Obtencin de ADN de Escherichia coli Entregado: Mayo 24 de 2011 ________________________________________________________________________ RESUMEN Para la obtencin de ADN de Escherichia coli se utilizaron

varios mtodos como la lisis de las clulas bacterianas que consisti en utilizar lisozima que daan la membrana celular, el mtodo de Marmur modificado que consiste en purificar el DNA con cloroformo-alcohol isoamilico el cual me permite la extraccin del ADN en una suspensin de dichas bacterias , la prueba cualitativa con difenilamina que indica la presencia del ADN por medio de la coloracin y la prueba cuantitativa por medio de espectrofotometra, todo esto con el objetivo de extraer, purificar, cuantificar el ADN de E.coli y reconocer los mtodos y funcin de los reactivos utilizados, obteniendo como resultados que al tratar la suspensin de clulas con lisozima a 37 aument a simple vista la viscosidad de la solucin. En la extraccin y desproteinizacin por mtodo de Mamur se pueden ver la purificacin a simple vista por la presencia de las fibras blancas de ADN. En la prueba cualitativa al comparar la presencia de ADN en las diferentes soluciones se tiene que slo la solucin con ADN patrn y el ADN de E.coli cambian de color dando un color azul claro y azul oscuro respectivamente, Y por ltimo en la prueba cuantitativa al realizar la grfica de Absorbancia a 595nm versus concentracin de ADN se tiene que stas son directamente proporcionales, la concentracin aumenta a medida que la absorbancia aumenta para cada solucin. Palabras clave: Escherichia coli, ADN, extraccin, desproteinizacion, difenilamina, prueba cuantitativa.

INTRODUCCION

Las bacterias constituyen un grupo heterogneo de organismos desde el punto de vista morfolgico. Difieren de los eucariotas adems de su pequeo tamao por carecer de ncleo diferenciado; posee un solo cromosoma formado por DNA circular en doble hlice, sin protenas asociadas, posee una pared celular, membrana plasmtica y un citoplasma en el cual se haya el cido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN (y tambin DNA, del ingls DeoxyriboNucleic Acid), es un tipo de cidos nucleico, una macromolcula que forma parte de la mayora de las clulas. Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, siendo el responsable de su transmisin hereditaria; las bacterias tambin presentan numerosos ribosomas (Goi et al, 2000), tal es el caso de la bacteria que fue utilizada en esta prctica (E. coli). Escherichia coli es un bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram, es anaerbico facultativo, mvil por flagelos peritricos (rodean su cuerpo), es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa, no forma esporas.(Tiene como ya fue mencionado un solo cromosoma, circular, y sin protenas, que contiene y controla el uso del ADN, esta bacteria puede completar su ciclo celular en 30 minutos o ms, durante la mayor parte de ese tiempo, la clula absorbe nutrimentos a partir del medio, crece y duplica su ADN(Audesirk y Audersirk. 2005) , es uno de los muchos grupos de bacterias que viven en los intestinos de los humanos sanos y en la mayora de los animales de sangre caliente ayuda a mantener el equilibrio de la flora intestinal normal (flora bacteriana) contra las bacterias nocivas y sintetiza o produce algunas vitaminas, muchos de los avances importantes en la gentica molecular resultaron de experimentos con procariotas y virus. Las investigaciones con Escherichia coli contribuyeron a identificar el DNA como material gentico, a descifrar el cdigo gentico y a dilucidar los principios y detalles de la transcripcin y la traduccin. (Curtis, H. & Barnes, N). En la extraccin del ADN de las bacterias en solucin salina-EDTA con utilizacin de lisis, tambin llamada muramidasa, es una enzima de 14,4 kilodalton que daa las clulas bacterianas catalizando la hidrlisis de los enlaces covalentes de la pared celular en las uniones beta 1,4 entre los residuos de cido N-acetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano. Las lisozimas sirven como opsoninas innatas unindose a la superficie bacteriana, reduciendo la carga negativa y facilitando la fagocitosis de las bacterias , la lisozima fue descubierta en 1922 por Alexander Fleming y es una enzima que se encuentra presente en secreciones como lgrimas, mocos, saliva, leche y en gran cantidad en la clara de huevo, que es su fuente de obtencin para su uso industrial es un enzima pequea que aguanta bien medios cidos y resistente al calor (100C, aunque disminuye cuando baja el pH). Estas propiedades anti- bactericidas hacen que la lisozima sea utilizada en diversos procesos industriales. La accin de la lisozima es casi inmediata y

luego se elimina por precipitacin e inactivacin el EDTA es un agente quelante que acta removiendo traza de metales necesarios por endonucleasas para actuar. De esta manera se previene que las endonucleasas que estn presentes en el citoplasma de la clula acten degradando el constituyente celular de inters y facilitando la accin de la lisozima (Audesirk y Audersirk. 2005). La prctica tuvo como objetivo principal la extraccin del ADN presente en la bacteria Escherichia coli, mediante el uso del mtodo de Marmur y Sacchi y Chomczynski modificados, la extraccin del ADN se comprobara con una prueba cualitativa con difelamina en donde se comparara con muestras patrn de ARN y ARN, igualmente se llevara a cabo una prueba cuantitativa en donde se calculara la concentracin del ADN bacteriano extrado mediante el uso de la espectrofotometra.

MATERIALES Y METODOS Los materiales y el procedimiento de la prctica de laboratorio corresponde con el indicado en: Gua de Laboratorio de Biologa Celular y Bioqumica I, obtencin de ADN de Escherichia coli; Universidad del Valle, Cali. Con las modificaciones que se muestran a continuacin: en lugar de utilizar 5 ml de solucin salina-citrato diluida para el punto 1.2. Extraccin y desproteinizacin del ADN se utilizaron 3 ml. en el punto 3 prueba cuantitativa del ADN extrado no se utiliz 1 ml de solucin de ADN de E. coli sino 2 ml y para el punto 2 prueba cualitativa con difenilamida no se prepar el tubo 4, sino que los datos para este tubo fueron obtenidos del tubo N 5 del punto 3. RESULTADOS por el mtodo de Marmur se obtuvo el ADN de un cultivo de bacterias de Escherichia coli, los pasos llevados a cabo para la realizacin de dicho mtodo y el cambio presentado por el cultivo de bacterias en cada paso se muestran en las tablas N 1, mientras que el procedimiento realizado para la extraccin y desproteinizacin del ADN se muestran en la tabla N 2.

Tabla N 1: lisis de las clulas bacterianas, con los cambios presentados por el cultivo en los diferentes procedimientos.

OBSERVACIONES El cultivo bacteriano es homogneo de un Tratamiento con lisozima color amarilloso con muchas burbujas en la e incubacin a 37 C. parte superior, se nota espeso. Tratamiento con SDS e En la solucin se comenzaron a formar grumos incubacin a 60 C. y la coloracin se intensifico. PROCEDIMIENTO Tabla N 2: extraccin y desproteinizacin del ADN, con los cambios sufridos por el cultivo en cada procedimiento. PROCEDIMIENTO OBSERVACIONES

Los grumos de la solucin comenzaron a disociarse y se Tratamiento con perclorato formaron 2 capas, un sedimento de color blanco y de sodio apariencia lechosa mientras que el sobrenadante fue translucido. La diferencia entre la densidad de la sustancias Tratamiento con cloroformodesapareci quedando una solucin homognea de un alcohol isoamilico color blanco, muy ligera. formacin de 2 fases nuevamente, el sedimento Tratamiento con etanol y translucido y el sobrenadante blanco el cual se fue agitacin con la varilla de disolviendo poco, hasta que la solucin fue translucida homognea, mientras que en la parte inferior de la varilla vidrio quedaron suspendidas las fibras de ADN. Disolucin en salina-citrato Solucin homognea translucida.

Una vez obtenido las fibras de ADN del cultivo bacteriano de Escherichia coli por medio del mtodo de Marmur se pas a la segunda parte del experimento que consisti en un prueba cualitativa con difenilamida, cuyos resultados se muestran en la Tabla N 3 y se ilustran en la Figura N 4 y una prueba cuantitativa, donde se tom el valor de la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm, estos resultados se muestran en la tabla N 5.

Tabla N 3: resultados colorimtricos de la prueba cualitativa con difenilamida.

TUBO CONTENIDO COLOR

1 ADN patrn Azul

2 3 ARN patrn ADN de E.coli incoloro Azul claro

4 Blanco incoloro

Figura N 4: prueba cualitativa con difenilamida. Blanco, ARN patrn, ADN de E.coli, ADN patrn. Tabla N 5: resultados de la prueba cuantitativa del ADN extrado. [ADN], TUBO N ABSORBANCIA mg/ml 1 0,023 0,033 2 0,047 0,066 3 0,177 0,166 4 0,234 0,33 5 0,043 desconocida 6 0 0 Con los datos de absorbancia y concentracin de ADN, tabulados en la tabla N 5, se realiz una regresin lineal con el fin de calcular el valor de la concentracin de ADN obtenido de la bacteria Escherichia coli

0.3 0.25 ABSORBANCIA 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.1 0.2 [ADN] mg/ml 0.3 0.4 y = 0.7486x + 0.0071 R = 0.9364

Figura N 6: concentracin de ADN vs absorbancia presentada 595 nm. Con la ecuacin de la forma Y= mx + b, obtenida de la regresin lineal se despejo el valor de la concentracin cuando la absorbancia era igual a 0.043 y se encontr que la concentracin de ADN extraida de la bacteria Escherichia coli es igual a 0.048 mg/ml. DISCUSION La primera parte del experimento consisti en la extraccin del ADN el cual se realiz mediante el uso del mtodo de Marmur con algunas modificaciones, en primer lugar se agreg lisozima ( N acetil muramidasa) una enzima que se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza que no permite el desarrollo de bacterias como en el caso de Escherichia coli pues ataca las paredes celulares causando la lisis de la clula, por medio de la ruptura de los enlaces glicosdicos beta 1,4 entre los residuos de cido Nacetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina en el peptidoglucano bacteriano. (Montenegro, 1999), para el correcto funcionamiento de la enzima fue necesario mantener la reaccin a una temperatura de 37 C y durante 30-40 minutos pues el efecto ltico es casi completo despus de ese tiempo y la temperatura es a la cual se encuentra la enzima en su medio natural. (Castro, 2009), luego de romper la pared celular de la bacteria se procedi a agregar dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente usado para solubilizar en parte la membrana externa de las bacterias gram negativas como Escherichia Coli, al separar los lpidos y las protenas que conforman la membrana celular, lo que produce la liberacin del contenido celular de estas: ADN genmico y plasmdico desnaturalizados, ARN y protenas, el calentamiento a 60C sirve para optimizar la lisis y no afecta al ADN, ya que este es termoestable adems el SDS inactiva las nucleasas, enzimas que hidrolizan las cadenas de ADN y ARN. (Marmur, 1961).

Para la extraccin y desproteinizacin del ADN se utiliz en primera medida se utiliz perclorato de sodio, que segn la teora Marmur, 1961 si se encuentra a 1M ayuda a la disgregacin entre el ADN y las protenas; esta disgregacin tiene su fundamento en el salting out pues al aumentar la concentracin de sales luego de alcanzar un mximo de solubilidad (salting in); este cambio en la concentracin crea una competencia entre la solucin salina y la protena por las molculas de agua disponibles, causando que las interacciones protena-protena cobren mayor importancia, reduciendo la solubilidad y causando la precipitacin de estas, (Plummer, 1981). Si el perclorato de sodio se encuentra en altas concentraciones tambin remueve o separa la solucin de SDS y la protena entrelazada de la solucin de cidos nucleicos. (Wilcockson, 1973) Para la segunda parte se hizo uso del mtodo single-step desarrollado por Sacchi y Chomcynski en 1987, con algunas modificaciones ya que no se utiliz fenol ni tiocianato de guanidinio. En este mtodo se adiciona fenol, cloroformo y alcohol isoamilico en las siguientes proporciones de volumen 25:24:1. El fenol hace que las clulas se lisen rpidamente, se solubilicen en sus componentes y se vuelvan inactivas a las ribonucleasa (lamo, 2010), el uso del fenol no fue necesaria al utilizarse la lisozima para lisar las celular y el SDS para inhibir la accin de las ribonucleasas. El uso de tiocianato de guanidio se descart puesto que el ADN no se depositaria en la interfase, sino que seguira disuelto en el sobrenadante en donde sin embargo podra ser extraido el ADN sin ningn problema. Siendo entonces el cloroformo-alcohol isoamilico el nico compuesto adicionado en una proporcin de 24:1. El cloroformo fue el causante de la aparicin de 2 fases: un sedimento que contena las protenas desnaturalizadas disueltas en cloroformo, y una fase acuosa con cidos nucleicos, y la formacin de una interface con ms protenas, (Chomczynski & Sacchi, 2006), el uso del alcohol isoamilico es con el fin de evitar la formacin de espuma y para ayudar a separar el sedimento del sobrenadante. Las disoluciones de ADN aunque sean muy diluidas son muy viscosas debido a la rigidez de la duplohelice y a la inmensa longitud del ADN en relacin con su escaso dimetro. La gran longitud del ADN tambin implica que cuando se difunden, lo hagan arrastrando con ellas enormes volmenes de la disolucin, ms de 10000 veces mayor que su propio volumen, razn por la cual el ADN nicamente exhibe un comportamiento ideal como soluto cuando est formando disoluciones altamente diluidas, (Lehninger,1988). En este caso se utiliz como disolvente 2 volumenes de etanol, y debido a que los acidos nucleicos son insolubles en estos, al agregarlo estos se separaron de la solucin, formando delgadas hebras que fueron trasladadas a una solucin salina de citrato diluida, para que ocurriera el fenmeno conocido como salting-in, esta solucin salina de citrato de plata se adiciona hasta que se observe una disolucin de los acidos nucleicos y luego se aade un poco ms de solucin salina de citrato concentrada para estandarizar la solucin. (Plummer, 1984)

Una vez se obtuvo el ADN proveniente de las cepas de Escherichia coli, se compar el resultado del experimento por medio de la prueba cualitativa con difenilamida, en donde aparte de la muestra se ADN de E.coli, se tuvo una muestra patrn de ADN, una de ARN y un blanco, en donde las 2 muestran que posean ADN dieron una tonalidad azul, siendo ms oscura la patrn de ADN, debido a que la concentracin de este fue mayor, la muestra de ARN tambin reacciono solo que de una forma diferente, puesto que cambio en comparacin con el blanco. la reaccin entre el ADN y la difenilamina en condiciones acidas, da la formacin de un compuesto de color azul con una absorcin definida mxima a 595 nm. Esta reaccin la dan en general las 2-desoxipentosas y no es especfica para ADN. En solucin acida, la cadena lineal de una desoxipentosa se convierte a la forma beta hidroxilevulinoaldehido altamente reactiva y es la que reacciona con la difenilamina para dar el complejo color azul. En el ADN nicamente reacciona la desoxirribosa del nucletido de purina, as el valor obtenido representa la mitad del total de desoxirribosa presente. (Plummer, 1984). La reaccin con el ARN no da una coloracin azul sino amarilla, pues el ARN puede reaccionar con la difenilamina, bajo la condicin de una hidrolisis acida a 100 C durante una hora o ms. Por ltimo se realiz la prueba cuantitativa del ADN extraido, en donde mediante el uso de la espectrofotometra se encontr la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm de muestras patrn de ADN y ARN, el ADN extrado experimentalmente con respecto a un blanco, esto con la finalidad de realizar una regresin lineal y de este modo calcular la concentracin del ADN de E.coli extraido, encontrando que dicha concentracin fue de 0.048 mg/ml con un r2 igual al 0.93, lo que nos indica que el procedimiento realizado estuvo bien hecho y que la concentracin hallada tiene un porcentaje de error muy bajo con respecto a la concentracin real, con este procedimiento se comprob la ley de BeerLambert que enuncia que a mayor absorbancia existe una mayoir concentracin. Para concluir se puede decir que la extraccin del ADN en este caso de la bacteria Escherichia coli, puede llevarse a cabo con la obtencin de excelentes resultados siempre y cuando se sigan al pie de la letra las indicaciones pues si el procedimiento no se hace correctamente se podra destruir las molculas de ADN, tambin se concluye que la extraccin no siempre tiene una misma ruta puesto que se pueden utilizar mtodos ya existentes como el de Marmur, Sacchi-Chomczynski o estos mismos mtodos con algunas modificaciones, donde dichas modificaciones tengan la misma funcin de los reactivos reemplazados, para comprobar si la extraccin de ADN se hizo de la manera adecuada usualmente se utiliza la difenilamina y la concentracin del ADN extraido se calcula mediante el uso de la espectrofotometra.

BIBLIOGRAFIA

lamo, M., Barea, J., Cuesta, C. 2010. Purificacin de cidos nucleicos. Campus Universitario de Rabanales, Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. Audesirk, T., y Audersirk, G. 2005. Biologa. La vida en la tierra. Quinta edicin, Prentice Hall, pag 947. Curtis, H. & Barnes, N. 1989. Biologa. Quinta edicin, medica panamericana. Pg. 1187. Chomczynski, P. & Sacchi, N. 2006. the single-step method of rna isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Prot. 1 (2): 581 585. doi:10.1038/nprot.2006.83 Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. Journal of Molecular Biology. Volume 3, Issue 2, April 1961, pg. 208-218 Wilcockson, J. 1973. The use of sodium perchlorate in deproteinization during the preparation of nucleic acids. PMCID: PMC1165862 Plummer,d. 1981. Bioqumica prctica. Editorial mcgraw-hill, bogota, pag 224,227 Lehninger,A. 1988. Bioqumica: las bases moleculares de la estructura y funcin celular. Editorial Omega. Barcelona. Pg. 884. Montenegro, R. Viana, M. 1999. Propiedades bioqumicas y bacteriolgicas de la lisozima de la almeja Tivela stultorum. Editorial universidad autnoma de baja california. pg. 226. Goi F., Macarulla J., Goi F. 2000. bioquimica humana. Editorial Revert, Pg. 530 Castro, F. Rodrguez, A. Jurez, G. Fernndez, F. 2009. Aspectos comparativos de la determinacin de la actividad ltica de la lisozima. Acta zoolgica lilloana 53. Pg. 49