizados y presentados en el informe de manera organizada. Para simplificar, la actividad enzimtica ser expresada en unidades de enzima (invertasa). 2.6.1. Definicin: Una unidad de invertasa es aquella cantidad de enzima que hidroliza un micromol (1 mol) de sacarosa por minuto en las condiciones descritas. Al referirse a la cantidad enzimtica de la invertasa, hay que expresarla en unidades de enzima y hacer referencia al volumen de la muestra usada para la medida de esa actividad (nosotros usaremos siempre 0,05 ml de muestra para la mezcla de reaccin, pero es mejor expresarla en unidades de enzima por mililitro (U/ml). 2.6.2. Actividad especifica: Este parmetro relaciona la actividad enzimtica de una fraccin (U/ml) con la concentracin de protenas en la misma (mg.prot/ml). 92

U/ml U Actividad especfica = ------------- = --------------mg/ml mg.Prot. 2.6.3. Rendimiento: Esta medida puede ser usada tanto para la actividad enzimtica a las protenas y nos da una idea del porcentaje de recuperacin de la enzima en un paso de purificacin dado. Para ello hay que suponer que la fraccin 1 tiene el 100% de actividad enzimtica y el 100% de protenas. 2.6.4. Tabla de resultados: Los resultados de la purificacin deben ser finalmente introducidos en una tabla que aparece en el informe 3. 1. 2. 3. 4. 5. 6. AUTO-EVALUACION Por qu todas las operaciones han de efectuarse manteniendo la temperatura entre 0 y 2C ?. Cmo calculara Ud., el total de actividad enzimtica y el total de protenas de una fraccin dada? Por qu cree Ud. que se uso cido pcrico para preparar la fraccin II ?. Por qu en cada fraccin la enzima esta mas purificada ?. Por qu debemos calcular la concentracin de protenas ?. Por qu calculamos la concentracin de glucosa ?.

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4.

INFORME 7 (INVERTASA) Nombres N del mesn N del estudiante Desarrollo Informe Definitiva

Apellidos Grupo de prcticas Fecha Calificaciones Entrada 1.

Introduzca los resultados de la purificacin de la enzima en la siguiente tabla. Volumen Total (ml) Protenas Totales U/ml Totales (mg) Protenas (mg/ml) Rendimiento A.E F.P Actividad protenas Enzimticas

Fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

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2.

Anexe sus grficas en el siguiente espacio.

3.

Discuta sus resultados.

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas. 95