TECNICAS ANALITICAS PARA VINOS

Juan Garca Barcel

TECNICAS ANALITICAS PARA VINOS

TECNICAS ANALITICAS PARA VINOS

Juan Garca Barcel

Presentacin

Todas las obras deben ser fruto de una experiencia, de un conocimiento y de una reflexin. En esta ocasin el lector tiene en sus manos un libro que rene los tres requisitos apuntados. Adems tiene como mrito que ha sido elaborado para servir a un profesional que hace de su quehacer diario un arte: el enlogo. Con el inters, por consiguiente, que fuera til en la bodega, este libro posee la ventaja de haber sido escrito por un enlogo que ha prestado servicio a un buen nmero de bodegas, que ha vivido vendimias y vinificaciones, y conocido la utilidad del control analtico sobre un producto en periodo de evolucin.
Publicado por: GAB C/ Sant Jordi, 30 - Tel. (+34) 93 817 18 42 - Fax. (+34) 93 817 14 36 08734 MOJA-OLRDOLA (Barcelona} 1 Edicin - Octubre 1990 ISBN 84-404-7827-5 Depsito Legal B-36.850/90 Diseo: NEXOS I. &S. Fotocomposicin y montaje: Peneds Edicions, S.A. - Vilafranca del Peneds Impreso por: Romany/Valls, S.A. - Capellades

Una obra como esta, no se escribe sin un buen bagaje de conocimientos. El autor que ha desarrollado sus conocimientos como tcnico analista durante muchos aos, en una Estacin de Viticultura y Enologa, concretamente en la de Vilafranca del Peneds, es claro ejemplo del servicio que estas instituciones, repartidas por todo el territorio espaol, ofrecen al sector vitivincola. En las Estaciones Enolgicas la funcin de los tcnicos, como el autor, no se circunscribe tan solo en realizar su trabajo de analista, debe tambin ejercer otras funciones: estar debidamente informado de las novedades analticas, de los problemas que vive el sector y de sus posibles soluciones, transmitir la informacin a la institucin, colaborar en los proyectos de investigacin o experimentacin y tambin, en la medida de lo posible, crear escuela.

La personalidad del autor de este libro, le ha permitido cumplir con creces muchos de estos encargos tcitos, siendo adems evidente su inquietud por ampliar conocimientos y transmitirlos, hecho que todos los que con l nos relacionamos podemos constatar. Este minucioso trabajo es tambin consecuencia de la reflexin que conlleva el conocer, profundamente, a quin va dirigido. Es fcil localizar en la memoria del lector, tres obras de este autor que han formado parte de la biblioteca de numerosos laboratorios enolgicos. Debe hacerse mencin tambin que esta obra adquiere un nivel ptimo, en cuanto a metodologas actuales en anlisis de control rutinario y de investigacin. Es decir sirve al enlogo en su labor diaria y permite, a l y a otros estudiosos, penetrar en trabajos de control mucho ms sofisticados y con tcnicas ms fiables. Se recogen en esta obra, los mtodos analticos de la mayora de compuestos que pueden formar parte de una caracterizacin enolgica, tanto aquellos que se encuentran tras un proceso normal de vinificacin como aquellos que son contaminantes, bien sean accidentales (estireno, residuos antocriptogmicos, etc.) o voluntarios (cido saliclico, edulcorantes sintticos, etc.). No estn contemplados todos los componentes del vino porque ello supondra entrar dentro del mbito de la investigacin, utilizando el anlisis como finalidad ms que como herramienta para el apoyo a la produccin. Aunque la componente prctica de la obra resalta en cualquiera de sus pginas, hace despertar en las personas ms receptivas, la inquietud hacia el mundo de la enologa y les introduce en la complejidad de los productos vitivincolas, cuyo mximo exponente es el vino, y siempre en constante evolucin bioqumica. Con relacin a sus trabajos anteriores el autor en esta obra da entrada a mtodos instrumentales: cromatografa de gases, espectrofotometra de absorcin atmica, espectrofotometra visible y ultravioleta, etc. Es decir, aquellas metodologas que ya comienzan a estar presentes en laboratorios de grandes empresas y de todos los centros oficiales. Otras tcnicas, incluida la cromatografa lquida de alta resolucin, espectrofotometra de infrarrojo, etc. han sido soslayadas por el autor y lmites de esta obra. La situacin poltica en la que est inmersa nuestra comunidad vitivincola, hace que las referencias a los mtodos oficiales, deban surgir de su misma organizacin. Por ello, todo tratado como ste, que

se precie de actual, debe recoger la metodologa analtica de la Comunidad Econmica Europea, cuyos mtodos son en su mayor parte propuestos o aprobados por la Oficina Internacional de la Via y el Vino (O.I.V.). Como toda obra de ste carcter es difcil decir que un trabajo ha salido a la luz totalmente a gusto del autor y actualizado al mximo. Sin embargo, este libro aporta una de las recopilaciones ms exhaustivas que sobre anlisis de productos vincolas se han realizado en los ltimos tiempos. Es a mi modo de entender un buen trabajo, un buen servicio a la enologa y a la analtica y un magnfico nexo de unin entre ambas.

Santiago Mnguez Sanz Estacin de Viticultura y Enologa Institut Catal de la Vinya i el Vi Vilafranca del Peneds, mayo de 1990.

Introduccin

Este libro pretende ser una ayuda al analista de vinos, enlogo y bodeguero, al presentar una serie de metdicas que han sido escogidas, de las mltiples que existen, pensando en la exactitud y sencillez de trabajo. Se ha procurado evitar las tcnicas instrumentales ms complejas, como: Resonancia Magntica Nuclear, Espectrofotometra en Infrarrojo, Radioqumica y en ella se incluiran las tcnicas con el carbono radioactivo (C14), etc. A pesar de ello, es de esperar que cumpla con la idea en la que fue concebido este libro: ser til. La disposicin de los captulos se ha efectuado por orden alfabtico de temas globales de anlisis. En cada uno de ellos se describen varias tcnicas analticas que pueden ser aplicadas segn las disponibilidades de equipo y personal. En cuanto se refiere a la distribucin de cada anlisis, se ha procurado separar perfectamente el principio del mtodo, los reactivos necesarios, la tcnica operativa y los clculos. En algunas tcnicas, se ha introducido un apartado de comentarios, para ampliar el tema tratado. Tambin se resumen algunas notas aclaratorias del autor, en el apartado de observaciones. En lo referente a reactivos, los productos que se indican debern ser de la calidad: reactivo para anlisis. Cuando se hace referencia al agua, para diluciones u otras aplicaciones, siempre se refiere a: agua destilada.

Todos los volmenes que deben medirse con exactitud, en el libro se expresan con dos decimales, por ejemplo: 10.00 mL. Al final del texto, se recogen una serie de tablas que pueden ser de gran ayuda para el lector. He de agradecer, sobremanera, a D. Santiago Minguez Sanz, Doctor Ingeniero Agrnomo, Director de la Estacin de Viticultura y Enologa de Vilafranca del Peneds, el aceptar presentar esta humilde aportacin, a la ardua labor del analista.

INDICE GENERAL
ACIDEZ ACIDOS ADITIVOS QUIMICOS ALCOHOLES AZUCARES CARACTERISTICAS CROMATICAS COMPUESTOS CARBONILICOS COMPUESTOS FENOLICOS COMPUESTOS NITROGENADOS ESTERES GASES METALES OTROS COMPUESTOS REGLAS ENOQUIMICAS SOLIDOS SOLUBLES UNIDADES INTERNACIONALES PESTICIDAS Y FUNGICIDAS TABLAS CAPITULO 1 CAPITULO 2 CAPITULO 3 CAPITULO 4 CAPITULO 5 CAPITULO 6 CAPITULO 7 CAPITULO 8 CAPITULO 9 CAPITULO 10 CAPITULO 11 CAPITULO 12 CAPITULO 13 CAPITULO 14 CAPITULO 15 CAPITULO 16 CAPITULO 17

El Autor

3. ADITIVOS QUIMICOS

DIOXIDO DE AZUFRE METODO USUAL DE LA C.E.E. METODO CEE referencia METODO SCHNEYDER Y VLCEK METODO REBELEIN destilacin METODO HEIKE Y KREISEL METODO ENZIMATICO SORBICO Y SORBATOS METODOS C.E.E. CEE. Espectrofotometra ultravioleta CEE. Anlisis colorimtrico CEE. Cromatografa en capa fina METODO BERTRAND Y SARRE METODO RAPIDO SALICILICO METODO BERTRAND Y SARRE METODO DE LA A.O.A.C TEST DE JORRINSEN ACIDO BENZOICO METODO JAULMES METODO COLORIMETRICO VARIOS ACIDOS METODO GAS CROMATOGRAFICO CLOROPICRINA METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS FERROCIANURO Y CIANURO METODO DE LA CEE METODOS USUALES CEE METODO ADDEO, NOTA Y CHIANESE METODO COLORIMETRICO BETAINA METODO CENCI Y CREMONINI ANTIFERMENTOS METODO BIOLOGICO GAROGLIO STELLA ISOTIOCIANATO DE ALILO METODO UNICO DE LA CEE METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS

3.5 3.6 3.9 3.12 3.13 3.15 3.16 3.18 3.19 3.19 3.21 3.23 3.25 3.26 3.28 3.28 3.30 3.31 3.32 3.32 3.34 3.37 3.37 3.40 3.40 3.43 3.43 3.45 3.49 3.51 3.53 3.53 3.56 3.56 3.58 3.58 3.60 3.3

CUMARINA METODO DYER Y MARTIN EDULCORANTES SINTETICOS METODO CROMATOGRAFICO EN CAPA FINA - ASARONA METODO WOJTOWICZ METODO A.O.A.C ESTIRENO METODO BRUN Y GIFFONE METODO POR ABSORCION EN EL UV METATARTARICO METODO COLORIMETRICO ACIDO OXALICO METODO HENNING Y LAY METODO ENZIMATICO

3.63 3.63 3.66 3.66 3.70 3.70 3.72 3.74 3.74 3.76 3.78 3.78 3.80 3.80 3.81

Dixido de azufre

COMENTARIOS
Desde muy antiguo, se emplea el dixido de azufre como antisptico en los vinos. Su utilizacin se inici con la combustin del azufre. En la prctica, para poder efectuar una perfecta dosificacin, se hace uso del metabisulfito potsico, dixido de azufre comprimido en tubos o soluciones acuosas de sulfuroso. La aplicacin de este producto en enologa, no es slo por su accin antisptica, sino tambin por su fuerte poder reductor. Algunas levaduras son muy sensibles al S02, otras pueden resistirlo. Las bacterias del vino, no lo toleran y son eliminadas totalmente. En vinos tintos, la presencia de 80 mg de S02, por litro, son suficientes para inhibir el crecimiento de las bacterias malolcticas. Al aadir el dixido de azufre al vino, aquel reacciona con el etanal, para formar un complejo de bisulfito. Tambin reacciona con la funcin aldehdica de los azcares, principalmente la glucosa, y con compuestos fenlicos, como los cidos cafico y cumrico. Los lmites legales del dixido de azufre, son distintos segn los pases y tambin segn tipos de vino. Espaa permite para vinos blancos y rosados, con menos de 5 g de azcares/L, 210 mg/ L de dixido de azufre total. Vinos tintos y claretes con azucar inferior a 5 g/L, 160 mg/L, de S02. Vinos con ms de 5 g azcares por litro: blancos y rosados, 260 mg/L; tintos y claretes, 210 mg/L.

3.4

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En el momento de embotellar, son suficientes de 20 a 30 mg de SO2 por litro, en forma libre. Cuando se aade sulfuroso a un vino, con el tiempo, hay un progresivo aumento de la acidez fija, por esta razn, se recomienda el empleo de metabisulfito potsico, en vez del S02 procedente de tubos o de soluciones acuosas, para evitar tal defecto. El cuidado con la muestra y la toma de la misma, es de extrema importancia para su anlisis. El dixido de azufre es una sustancia muy voltil que se elimina o transforma muy fcilmente a la temperatura ambiente, si la muestra est expuesta al aire. La recogida de la muestra debe hacerse, previa una buena mezcla en el recipiente que la contiene, y conservarla en un frasco perfectamente tapado hasta el momento del anlisis. Pocos minutos de exposicin al aire, de la muestra pipeteada, pueden causar importantes prdidas de SO2. Ciertas sustancias del vino son tambin oxidadas por el iodo, en medio cido, como tiene lugar en la determinacin directa sobre el vino. El volumen de iodo 0.025 M (0.05 N), gastado para oxidar estas sustancias, es del orden de 0.3 mL para los vinos blancos, esta cifra es mayor en los tintos.

ENGRUDO DE ALMIDON a 2.5g/L. En un mortero, se mezclan ntimamente, 2.5 gramos de almidn y 10 miligramos de ioduro mercrico y una pequea cantidad de agua, de manera que quede una pasta fluida. Introducirla en un litro de agua en plena ebullicin y mantenerla durante 10 minutos. Cuando est fro se filtra. SOLUCION DE IODO 0.025 M (0.05 N). EDTA Tcnica operativa 1. En un erlenmeyer de 500 mL, se colocan 50.00 mL de vino, 3 mL de cido sulfrico al 1/10, 5 mL de engrudo de almidn y 30 mg de EDTA. 2. Valorar inmediatamente, con la solucin de iodo 0.025 M, hasta que la coloracin azul persista durante 10 a 15 segundos. Sea n el nmero de mililitros de solucin de iodo gastados. 3. Se aaden 8 mL de solucin de hidrxido sdico 4 M, agitar una sola vez y dejar en reposo 5 minutos.

METODO USUAL DE LA CEE

4. Verter con rapidez y agitando enrgicamente, 10 mL de cido sulfrico al 1 /10, que se tenan preparados en un pequeo vaso. Valorar inmediatamente con iodo 0.025 M. Sea n' el volumen de iodo empleado. 5. Aadir 20 mL de solucin de hidrxido sdico 4 M, dejar reposar 5 minutos, previa agitacin una sola vez. Diluir con 200 mL de agua destilada muy fra. Con agitacin enrgica, verter con rapidez 30 mL de cido sulfrico 1/10, contenidos en un vaso. 6. Valorar con el iodo 0.025 M. Sea n" el volumen gastado de iodo. Clculos El valor de n, se halla segn se indica en la observacin a). SO2 libre = 32 (n - n"') en mg/L. SO2 combinado = 32 (n' + n) en mg/L. SO2 total = 32 (n + n'' n''') en mg/L. 3.7

Principio del mtodo Dixido de azufre libre. Valoracin iodomtrica directa. Dixido de azufre combinado. Valoracin iodomtrica, despus de la hidrlisis alcalina sobre el vino. Este valor, aadido al dixido de azufre libre, indica el dixido de azufre total de la muestra. Reactivos SOLUCION HIDROXIDO SODICO 4 M, (160 g / L) ACIDO SULFURICO AL 1/10 en volumen.

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Observaciones
a) Ya que ciertas sustancias son oxidadas con el iodo en medio cido, es necesario, para efectuar un anlisis ms preciso, determinar la cantidad de iodo empleado en estos productos. Para ello, se combina el dixido de azufre libre, con un exceso de etanal o propanal, antes de la valoracin con iodo como se indica a continuacin: A 50 mL de vino, colocados en un erlenmeyer de unos 250 mL, aadir 5 mL de solucin de etanal a 7 g/L 5 mL de solucin de propanal a 10 g/L. Tapar y dejar en reposo 30 minutos, por lo menos. Aadir 3 mL de cido sulfrico al 1/10 y valorar con iodo 0.025 M, en cantidad necesaria para hacer virar el engrudo de almidn. Sea n''' el volumen de iodo empleado. El volumen n''' es pequeo, del orden de 0.2 a 0.3 mL de iodo 0.025 M. Si el vino ha sido adicionado de cido ascrbico, n"' es mucho ms elevado y se puede medir, aunque aproximadamente, la cantidad de este producto. Debe tenerse en cuenta que 1 mL de iodo 0.025 M equivale a 4.4 miligramos de cido ascrbico. Con la medicin de n"', se puede evaluar si un vino ha sido adicionado de cido ascrbico en cantidad superior a 20 mg/L. b) Para el anlisis en los vinos tintos, con bajo contenido de sulfuroso, es interesante emplear la solucin de iodo ms diluida, por ejemplo una de 0.01 M. En este caso, hay que reemplazar el factor 32 por 12.8, en las frmulas anteriores. c) En el anlisis de los vinos tintos, es ventajoso iluminar el vino por la parte inferior, con una luz amarilla procedente de una lmpara de vapor de sodio. Colocar en una cmara oscura y observar la transparencia del vino, ya que cuando ha virado el engrudo de almidn, aparece opaco. La forma de comprobar el punto final de la valoracin, es el empleo de un electrodo de platino y un medidor de pH, en la posicin de milivoltios, y efectuar la lectura del cambio de redox. Tambin, y ms perfecto es la utilizacin de un titulador electrnico. d) Cuando la cantidad obtenida en el anlisis, se acerca o sobrepasa el lmite legal, es necesario determinar el dixido de azufre por el mtodo de referencia.

e) Si el inters particular se centra en el contenido del dixido de azufre libre, se ha convenido determinarlo en una muestra mantenida tapada durante cuatro das a la temperatura de 20 C, antes del anlisis. Este ser efectuado a la misma temperatura.

METODO CEE referencia

Principio del mtodo El dixido de azufre es arrastrado por una corriente de aire o de nitrgeno, fijado y oxidado, por borboteo, sobre una solucin diluda y neutra de perxido de hidrgeno. El cido sulfrico formado, se neutraliza con una solucin valorada de hidrxido sdico. El dixido de azufre libre se extrae del vino, por arrastre en fro (10 C). El sulfuroso total se extrae igualmente, pero a la temperatura de 100 C aproximadamente. Aparato El aparato debe estar formado de acuerdo al esquema que se adjunta, en particular en lo que se refiere al refrigerante. El tubo de desprendimiento de gas en el borboteador, debe estar terminado con

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un vidrio poroso, con objeto de que se formen un gran nmero de pequeas burbujas, para lograr un contacto ntimo entre la fase gaseosa y la lquida. La velocidad del paso de gas o aire, debe estar regulado a 40 litros por hora. El frasco de la derecha, est destinado a limitar la depresin de la trompa de agua a unos 20-30 cm. Reactivos ACIDO FOSFORICO al 85%. SOLUCION DE PEROXIDO DE HIDROGENO a 9.1 g de H2O2 por litro (3 volmenes). SOLUCION DE INDICADOR preparado en un matraz aforado de 100 mL con 100 mg de rojo de metilo, 50 mg de azul de metileno y alcohol al 50% hasta completar el volumen. HIDROXIDO SODICO 0.01 M. Tcnica operativa Anlisis del dixido de azufre libre 1. El vino debe estar en un frasco lleno y tapado, a la temperatura de 20 C, durante cuatro das antes del anlisis. 2. En el matraz A de 250 mL del aparato de arrastre, se colocan 50.00 mL de la muestra y 15 mL de cido fosfrico. 3. Se coloca el matraz en el conjunto del aparato. 4. En el borboteador B, se colocan 2 3 mL de la solucin de perxido de hidrgeno, dos gotas del indicador y neutralizar la solucin del agua oxigenada con hidrxido sdico 0.01 M. 5. Se adapta el borboteador al aparato. 6. Hacer pasar el aire o nitrgeno, durante 15 minutos. 7. Retirar el borboteador del aparato y valorar el cido formado, con el hidrxido sdico 0.01 M. Sea n el nmero de mililitros gastados. Clculos Para hallar el contenido de dixido de azufre libre, se aplica la frmula: 6.4xn miligramos por litro.

Tcnica operativa Anlisis del dixido de azufre total. 1. En el caso de que la concentracin de SO2 en la muestra sea igual o menor de 50 mg/L, se toman 50.00 mL de la muestra y 15 mL de cido fosfrico. 2. Si la concentracin de la muestra es superiora 50 mg/L, en el matraz A de 100 mL se colocan 20.00 mL de la muestra y 5 mide cido fosfrico. 3. Colocar en el borboteador B, 2 3 mL de perxido de hidrgeno, se neutraliza como se ha indicado anteriormente. 4. Llevar a ebullicin el vino contenido en el matraz A, por la accin de una llama de unos 4 cm de altura que toque en el fondo del matraz. Se recomienda colocar un disco metlico con un orificio de 30 mm, para evitar la pirogenacin de las materias extractivas del vino, en las paredes del matraz. 5. Mantener la ebullicin y el paso del gas, durante 15 minutos. En este tiempo todo el dixido de azufre ha sido extrado y oxidado. 6. Valorar el cido formado en el borboteador B, con hidrxido sdico 0.01 M. Sea n el volumen gastado de reactivo. Clculos En el caso de que se haya empleado un volumen de muestra de 50.00 mL, la frmula es la siguiente: 6.4xn. Si la toma de muestra ha sido de 20 mL, se aplicar el factor 16 en vez de 6.4.

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METODO SCHNEYDER Y VLCEK

Si se emplea otra molaridad del iodato potsico, se puede hallar el contenido de sulfuroso libre, de acuerdo a la siguiente frmula: V x N x 32 x 1000 V en donde: v' = volumen de la muestra empleada para el anlisis. N = normalidad de iodato potsico. Debe tenerse en cuenta la equivalencia de la molaridad y normalidad (1 M = 6 N). V = volumen de la solucin de iodato gastada.

Principio del mtodo Exclusivamente para el dixido de azufre libre. Es una metdica muy similar al mtodo de Ripper, pero emplea solucin de iodato potsico para la valoracin, en vez del iodo, por su mayor estabilidad. Se aade al vino un exceso de ioduro potsico y entonces se valora con iodato. Tan pronto como exista un exceso de iodo, el engrudo de almidn presente lo pone de manifiesto, por su cambio de color. Comparativamente con el mtodo de Ripper, se le considera mejor.

Reactivos SOLUCION ALMIDON-IODURO POTASICO, preparada por disolucin de 10 gramos de ioduro potsico y 2.5 gramos de almidn soluble, con agua destilada hasta un litro. SOLUCION DE IODATO POTASICO. Disolver 0.11135 gramos de iodato potsico en 200 mL de cido sulfrico 1 M y llvese a volumen de un litro con agua destilada. Es una solucin 0.0005203 M. Tcnica operativa 1. En un erlenmeyer de 250 mL, se colocan unos 50 mL de agua destilada, 10.00 mL de la muestra de vino o mosto a analizar y 2 mL de la solucin de almidn-ioduro y se valora con la solucin de iodato, hasta persistencia azul del almidn. Clculos El contenido en miligramos de sulfuroso libre, por litro de vino, es igual al volumen de iodato gastado, multiplicado por 10 (1 mL= 10 mg/L).

METODO REBELEIN destilacin

Principio del mtodo

Se fundamenta en la destilacin del dixido de azufre total contenido en la muestra, recogiendo el destilado en una solucin de ioda-

1. J. Schneyder y G. Vicek. Versuchsanst Wein-Obstbau (Klosterneuburg), 27 pginas 87-88, (1977).

2. H. Rebelein, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm., 2, pginas 112-121, (1973).

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to potsico. La destilacin del SO2 total se desarrolla ms rpidamente en cido sulfrico, que en cido fosfrico. Con la ayuda de un destilador con fraccionamiento, es posible destilar cuantitativamente el dixido de azufre total, en un tiempo de 3 a 4 minutos. Una modificacin del aparato, introducida por GAB, permite disponer en una sola unidad, el destilador y la placa calefactora proyectada para este fin. Reactivos SOLUCION DE IODATO POTASICO, 111.4 mg en agua hasta un litro. ME TANOL. INDICADOR DE ALMIDON, al 1 %. ACIDO SULFRICO al 20%. SOLUCION TIOSULFATO SODICO, 1.5512 g disueltos en un litro de agua. Tcnica operativa 1. El aparato destilador GAB, deber estar dispuesto para el trabajo, no es necesaria agua de refrigeracin. Previamente la placa calefactora se tendr conectada, con objeto de que alcance la temperatura de trabajo (unos 20 minutos). 2. En un erlenmeyer de 250 mL se vierten 50.00 mL de la solucin de iodato. 3. En el erlenmeyer de 100 mL, se colocan 2 mL de metanol, un poco de piedra pmez, 10.00 mL de la muestra de vino, procurando que la punta de la pipeta se halle apoyada en la pared del erlenmeyer (para que la muestra resbale por la misma) y 10 mL de cido sulfrico. 4. Se monta en el destilador y se coloca el erlenmeyer sobre el calefactor, con el tubo de salida sumergido en el erlenmeyer que contiene la solucin de iodato. 5. Iniciada la ebullicin, se cuenta un tiempo de cinco minutos. 6. Transcurrido el tiempo, se levanta el destilador y se enjuaga con agua destilada la punta del mismo.

7. Se enfra rpidamente el erlenmeyer al chorro de agua. 8. Cuando fro, se aaden 10 mL de solucin de indicador de almidn y 10 mL de solucin de cido sulfrico. 9. Se valora con la solucin de tiosulfato, hasta desaparicin del color azul-violceo. 10. El contenido se lee directamente de la bureta que ha sido graduada en mg de dixido de azufre por litro. Observaciones a) Es absolutamente necesario seguir el orden de adicin de los reactivos, tal como se indican en la tcnica operativa. b) Como en toda valoracin, es recomendable la adicin del lquido de la bureta con cierta lentitud al acercarse al punto de equivalencia, con el fin de detener la misma en el momento exacto.

METODO HEIKE Y KREISEL

Principio del mtodo

Es un mtodo para determinar el sulfuroso total. Comparativamente es tan exacto como el mtodo oficial alemn, con la ventaja de permitir el automatismo en su aplicacin. Se basa en la combinacin del SO2 con cloruro mercrico, para formar un compuesto, que reacciona con la pararrosanilina, en medio cido y formaldehdo, para dar un producto coloreado, cuya medicin puede realizarse a 570 nm con el espectrofotmetro. Reactivos SOLUCION TETRACLOROMERCURATO SODICO. Se prepara disolviendo 27.2 gramos de cloruro mercrico y 11.7 gramos de cloruro sdico, en agua destilada, completando el volumen a un litro.

3. E. Heike y A. Kreisel, Z Anal. Chem., 285, pginas 39-42, (1977).

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SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 0.1 M. SOLUCION FORMALDEHIDO, preparada con 5 mL de formol del 40%, diluido a un litro de agua destilada. SOLUCION DE PARARROSANILINA, por disolucin de 100 mg de pararrosanilina, disueltos en 40 mL de cido clorhdrico concentrado. Se lleva a volumen de 250 mL con agua destilada y se deja en reposo durante una noche. Tcnica operativa 1. En un matraz de 100 mL, se aaden 5.00 mL de la muestra de vino, 1 mL de solucin de tetracloromercurato, 10 mL de hidrxido sdico 0.1 M y se completa a volumen con agua destilada. 2. Se toman 5.00 mL de esta disolucin y se pasan a un matraz de 50 mL, al que se aaden 5 mL de solucin de formaldehdo y 5 mL de solucin de pararrosanilina, se completa a volumen con agua destilada y se deja 8 minutos en bao de agua a 20 C. 3. Se mide la absorbancia, en una cubeta espectrofotomtrica de 10 mm de paso de luz, a 570 nm de longitud de onda, en comparacin con un ensayo en blanco, con todos los reactivos menos el vino. El color de la muestra es estable durante 30 minutos. Clculos Se prepara una curva de calibracin, frente a la que se comparan las lecturas de las absorbancias de las muestras.

dinucletido (NADH) por la enzima NADH-peroxidasa. La cantidad de NADH consumida, en esta reaccin, es equivalente a la cantidad de sulfito libre o tambin al sulfito combinado con el aldehdo. Reactivos Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmero 725854, para 40 determinaciones. Contiene 5 frascos con reactivos, que se usarn, algunos previa reconstitucin con agua destilada. La conservacin y forma de reconstituir, se indica en el folleto que acompaa a cada test analtico. Tcnica operativa 1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, de plstico para un solo uso. El espectrofotmetro con lmpara de tungsteno, se prepara para leer a la longitud de onda de 340 nm. 2. Si la cantidad de dixido de azufre no sobrepasa los 300 miligramos/L, no es necesario efectuar dilucin alguna de la muestra de vino. 3. El anlisis se efecta siguiendo las instrucciones detalladas en el folleto explicativo, que acompaa a cada test. Clculos Una vez hallada la diferencia de absorbancias, la concentracin de dixido de azufre se calcula por: SO2 = 0.3213 x As en gramos por litro deber tenerse en cuenta el factor de dilucin, en el caso que haya sido hecha.

METODO ENZIMATICO
Principio del mtodo El sulfito (cido sulfuroso) se oxida a sulfato en presencia de oxgeno, a travs de sulfito-oxidasa. El perxido de hidrgeno formado en esta reaccin se reduce en presencia de la nicotinamid-adenin-

Observaciones En el caso de analizar vinos tintos, es necesario efectuar el siguiente tratamiento: Se colocan en un matraz aforado de 50 mL, 25.00 mL de vino y se neutralizan a pH 7.5-7.8 con hidrxido sdico 2 M y se completa a volumen con agua destilada (factor de dilucin = 2). Mantenerlo durante 10 minutos a la temperatura ambiente. Utilcese 0.1 mL para el anlisis.

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Srbico y sorbatos

METODOS CEE

Principio del mtodo El cido srbico (constante de volatilidad = 0.59), arrastrado por el vapor de agua, se determina en el destilado. La eliminacin de las sustancias que puedan enmascarar el anlisis, se efecta por evaporacin a sequedad del destilado, ligeramente alcalinizado por el agua de cal. Tanto es aplicable para la espectrofotometra de absorcin en el ultravioleta, como para la colorimetra despus de la oxidacin a aldehdo malnico, que se condensa con el cido tiobarbitrico, para dar una coloracin rosa. Valores inferiores a 20 mg/L, deben confirmarse con la cromatografa en capa fina, cuya sensibilidad es de 5 mg/L. Obtencin del destilado. Se prepara el destilado como se ha indicado para la determinacin de la acidez voltil, recogiendo 320-330 mL, a partir de 20.00 mililitros de muestra de vino, adicionado de 1 a 2 gramos de cido tartrico, con el objeto de efectuar la extraccin total del cido srbico.

COMENTARIOS

Este cido ha sido aceptado como aditivo al vino, para inhibir el crecimiento de las levaduras. El cido srbico no tiene accin contra las bacterias, antes bien, a las dosis normales de empleo, favorece apreciablemente, el desarrollo de las bacterias acticas. Debe ser empleado en cantidad suficiente, para actuar como antifermento, ya que si no es as, es totalmente intil su adicin. No es eficaz cmo antifermento, en los mostos o zumos de uva. Su utilidad principal, se destina a vinos embotellados, empleado en concentraciones de 150 a 200 mg/L, ya que existe una accin sinrgica con el alcohol del vino, ms acentuada en los vinos con bajo pH. En la prctica se hace uso de la sal potsica, ya que el cido es muy poco soluble en agua. El cido srbico, como tal, no tiene olor, sin embargo, s aparece lentamente un olor cuando hay una accin bacteriana y, en este caso, es un olor desagradable. Favorece el fenmeno de oxidacin, conocido por maderizado del vino. Para evitarlo, siempre debe emplearse conjuntamente con dixido de azufre y cido ascrbico. La cantidad mxima permisible, para su aplicacin al vino, difiere segn los pases. En Espaa y la CEE, la concentracin mxima admitida es de 200 miligramos de cido srbico por litro de vino. 3.18

CEE. Espectrofotometra ultravioleta

Reactivos AGUA DE CAL, aproximadamente 0.02 M. SOLUCION DE SULFATO DE COBRE, preparada por disolucin de 50 miligramos de sulfato de cobre pentahidrato, reactivo anlisis, 0.1 mL de cido sulfrico concentrado puro, y agua destilada hasta completar un litro. SOLUCION DE ACIDO SORBICO a 20 mg/L, preparada disolviendo en un matraz de un litro, 20 miligramos de cido srbico puro, con unos 900 mL de agua caliente, agitar. Enfriar y completar a volumen con agua destilada. Tambin puede prepararse por disolucin de 26.8 miligramos de sorbato potsico, en un litro de agua fra. 3.19

Tcnica operativa 1. En una cpsula de 55 mm de dimetro, colocar 5.00 mL del destilado, aadir 1 mL de agua de cal lmpida y una gota de solucin de sulfato de cobre. 2. Evaporar a sequedad en bao mara hirviente. Tomar el residuo con agua destilada y llevarlo a un matraz de 20 mL y completar a volumen con agua. 3. Medir la absorbancia, con cubetas de cuarzo, de paso de luz de 10 mm, a 256 nm, comparativamente con un ensayo en blanco, Este se prepara con 1 mL de agua de cal, una gota de solucin de sulfato de cobre y agua hasta 20 mL. 4. Las lecturas se comparan frente a una grfica obtenida por soluciones patrn, de concentraciones: 0.5, 1.0, 2.5 y 5.0 miligramos de cido-srbico por litro. La absorbancia se mide en comparacin con agua destilada. Estas soluciones se obtienen, por dilucin adecuada de la solucin base de 20 mg/L. Clculos Sea e, la cantidad en miligramos/litro de cido srbico que contiene la solucin colocada en la cubeta, por comparacin espectrofotomtrica con la grfica. Si V mL es el volumen (prximo a 330 mL) del destilado obtenido a partir de 20.00 mL de la muestra de vino, el contenido ser: 0.2 x e x V miligramos de cido srbico por litro. En el supuesto de que se recojan exactamente 330 mL de destilado, la frmula para el clculo es 66xe miligramos por litro. Si la concentracin en cido srbico es igual o inferior a 20 mg/L, es necesario proceder a una cromatografa en capa fina de la muestra. Si la presencia viene confirmada, proceder de la siguiente forma: Tomar 50.00 mL del destilado. Colocar ste volumen en una cpsula con 3 mL de agua de cal lmpida y 5 gotas de solucin de sulfato de cobre. Evaporar a sequedad en bao mara. Tomar el residuo con agua destilada y llevarlo a volumen de 20.00 mL. Agitar y continuar el anlisis, como se ha indicado anteriormente, sobre 5.00 mL 3.20

del destilado concentrado. Sean e los miligramos de srbico que contiene la solucin del destilado, concentrado 2.5 veces, que se han
colocado en la cubeta. Si V es el volumen (casi 330 mL del destilado obtenido, a partir de 20.00 mL de muestra, la concentracin en el vino ser: 0.02 x e x V miligramos de cido srbico por litro.

CEE. Anlisis colorimtrico

Reactivos AGUA DE CAL 0.02 M aproximadamente. ACIDO SULFRICO 0.5 M. SOLUCION DICROMATO POTASICO 0.05 M. ACIDO TIOBARBITURICO solucin al 0.2% (p/v). Se disuelven, en un matraz de 100 mL, 200 mg de cido tiobarbitrico con agua, a temperatura de 60-80 C. Cuando fro enrasar con agua destilada a volumen. La solucin debe estar perfectamente lmpida. En caso contrario filtrarla. Debe prepararse extemporneamente. SOLUCION DE ACIDO SORBICO a 20 mg/L. En un matraz aforado de un litro, con 900 mL de agua destilada caliente, se vierten 20 miligramos de cido srbico puro. Agitar hasta disolver perfectamente. Se deja enfriar y se lleva a volumen con agua. Puede tambin prepararse con 26.8 mg de sorbato potsico.
Tcnica operativa 1. Colocar en una cpsula, 5.00 mL del destilado, aadir despus 1 mL de agua de cal lmpida. Evaporar a bao mara hirviente. 2. Tomar el residuo con agua destilada y llevarlo a volumen de 10 mL, con las aguas de lavado de la cpsula. Agitar.

3.21

3. En un tubo de ensayo, colocar: 1 mL de este ltimo lquido obtenido, 1 mL de agua destilada, 1 mL de solucin de cido sulfrico 0.5 M y 0.2 mL de solucin 0.05 M de dicromato potsico. 4. Colocar este tubo en un bao mara hirviente, durante 5 minutos exactamente. Enfriar bruscamente el tubo en un bao de agua con hielo, aadir seguidamente 2 mL de solucin de cido tiobarbitrico al 0.2%. 5. Llevar de nuevo al bao mara durante 10 minutos exactos. Enfriar en agua con hielo. Aparecer una coloracin rosa, cuya absorbancia debe medirse dentro de los 10 minutos siguientes a la salida del bao mara y con el lquido completamente fro. 6. El tiempo de calentamiento y el empleo del agua con hielo, debe observarse escrupulosamente, ya que, en caso contrario, la intensidad de la coloracin se modifica. Tambin a la temperatura ordinaria, la coloracin va evolucionando continuamente. Medir la absorbancia de la solucin a 532 nm, en comparacin a un testigo preparado con 2 mL de agua destilada, adicionada de las mismas cantidades de los reactivos indicados anteriormente. 7. Se compara la absorbancia, con la grfica preparada con soluciones de cido srbico puro, de las siguientes concentraciones: 0.5, 1.0, 2.5 y 5 miligramos de cido srbico por litro, preparadas a partir de la solucin de cido srbico de 20 mg/L. Un mililitro de estas diluciones, se trata exactamente igual como el lquido destilado. Clculos Sean e los miligramos de cido srbico por litro que contiene la solucin situada en la cubeta espectrofotomtrica. Si V es el volumen (cercano a 330 mL) del destilado obtenido a partir de 20.00 mL de vino, ste contendr: 0.1 x e x V miligramos de cido srbico por litro. Si se han recogido exactamente 330 mL de destilado, el clculo ser: 33xe miligramos de cido srbico. En el caso de que la concentracin de cido srbico sea igual o inferior a 20 mg/L, se comprobar, por cromatografca en capa fina, la presencia de cido srbico. Si es as, se toman 50.00 mL del desti-

lado y se colocan en una cpsula, a la que se aaden 3 mL de agua de cal lmpida y se evapora a sequedad a bao mara hirviente. Se toma el residuo con agua y se completa el volumen a 20 mL. En un tubo se introducen: 1 mL del destilado concentrado 2.5 veces, 1 mL de agua destilada, 1 mL de cido sulfrico 0.5 M y 0.2 mL de solucin de dicromato potsico 0.05 M. Se contina el anlisis como antes se ha indicado.

CEE. Cromatografa en capa fina

Principio del mtodo El cido srbico se extrae con ter, del vino previamente acidificado. Luego tiene lugar una separacin cromatogrfica, en capa fina, con polvo de poliamida. Se pone de manifiesto la presencia del cido mediante radiacin ultravioleta. Reactivos ETER ETILICO. METANOL. ALCOHOL ETILICO 96%. SOLUCION DE ACIDO SULFURICO al 20 % (v/v). SULFATO SODICO ANHIDRO. POLVO DE POLIAMIDA CROMATOGRAFICO, Merck. INDICADOR FLUORESCENTE F 254, Merck. DISOLVENTE. Preparado con 20 partes de pentano, 20 partes de exano y 3 partes de cido actico. SOLUCION PATRON, 0.1 gramos de cido srbico en 100 mL de alcohol de 96%.

3.22

3.23

Aparatos Dispositivos para colocar las placas cromatogrficas. Placas de vidrio de 20 x 20 cm Preparacin de las placas: Mezclar ntimamente en seco, 12 g de polvo de poliamida con 0.3 g del indicador fluorescente, aadir agitando continuamente, 60 mL de metanol. Colocar sobre las placas de forma muy uniforme, con un espesor de 0.3 mm. Secar a temperatura ambiente. Preferible a la preparacin indicada anteriormente, se recomienda el empleo de cromatoplacas de plstico de la firma Merck, de 20 x 20 cm, que incorporan la poliamida y el indicador, estando ya dispuestas para la colocacin de las muestras. Tcnica operativa 1. Se colocan en un tubo de decantacin de unos 200 mL, 50 mL de la muestra de vino. 2. Se acidifica con cido sulfrico al 20%, y se extrae por tres veces con ter, empleando cada vez 20 mL. 3. Reunir las soluciones etreas en otro embudo de decantacin y lavar con unos 10 mL de agua destilada. 4. Secar el extracto etreo con sulfato sdico anhidro. 5. Evaporar el ter a sequedad, a baja temperatura. Si la evaporacin se efecta en bao mara, conviene ayudar con una corriente de aire hasta casi un residuo de unos 3 mL, y terminar luego, la evaporacin en fro. 6. El residuo se disuelve con 1 mL de etanol. 7. Se colocan en las placas, de 3 a 5 microlitros de esta solucin. 8. Las placas se colocan en la cubeta cromatogrfica, saturada de vapores del disolvente, tapar y dejar ascender el disolvente hasta una altura de 15 cm. Aproximadamente se necesitan unas dos horas, dependiente de la temperatura ambiente. 9. Se retira la placa y se deja secar. De inmediato se observa a la radiacin ultravioleta, en la longitud de onda de 254 nm.

10. El cido srbico presenta una mancha oscura sobre fondo verde-amarillo, fluorescente. Esta tcnica permite la deteccin de 5 miligramos de cido srbico por litro de muestra.

METODO BERTRAND Y SARRE

Principio del mtodo

Es una tcnica gas cromatogrfica, que presenta la ventaja de la rapidez, automatizacin e incluso, la inyeccin directa del vino. Se efecta una determinacin cuantitativa, en comparacin con un patrn interno. Aparatos Es necesario disponer de un cromatgrafo de gases con detector F. I. D., conjuntamente con registrador integrador. Las columnas sern de acero inoxidable, de 4 metros de longitud y 1/8 de pulgada de dimetro. El relleno se prepara con succinato de dietilenglicol (DEGS) 5% ms 1 % de cido fosfrico, sobre Gaschrom Q de 80-100 mallas. Tambin puede sustituirse este relleno por otro con la siguiente fase estacionaria: 1 % adipato de dietilenglicol ms 1 % de cido fosfrico sobre el mismo soporte. Purgar la columna a 200 C, durante una noche. Tcnica operativa 1. Se emplear un patrn interno, con objeto de obtener mayor precisin en las determinaciones. Este patrn interno es el cido undecanoico, cuyo tiempo de retencin es vecino al del cido srbico. Se prepara dicho patrn con 1 gramo, disuelto en un litro de alcohol de 96%. 2. En un tubo de ensayo de un volumen aproximado de 40 mL, se colocan 20.00 mL de vino, 2 mL de la solucin de patrn interno y 1 mL de cido sulfrico al tercio. Se agita.

4. A. Bertrand y C. Sarre, Connaiss. Vigne Vin, 9, pginas 267-272, (1975).

3.24

3.25

3. Se aaden 10 mL de ter etlico. La extraccin se efecta por agitacin del tubo, durante 5 minutos. Se deja en reposo para que se separen las dos fases liquidas. 4. De la fase superior, etrea, se toman 2 microlitros para inyectar en el cromatgrafo. 5. Los parmetros de trabajo del cromatgrafo, son los siguientes: temperatura de la columna, isotrmica, 175 C; inyector y detector, 200 C, flujo de nitrgeno 30 mL por minuto. 6. Para poder efectuar el anlisis cuantitativo, es necesario preparar un patrn de referencia. Para ello se emplea un vino totalmente exento de cido srbico, al que se aaden 100 miligramos de cido srbico puro (134 mg de sorbato potsico), a un litro. 7. Este patrn se trata como se ha indicado anteriormente para la muestra de vino y, el rea del pico, ser la que servir de comparacin con las muestras analizadas. Clculos Vienen dados por el integrador, una vez efectuado el anlisis cromatogrfico. El tiempo total empleado en el anlisis, es de unos 20 minutos

Tcnica operativa 1. En un tubo de ensayo se colocan 0.100 mL de vino y 0.050 mL de cido fosfrico concentrado. Agitar bien. 2. Se aaden 4 mL de isooctano y se agita bien durante un minuto. 3. Dejar en reposo durante 10 minutos, para que se separen las capas. 4. La capa de isooctano es la que se coloca en la cubeta de cuarzo de 10 mm de paso de luz, y leer la absorbancia en el espectrofotmetro a 254 nm. 5. Efectuar un anlisis en blanco y con dos patrones de 10 mg/L de cido srbico. Observaciones Si el vino supera los 100 mg/L, es necesario diluirlo a la mitad con agua destilada, antes de efectuar el anlisis.

METODO RAPIDO
Principio del mtodo

Anlisis espectrofotomtrico en el ultravioleta. Reactivos ACIDO FOSFORICO concentrado. ISOOCTANO.

5. R. Viader Guix, Viader Anlisis, 08770 Sant Sadurn d'Anoia (Barcelona).

3.26

3.27

Saliclico

nato de dietilenglicol (DEGS) y cido fosfrico, en la proporcin de 5% y 1 % respectivamente, sobre soporte de Gaschrom Q de 80/100 mallas. Tcnica operativa 1. En un tubo de ensayo, con tapn esmerilado, se introducen 20.00 mL de vino objeto de anlisis, 2.00 mL de patrn interno y 1 mL de cido sulfrico diluido. Se mezcla bien. 2. Se aaden 10 mL de ter. Se agita durante 5 minutos. 3. La fase etrea se separa y se evapora hasta reduccin del volumen a 0.5 mL. De este lquido se toma 1 microlitro, para inyectar en el cromatgrafo.

METODO BERTRAND Y SARRE

4. La temperatura de la columna debe estar a 170 C, en programacin isotrmica. 5. El inyector y detector deben estar a 300 C.

Principio del mtodo Las condiciones de extraccin son las mismas que las del cido srbico. Estos cidos son extrados por el ter etlico, despus de la acidificacin del vino. El extracto etreo, es el que se emplea en la cromatografa. Reactivos SOLUCION PATRON INTERNO, preparada con 500 miligramos de cido olico puro, disueltos en una mezcla hidroalcohlica al 60%, hasta el volumen de un litro. ACIDO SULFURICO al 1/3 en volumen, con agua. ETER ETILICO. Aparato y columna El cromatgrafo, equipado con detector de ionizacin de llama. Columna con tubo de acero inoxidable de 1/8 de pulgada y 1 metro de longitud. La fase estacionaria se compone de una mezcla de succi6. A. Bertrand y C. Sarre, Cannaiss. Vigne Vin, 11, pginas 345-350, (1977).

6. El gas portador, nitrgeno con un flujo de 44 mL por minuto. Clculos La concentracin (C) en la muestra problema, viene dada por la siguiente frmula: C = 60 x SI x sh si x SH donde SI = superficie del pico del patrn interno en el anlisis de referencia. si = superficie del pico del patrn interno en la muestra del vino. sh = superficie del pico de cido saliclico en la muestra de vino. SH= superficie del pico de cido saliclico en el anlisis de referencia. Las superficies de los picos vienen calculadas por el integrador del registrador. 3.29

3.28

METODO DE LA A. O. A. C.
Principio del mtodo

6. Al residuo seco, se le aade una gota de solucin de cloruro frrico. Un color violeta, indica la presencia de cido saliclico.

Se fundamenta en la reaccin coloreada, que tiene lugar entre el cido saliclico y el cloruro frrico. La coloracin es sensible y muy visible por el intenso color rojo-violeta. Reactivos ACIDO CLORHIDRICO al 1/3 v/v, con agua destilada. ETER ETILICO. ETER DE PETROLEO. SOLUCION DE CLORURO FERRICO al 0.5%, neutralizada. Tcnica operativa 1. Se toman 200 mL de vino y se alcalinizan al tornasol, con solucin de hidrxido sdico al 10%. 2. En un bao maria de agua hirviente, se evaporan a un tercio de su volumen inicial. Se diluye de nuevo a su volumen original con agua destilada y se filtra si es necesario. 3. Se colocan en un embudo de decantacin, 50 mL de la solucin anterior, se aaden 5 mL de cido clorhdrico diluido, 50 mL de ter etlico y se mezcla bien. 4. La capa acuosa se decanta, se lava con dos porciones de 5 mL cada una de agua destilada y se evapora a sequedad. Este residuo se destina a la prueba colorimtrica. 5. Si interfieren materias colorantes u otras sustancias, se purifica de la forma siguiente: Se disuelve el residuo obtenido en el nmero 4), con 25 mL de ter etlico, se pasa a un embudo de decantacin y se aaden 25 mL de agua destilada, que previamente se habr hecho alcalina, con algunas gotas de hidrxido amnico diluido (1 + 9 de agua). Se deja en reposo. Se decanta el agua, se filtra sobre papel hmedo y se evapora a sequedad.
7. A.O.A.C., 14 edicin, nmero 20.110, (1984).

TEST DE JORRINSEN
Reactivos

SOLUCION NITRITO POTASICO al 10%, se colocan 10 gramos de nitrito potsico, en un matraz de 100 mL y se completa con agua destilada hasta el volumen. ACIDO ACETICO, disuelto con igual volumen de agua destilada. SOLUCION DE SULFATO DE COBRE al 1 %, se pesa 1 gramo de sulfato cprico pentahidrato, reactivo para anlisis y se coloca en un matraz de 100 mL, se disuelve con agua destilada y se completa a volumen. Tcnica operativa 1. Al residuo seco obtenido en el anlisis anterior (AOAC, operacin 6), se le aade un poco de agua destilada caliente y se deja enfriar. 2. Se toman 10 mL de la solucin anterior, pasndolos a un tubo de ensayo. 3. Se adicionan 4-5 gotas de la solucin de nitrito, 4-5 gotas de la solucin de cido actico y 1 gota de solucin de sulfato de cobre. 4. Mezclar bien y se hierve durante 30 segundos, se deja en reposo 2 minutos. 5. En presencia de cido saliclico, aparece un intenso color rojo.
8. A.O.A.C., 14 edicin, nmero 20.112, (1984).

3.30

3.31

Reactvos

Acido benzoico

ETER ETILICO. SOLUCION DE ACIDO SULFURICO al 1/3 v/v en agua. HIDROXIDO SODICO 1 M. SOLUCION DICROMATO POTASICO, disolviendo 34 gramos de este reactivo en agua destilada hasta un litro. Tcnica operativa 1. En un embudo de decantacin, se colocan 20 mL de vino y 25 mL de ter etlico, se agita. 2. La capa etrea se separa colocndola en un vaso. 3. De nuevo se aade al mismo vino, 25 mL de ter y se vuelve a efectuar la extraccin de la misma forma anterior. 4. Se renen los extractos etreos y se tratan rpidamente con 5 mL de solucin de hidrxido sdico, por dos veces y al final con 5 mL de agua destilada. 5. Estas soluciones acuosas alcalinas, se evaporan a bao mara para eliminar el ter. 6. Se pasa la solucin, una vez fra y cuantitativamente, a un matraz de 100 mL con tapn, se aaden 20 mL de cido sulfrico diluido y 20 mL de solucin de dicromato. Se tapa, agita y deja en reposo durante una hora como mnimo. 7. En el caso de que la coloracin amarilla, provocada por la adicin del dicromato, desapareciera, convendr una nueva adicin de este producto.

COMENTARIOS

Raramente se emplea este cido como antisptico, se utiliza casi siempre la sal sdica, pues el cido es muy difcilmente soluble en agua. Fue empleado en el vino, hace aos, y actualmente se halla prohibido su uso en enologa. Algunos mostos se mantenan estriles con la adicin de benzoato sdico, en dosis de un gramo por litro. Cantidades superiores, alteran las condiciones organolpticas.

METODO JAULMES9
Principio del mtodo Se miden las absorbancias en la regin del ultravioleta y a partir de ellas se deduce la concentracin en cido benzoico.

8. Se aaden por dos veces, 20 mL de ter y se renen los lquidos etreos. Se lavan con agua destilada y se decantan. 9. Cuantitativamente y con la ayuda de ter, se pasan a travs de un filtro a un matraz de 50 mL, se lava el filtro con un poco de ter y se completa a volumen. 10. La solucin etrea, se coloca en el espectrofotmetro en cubeta de 20 mm de paso de luz y provista de tapa, comparando las absorbancias con ter puro. 11. La medicin se efecta a 267 nm (A), 272 nm (B) y 276 nm (C). 3.33

9. P. Jaulmes y otros, Ann. Falsif. Fraudes, 54, 326, pgina 84, (1961)

3.32

Clculos Se calcula la concentracin de acuerdo a la siguiente frmula: d=B- A+C 2 este valor se compara con la grfica patrn, preparada con soluciones que contienen 10, 15, 20, 25, 30 y 40 miligramos de cido benzoico por litro y bajo las mismas condiciones. Con esta tcnica se pueden determinar hasta 4 mg/L.

SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO-ALCOHOL, aadir a 5 g de hidrxido sdico, 50 mL de agua destilada, despus de fra la solucin, se aade alcohol etlico 96% hasta completar el volumen de 100 mL. Tcnica operativa Tcnica para vinos secos o dulces (< 100 g/L) 1. En un embudo de decantacin, se colocan 10.00 mL de vino, al que se aaden 2 mL de cido sulfrico al 25% y 25 mL de ter, dos veces seguidas. Agitar. 2. Decantar y filtrar el ter, por papel de filtro seco, colocar en un matraz aforado de 50 mL y enrasar. 3. Poner 20.00 mL de la solucin etrea en erlenmeyer de 50 mL. Evaporar aspirando los vapores mediante el vaco, permanenciendo el erlenmeyer sumergido en bao de agua fra. 4. Aadir al residuo, 5 mL de la mezcla nitrosulfrica, cuidando de empapar bien todo el residuo. 5. Llevar despus al bao mara hirviente durante 35 minutos, agitando de cuando en cuando. 6. Enfriar en agua fra, aadir 5 mL de agua destilada, seguir enfriando y verter el contenido en una ampolla de decantacin de 250 mL. Enjuagar el erlenmeyer con 5 mL de agua y volver a verter el contenido en la ampolla y aadir 30 mL de ter. 7. Agitar cinco minutos. 8. Eliminar la fase acuosa, despus de cuidadosa decantacin, y lavar el ter con 5 mL de agua. 9. Decantar con cuidado. Un lavado ms prolongado originara prdidas de dinitrobenzoico en la fase acuosa, por lo que es preferible decantar bien, que volver a lavar. 10. Filtrar el ter por filtro revestido con sulfato sdico anhidro, lavar el filtro enseguida con 10 mL de ter. 11. Evaporar el filtrado en una pequea cpsula a 35 C, arrastrar con tres adiciones de 5 mL de acetona-alcohol, cada vez (previamente enfriado en la nevera). Recoger todos estos l-

METODO COLORIMETRICO
Principio del mtodo

10

Extraccin por el ter, del cido benzoico presente en el vino. Tratamiento del extracto por la mezcla nitro-sulfrica y formacin del cido 3,5-dinitrobenzoico, que es extrado con ter y despus recogido por la mezcla acetona-alcohol. La adicin de hidrxido sdico, da origen a una coloracin violeta. Esta reaccin es sensible, especfica y cuantitativa, medible con espectrofotmetro a la longitud de onda de 570 nm. Reactivos ETER ETILICO. MEZCLA ACETONA - ALCOHOL, volmenes a partes iguales, alcohol absoluto y acetona. MEZCLA NITROSULFURICA, aadir a 10 g de nitrato potsico, 100 mL de cido sulfrico 96%.

10. B.O.E., de 26 de julio de 1977.

3.34

3.35

quidos en un tubo de ensayo de tapn esmerilado y aforado a 20C. 12. En un tubo de ensayo de tapn esmerilado y con trazo de aforo de 15 mL, poner de 0.5 a 5.0 mL de la anterior mezcla. Este volumen debe variar con la riqueza supuesta para obtener la reaccin coloreada con el cido dinitrobenzoico originado por 0.1 a 0.5 mg de cido benzoico. 13. El mtodo es vlido entre 0.03 y 1 mg, si se utiliza aparato capaz de medir absorbancias superiores a 1.5. 14. Diluir el volumen de lquido puesto en el tubo, con la mezcla acetona-alcohol fra, hasta 14.7 mL y aadir despus 0.3 mL de sosa al 5%, agitar y sumergir en hielo fundente. 15. La determinacin, en cubeta de 10 mm de paso de luz a la longitud de onda de 570-580 nm. Despus de 30 minutos y antes de 60 minutos a partir del momento de la mezcla. 16. Utilizar como solucin compensadora para comparacin una mezcla de 14.5 mL de acetona-alcohol con 0.3 mL de sosa al 5%. 17. Para obtener la curva patrn, preparar una solucin valorada de 50 mg de cido benzoico puro en 100 mL de ter. 18. Diluir esta solucin a 1/10 con ter y tratar 10 mL de esta solucin de 50 mg/L, como se ha indicado antes para la muestra. 19. La densidad ptica vara linealmente con la cantidad de cido benzoico.

Varios cidos

COMENTARIOS
Se presenta una tcnica por cromatografa de gas, que simultneamente pueden identificarse los siguientes cidos a la vez: MONOCLORACETICO, BENZOICO, SALICILICO, p-HIDROXI y pCLOROBENZOICOS. Tcnica muy interesante para el anlisis de antifermentos en vinos, por la simultaneidad en determinar estos compuestos antispticos.

METODO GAS CROMATOGRAFICO11

Principio del mtodo Extraccin de los cidos, mediante el empleo del ter etlico, previa la acidificacin de la muestra de vino. El extracto etreo, despus de deshidratado, es utilizado para el anlisis.

Clculos Llevar la absorbancia obtenida a la curva patrn y expresar el correspondiente contenido de cido benzoico en mg/L.

11. D. Revuelta, G. Revuelta y F. Armisen, An. Quim., 71, pginas 179-182, (1975).

3.36

3.37

Reactivos ETER ETILICO. SULFATO SODICO ANHIDRO. ACIDO SULFURICO, en solucin acuosa al 10% en volumen. ACIDO CLORHIDRICO concentrado. METANOL. CLOROFORMO. Aparato y columnas Cromatgrafo de gas, con detector de ionizacin de llama. Columna en tubo de acero inoxidable de 1/8 de pulgada y 1 metro de longitud. La fase estacionaria, es silicona SE-30 al 1 %, sobre Chromosorb W-AW, de 80-100 mallas. Temperatura isoterma del horno a 155 C. Gas portador, nitrgeno, con un flujo de 40 mL por minuto. Tcnica operativa 1. En un embudo de decantacin de 500 mL, se vierten 10 mL de vino, 100 mL de ter etlico y 20 mL de cido sulfrico diluido. Se agita durante 5 minutos y se deja despus, en reposo, para que se separen las dos fases lquidas. 2. Se elimina la capa acuosa, y la fase etrea se deseca con sulfato sdico anhidro. 3. Se inyectan en el cromatgrafo, 2 microlitros de la solucin anterior, para efectuar las determinaciones del cido monocloractico y el ester etlico del cido p-hidroxibenzoico. 4. El resto del extracto etreo, se evapora hasta sequedad. Al residuo seco se le aaden 10 mL de metanol y 0.5 mL de cido clorhdrico. 5. Se coloca la mezcla en un matraz para reflujo y se mantienen durante 4 horas a suave ebullicin (unos 60 C). Se deja enfriar. 6. Al lquido anterior, colocado en un embudo de decantacin, se extraen los esteres metlicos, con cloroformo. 3.38 3.39 5. De la capa clorofrmica, se toman 2 microlitros y se inyectan en el cromatgrafo, para determinar los cidos: saliclico, benzoico, p-clorobenzoico y p-hidroxibenzoico. 6. Para la identificacin, se prepara una solucin con los cidos citados, para poder determinar los tiempos de retencin de cada uno de ellos y poderlos identificar en el cromatograma de la muestra objeto del anlisis. Observaciones Podra efectuarse un anlisis cuantitativo, pero en este caso deber operarse con volmenes medidos, durante las extracciones. Fundamentalmente este anlisis es cualitativo, pero a la vista de la superficie de los picos, puede darnos una idea de cual es el componente ms destacable, para luego aplicar una metdica especfica para el anlisis.

Cloropicrina

tura de electrones. La presencia de los picos de los dos metabolitos, en los vinos analizados, indican la adicin de cloropicrina. Aparatos y columnas Cromatgrafo de gases, equipado con detector de captura de electrones con Ni63 o bien H3. Integrador, para registrar y valorar los tiempos de retencin y superficie de los picos. Columna en acero inoxidable, de 2 metros de longitud y 118 de pulgada de dimetro exterior. Relleno con DEGS al 10%, sobre un soporte de Chromosorb W-AW-HMDS, de 80/100 mallas. Reactivos CICLOHEXANO. SULFATO SODICO ANHIDRO. CLOROPICRINA PURA, Fluka Ref. 91320. Tcnica operativa 1. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo, son las siguientes: gas portador, nitrgeno a 35 mL por minuto. Temperaturas del inyector y detector 200 C en cada uno. Temperatura de la columna 80 C. 2. En un embudo de decantacin de 250 mL, se extraen 50 mL de vino, con 50 mL de ciclohexano. Se deja en reposo para que se separen las dos fases lquidas. Pueden emplearse volmenes menores, pero siempre manteniendo la relacin 1/1 entre el vino y el disolvente. 3. La fase orgnica, se deseca con sulfato sdico anhidro y se inyecta en el cromatgrafo un volumen comprendido entre 1 y 5 microlitros, de acuerdo a la sensibilidad del aparato. 4. Para la preparacin de la solucin de referencia, se emplea un vino que no contenga ningn producto interferente. La mejor comprobacin, es efectuar una extraccin e inyectar en el cromatgrafo. No debe aparecer ningn pico, aparte el del disolvente. 5. El ciclohexano tambin es indispensable comprobarlo, de la misma forma que en el procedimiento anterior, para asegurarse que no contenga algn pico coincidente con los que se van a determinar. 3.41

COMENTARIOS
La cloropicrina (tricloronitrometano), se emplea en la desinfeccin de suelo, cereales y como desinfectante en envases de gran volumen. Por su efecto antisptico, ha sido utilizada, fraudulentamente, en vinos de baja calidad. La cloropicrina aadida al vino, se degrada con el tiempo en los siguientes compuestos: mono y dicloronitrometano. Pequeas cantidades de estos degradados, as como el producto original, son fcilmente detectables por cromatografa de gas, con la ayuda del detector de captura electrnica.

METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS

Principio del mtodo

12

Extraccin del tricloronitrometano y sus compuestos de degradacin di y monocloronitrometano, con ciclohexano, en el vino. Determinacin por cromatografa de gas, con detector especfico de cap

12. INCAVI, Diari Oficial Generalitat de Catalunya, n 277, pgina 2.675, (1982).

3.40

6. Con el vino comprobado, se prepara un patrn con 4 ppm de cloropicrina pura. 7. El patrn, recin preparado y analizado, presenta solamente el pico del tricloronitrometano. Con el tiempo, unos seis meses, se hidroliza la cloropicrina en sus metabolitos. Al cabo de este tiempo podrn fijarse los tiempos de retencin de los compuestos de degradacin.

Ferrocianuro y cianuro

Observaciones a) Para evitar posible contaminacin de las muestras, por causa de deficiencia en la limpieza del embudo de decantacin, se aconseja operar de la siguiente forma:

COMENTARIOS
Emplear tubos de ensayo de vidrio, nuevos para cada anlisis. El tubo de ensayo puede ser de dimensiones 16 x 160 mm. Se colocan en el mismo partes iguales de vino y ciclohexano, se agita enrgicamente durante 2 minutos y luego se centrifugan, para separar las dos fases. Parte de la fase orgnica se vierte a otro tubo que contiene una pequea cantidad de sulfato sdico anhidro, en polvo, se agita y se toma 1 microlitro para inyectar en el cromatgrafo. b) Se recomienda sustituir el nitrgeno, como gas portador, por la mezcla de argn con 10% de metano, ya que este gas es ms idneo para el detector de captura electrnica. En los vinos naturales, se hallan cantidades muy insignificantes, del orden del microgramo, de cianuro. Niveles ms altos de este componente, proceden, con toda seguridad, del tratamiento excesivo de los vinos con exacianoferrato (II) potsico, para la eliminacin del hierro, cobre y/o protenas. Modernamente se hace casi innecesario este tratamiento, debido al perfeccionamiento en las tecnologas empleadas en las bodegas. De todas formas, en agricultura, se emplean fungicidas coloreados fuertemente con azul de Prusia y pueden, accidentalmente, contaminar los vinos. Se necesitan tcnicas sensibles y rpidas, para detectar el cianuro en los vinos.

METODO DE LA CEE
Principio del mtodo Control de los vinos tratados por el exacianoferrato (II) potsico. Verificacin de la ausencia de precipitado de exacianoferrato (Il) f 3.42 3.43

rrico, en suspensin o formando un depsito. Comprobacin de la ausencia de exacianoferrato (II) frrico por adicin de una sal frrica, al vino acidulado. Comprobacin de la presencia de hierro, precipitndolo por una mezcla de exacianoferrato (II) y exacianoferrato (III) alcalinos, aadidos al vino acidulado. Reactivos
ACIDO CLORHIDRICO al 50% en volumen, exento de hierro. Se obtiene fcilmente la ausencia de hierro, mezclando el cido con una cantidad igual de agua destilada. Esta mezcla se destila y el lquido obtenido est exento de hierro. SOLUCION DE SULFATO FERRICO-AMONICO al 15% en agua destilada. SOLUCION DE EXACIANOFERRATO (II) POTASICO al 10%. SOLUCION DE EXACIANOFERRATO (III) POTASICO al 10 %.

Comprobacin de la presencia de iones hierro en el vino 1. En un tubo de ensayo, se colocan 20 mL de vino, 1 mL de cido clorhdrico al 50%, 1 gota de solucin de exacianoferrato (II) potsico y una gota de solucin de exacianoferrato (III) potsico. Agitar. 2. Una coloracin o un precipitado de color azul, debe aparecer antes de 30 minutos. 3. Filtrar el lquido sobre el papel de filtro sin pliegues y lavando el filtro 2 veces con 5 mL de agua destilada, no se debe observar ningn color azul sobre el filtro. Observaciones Se pueden reemplazar y, con ventaja, la centrifugacin por la filtracin sobre papel de filtro exento de hierro, o mejor todava, en un filtro de membrana de 0.45 micras de porosidad.

Tcnica operativa Investigacin de trazas de exacianoferrato (II) frrico en suspensin 1. Antes de tomar la muestra del vino, se proceder a una agitacin del envase que lo contiene, para mezclar el sedimento que pudiera existir. 2. Se toman 20 mL del vino y se colocan en un tubo de centrfuga, cnico, de 30 mL de capacidad. Se centrifuga durante 15 minutos a 3500 rpm. 3. Al observar el fondo del tubo en donde se halla la muestra, debe hallarse exento de partculas azules. Investigacin de trazas de iones ferrociangenos en solucin 1. En un tubo cnico de centrfuga de 30 mL, se vierten 20 mL de vino lmpido, 1 mL de cido clorhdrico al 50% y una gota de solucin de sulfato frrico-amnico. Se agita y se deja en reposo, como mnimo, 24 horas. 2. Centrifugar durante 15 minutos a 3500 rpm. 3. El fondo del tubo debe estar exento de partculas azules de exacianoferrato (Il) frrico.

METODOS USUALES CEE

Principio del mtodo Dosado argentimtrico del cido cianhdrico total, liberado por hidrlisis cida y posterior destilacin. Determinacin del cido cianhdrico libre, destilado al vaco y arrastre por una corriente de aire a la temperatura ambiente. Los derivados cianurados se expresarn en miligramos de cido cianhdrico por litro y determinados con una sensibilidad de 0.1 mg. Anlisis del cianhdrico total Aparato Un matraz de fondo esfrico de unos 500 mL, se coloca, con el cuello inclinado, sobre una placa de hierro de 20 x 20 cm, con un orificio central de 50 mm de dimetro. El baln se une a un refrige-

3.44

3.45

rante de West de 350 mm de longitud. La extremidad inferior de este refrigerante, en posicin vertical, termina en un tubo de vidrio afinado, que conduce el destilado al fondo de un matraz receptor de 50 mL. Este matraz se halla sumergido en una mezcla de hielo y agua. Reactivos ACIDO SULFURICO DILUIDO. Mezclar 200 mL de cido concentrado en una cantidad de agua, suficiente para obtener un volumen de un litro. CLORURO CPRICO cristalizado. SOLUCION DE ROJO FENOL. Se pesan 0.05 gramos de rojo fenol y se disuelven en 1.4 mL de una solucin 0.1 M de hidrxido sdico. Se completa a volumen de un litro con agua destilada. SOLUCION DE IODURO POTASICO. Disolver 250 gramos de ioduro potsico, reactivo anlisis, en agua destilada hasta obtener un litro. SOLUCION 0.001 M DE NITRATO DE PLATA. Se toman 10 mL de solucin de nitrato de plata 0.1 M y se diluyen con agua hasta un litro, previa adicin de 0.5 mL de cido ntrico concentrado. SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 1 M, puro y exento de hierro. Tcnica operativa 1. En el matraz de fondo esfrico del aparato, se introducen 100.00 mL de vino filtrado (o sin filtrar, si se desea determinar tambin el cido cianhdrico contenido en el eventual enturbiamiento azul), aadir 0.005 gramos, aproximadamente, de cloruro cprico y 10 mL de cido sulfrico diluido. 2. En el matraz receptor, se vierten 5 mL de solucin 1 M de hidrxido sdico, exenta de hierro. 3. Se destila hasta obtener 50 mL. 4. El destilado se vierte en un vaso de 400 mL situado en un bao mara hirviente. Este bao mara debe estar calentado elctricamente, ya que si se emplea gas para calentar, ste

puede contener cianhdrico. Tampoco se debe fumar cuando se efecta este anlisis, pues el humo del tabaco tambin contiene cianhdrico. Para acelerar la evaporacin, se puede dirigir una corriente de aire fro, sobre la superficie. 5. Se reduce el volumen por evaporacin hasta unos 5-7 mL, lo que tiene lugar en unos 30 minutos (no se debe reducir el volumen a menos de 5 mL). 6. La solucin, una vez fra, se filtra sobre un pequeo filtro, recogiendo el filtrado en un tubo de 20 x 180 mm. Se lava bien el filtro y el vaso, con algunos mililitros de agua. 7. El tubo de vidrio se coloca sobre un fondo negro y se ilumina lateralmente, con luz blanca. El lquido debe estar perfectamente lmpido. 8. Aadir dos gotas de solucin de rojo fenol, para apreciar mejor la turbidez. Algunas personas observan mejor la aparicin del enturbiamiento, en una solucin rosa que en una incolora. 9. Luego se aade una gota de solucin de ioduro potsico. Valorar con la solucin de nitrato de plata, hasta aparicin de un ligero enturbiamiento estable. Sea n el volumen de solucin necesaria para obtener este resultado. 10. Por otro lado, se prepara un tubo parecido al anterior, con 5 mL de solucin 1 M de hidrxido sdico, dos gotas de solucin de rojo fenol, una gota de solucin de ioduro potsico y una cantidad de agua destilada suficiente para obtener un volumen idntico a la del ensayo con vino. 11. Aadir solucin de nitrato de plata 0.001 M, en cantidad suficiente para obtener el mismo enturbiamiento. Sea n' el volumen gastado. Clculos Tngase en cuenta que un mililitro de solucin de nitrato de plata 0.001 M, se corresponde a 54 microgramos de cido cianhdrico. La cantidad de cido cianhdrico total, contenida en el vino y expresada en miligramos por litro, se halla por la frmula: C = 0.54 (n - n')

3.46

3.47

Solamente se tendr en cuenta una cifra decimal, despus de la coma. Se considerarn significativos, los ensayos cuya diferencia antes indicada, sea superior a 0.5 mL. Cuando la diferencia es superior a 10 mL, investigar y determinar el cido cianhdrico libre, por la metdica que se indica en el siguiente anlisis. Si la diferencia n - n' es superior a 10 mL, comenzar de nuevo el anlisis y emplear una solucin de nitrato de plata 0.01 M. Anlisis del cianhdrico libre Aparato El aparato est formado por dos matraces de un litro, A y B, provistos de un tubo recto de 30 mm de dimetro y de 300 mm de longitud, con unin esmerilada que permita la separacin. Uno de los matraces A, est provisto de un grifo que puede unirse a una bomba de vaco o tambin adaptar un pequeo embudo a travs de un racor de plstico. El tubo recto, reposa sobre un mecanismo, que permite girar sobre su eje a una velocidad moderada. Tcnica operativa 1. En el matraz B, se introducen 5 mL de solucin de hidrxido sdico. En el matraz A, 5 mL de agua destilada. Dejar girar los dos matraces y efectuar el vaco. Mientras, se calienta ligeramente para vaporizar un poco de agua, con objeto de eliminar el aire de su interior. 2. Se cierra el grifo y se elimina la unin con la bomba de vaco. Se coloca el matraz B en agua fra y luego en agua con hielo. 3. Se introducen, con precaucin, 100 mL de vino en el matraz A, evitando todo lo posible la entrada de aire. 4. Colocar ahora el matraz A en un recipiente con agua tibia. El vino entra en ebullicin. Se activa la destilacin haciendo girar el matraz alrededor de su eje.

5. Despus de haber destilado los dos tercios del matraz A (lo que se efecta en unos 20 minutos), invertir el aparato colocando el matraz B en agua tibia y el A en agua con hielo. Redestilar en sentido inverso un tercio del contenido de B. 6. El matraz A contiene el alcohol, aldehdos, esteres y los iones ferrociangenos combinados con el residuo del vino. 7. Se efecta ahora la determinacin del cido cianhdrco libre, en el contenido del matraz B, tal como se ha indicado en el mtodo anterior.

METODO ADDEO, NOTA Y CHIANESE

Principio del mtodo

13

El procedimiento se basa en la transformacin del in CN en BrCN, por tratamiento de la muestra, con agua de bromo. Despus de eliminado el bromo en exceso, las soluciones de vino se extraen con cloroformo y los extractos son analizados por cromatografa de gas. Cantidades tan pequeas como un microgramo por litro, pueden detectarse selectivamente en el detector de captura electrnica. La sensibilidad y precisin del mtodo, puede compararse con la metdica colorimtrica. Aparato y columnas Cromatgrafo de gas provisto con detector de captura de electrones, utilizando Nis3. Columna de vidrio de un metro de longitud y 3 mm de dimetro interior. Esta columna se llena con Porapak Q. Gas portador nitrgeno, a un flujo de 50 mL/min. Las temperaturas del inyector y del detector, son respectivamente 120 y 150 C. La columna se mantiene a la temperatura de 112 C.

13. F. Addeo, G. Nota y L. Chianese, Am. J. Enol. Vitic., 29. pgins 7-10, (1978).

3.48

3.49

Reactivos SOLUCION DE ACIDO FOSFORICO al 20 % en peso. AGUA SATURADA DE BROMO. SOLUCION DE FENOL al 5% p /v. CLOROFORMO. Tcnica operativa 1. Se vierten 10.00 mL de vino, en un tubo de centrfuga con tapn esmerilado, de unos 30 mL y se aaden 5 mL cido fosfrico y 2 mL de agua saturada de bromo. Agitar. 2. Transcurridos cinco minutos, se aaden 4 mL de fenol al 5% y se agita manualmente. A continuacin se aade 1 mL de cloroformo, se agita durante 1 minuto y luego se centrifuga durante cinco minutos a 1500 rpm. 3. De la capa orgnica de cloroformo, se toman 5 microlitros que se inyectan en el cromatgrafo. Clculos Para la determinacin cuantitativa del in ciangeno, se prepara una solucin de referencia de cido cianhdrico. La relacin entre la concentracin y la altura del pico, es lineal entre valores de 25 a 100 microgramos de canhdrico por litro de vino. Observaciones a) Con objeto de no sobrecargar el detector con el disolvente, se prevee en el aparato una vlvula de dos vas a la salida de la columna. Despus de haber registrado el pico de BrCN, se desva el gas de salida al aire. b) El pico del BrCN se separa perfectamente del cloroformo empleado como disolvente, que sale un minuto despus.

METODO COLORIMETRICO
Principio del mtodo

14

Utiliza el reactivo Aquaquant de Merck, que forma una reaccin coloreada violeta en presencia de cianuros, con la piridina y el cido N,N'-dimetilbarbitrico, No es necesario tratamiento alguno de la muestra de vino. Reactivos AQUAQUAQNT MERCK cianuros, ref. 14417. Este test contiene tres reactivos: CN-1, CN-2 y CN-3. Debe comprobarse antes del anlisis, pues tiene caducidad. ACIDO FOSFORICO concentrado. Tcnica operativa 1. En un pequeo matraz de destilacin, se colocan 10.00 mL de vino. 2. Se adicionan 5 mL de agua destilada y 0.5 mL de cido fosfrico concentrado. 3. Se destila a fuego muy lento (sin llegar a la ebullicin), haciendo borbotear el gas desprendido en un tubo de ensayo que contenga una cucharadita del reactivo CN-1 disuelto en 10 mL de agua 4. Destilar durante 4 minutos. 5. Se retira el tubo de ensayo y se aade una cucharadita de reactivo CN-2 y se agita hasta disolucin completa. 6. A continuacin se aaden 10 gotas del reactivo CN-3 y se agita. 7. Se deja en reposo durante 10 minutos y se lee la absorbancia en cubeta de 10 mm de paso de luz a la longitud de onda de 585 nm, ajustado frente al agua. 8. Paralelamente se destila un patrn de 0.10 mg de cianuro, o un vino exento del producto a determinar, al que se ha aadido 0.1 m/L de cianuro.
14. R. Viader Guix, Semana Vitivincola, nmero 1923, Junio, (1983).

3.50

3.51

Observaciones a) Si no se observa la ms mnima coloracin violeta en la muestra, se le considera negativo y ya no es necesaria la lectura en el espectrofotmetro. b) Es conveniente efectuar la comprobacin del reactivo, dado que con el tiempo pierde su actividad.

Betana

COMENTARIOS
Este componente se halla en el azcar obtenido de la remolacha. Detectando la betana en el vino, puede predecirse la adicin de sacarosa al mosto, en el momento de la fermentacin. En las uvas puede hallarse betana y se ha podido comprobar la presencia en niveles de 0 a 5 mg/L de mosto.

METODO CENCI Y CREMONINI15

Principio del mtodo Separacin de la betana con resinas de cambio inico y separacin por cromatografa en capa fina. Reactivos RESINA CATIONICA DOWEX-50 W CROMATOPLACAS MERCK DE SILICAGEL H.

15. P. Cerzci y B. Cremonini, Riv. Vit. En. (Conegliano), 5, pgina 195, (1973).

3.52

3.53

ETANOL, para cromatografa. n-BUTANOL. SOLUCION DE BROMOFENOL al 0.05%, en agua destilada, adicionada de amoniaco al 5% en v/v. SOLUCION DE EOSINA AZULADA MERCK, al 0.05% en agua destilada. ACIDO CLORHIDRICO 0.1 M. Tcnica operativa 1. Se decoloran 1000 mL de vino, con carbn activo. Con cido clorhdrico se lleva a pH 3.0. Esta operacin debe controlarse con un medidor de pH. 2. En una columna de vidrio, se colocan 100 mL de resina inica, llevada a la forma cida mediante el paso de cido clorhdrico 2 M y lavada hasta eliminacin de la acidez residual. 3. Se pasa el vino decolorado, por esta resina. 4. Lavar la columna con dos porciones de 300 mL de agua destilada y elur la betana con 1000 mL de hidrxido amnico al 2% y lavar con 300 mL de agua. Reunir el eluado y el agua, y concentrar por ebullicin hasta unos 100 mL. 5. Cromatografiar sobre la placa. 6. Para el revelado se emplea: a) el azul de bromofenol amoniacal o bien, b) con la eosina azulada. Segn esta ltima tcnica, pulverizar la placa con la eosina, hasta obtener un color rosa uniforme. 7. Secar en corriente de aire caliente o en estufa a 125-130 C durante unos veinte minutos. 8. La placa una vez seca, se observa a la luz ultravioleta de 366 nm o mejor todava a 254 nm. 9. La betana aparece como una mancha de color amarillocrema, intensamente fluorescente.

Observaciones a) La resina puede ser regenerada, tratndola con cido clorhdrico 1 M. b) La sensibilidad del mtodo, permite poner de manifiesto la adicin de azcar tal, que pueda aumentar el grado alcohlico en un uno por ciento.

3.54

3.55

Antifermentos

3. Se toma el residuo con un sustrato preparado con. solucin de sacarosa al 1 % adicionada de vitamina B1, extracto de levadura y una siembra de levadura de cerveza. 4. Se coloca en una estufa a 28-30 C, para que tenga lugar la fermentacin. Observaciones Los autores comentan, que el vino no es un medio adecuado para el anlisis biolgico, por una serie de circunstancias, entre las que cabe destacar las siguientes: a) En pases en que est autorizado el empleo de resinas de cambio inico, el vino tratado por este sistema, puede quedar esterilizado. b) En el vino ya existen productos que son antispticos de por s: alcoholes, cidos, taninos, colorantes, esteres y otros ms. c) En una mezcla de antispticos, se refuerza el poder inhibidor de una sustancia; si se elimina el antisptico natural y el antisptico fraudulento, no se beneficia de la accin sinrgica y queda sin poderse hallar. d) Es imposible obtener un sustrato vino o mosto patrn. La sensibilidad del mtodo biolgico clsico (Tarantola), es variable segn la muestra analizada. e) El pH del medio de cultivo preparado, antes de la adicin del extracto, es de 5.5 a 6. Cuando se adiciona el residuo del vino, el pH se sita en 4.0 aproximadamente. Aunque la concentracin de sacarosa es baja, es muy eficaz para reconocer la presencia del antifermento. f) La levadura de cerveza, se prefiere a otras levaduras, por la facilidad de pesar. Se obtienen magnficos resultados. g) Por todas estas circunstancias, se ha pensado en la necesidad de separar el antifermento del vino o del mosto, mediante la extraccin y, aadirlo a un sustrato standard, para comprobar la fermentabilidad del mismo. 3.57

METODO BIOLOGICO GAROGLIO STELLA

Principio del mtodo

16

Extraer el antifermento del vino, y partir del producto extractado, para comprobar una refermentacin. Es una tcnica rpida y fiable. Reactivos ETER ETILICO. SACA ROSA. TIAMINA (vitamina B1) cristalizada. LEVADURA DE CERVEZA. Tcnica operativa 1. En un embudo de decantacin de 250 mL, se extraen 100 mL de vino con 50 mL de ter, repitiendo igual extraccin por segunda vez. 2. Se renen los extractos y se evaporan a sequedad sobre un bao mara.

16. P.G. Garoglio y C. Stella, Enc. Vitivincola Mondiale, 7, pgina 36 (1973).

3.56

Aparatos

Isotiocianato de alilo

Aparato de destilacin por corriente de nitrgeno, segn la figura adjunta.

COMENTARIOS
Este antifermento ha sido utilizado en aos atrs. Su nombre vulgar es el de esencia de mostaza y su empleo se destin a evitar el picado del vino. En la actualidad est totalmente prohibido su uso.

Calefactor termorregulable, flujmetro y cromatgrafo de gas con detector de espectrofotometra de llama, con filtro selectivo de 394 n m. Columna de acero inoxidable, de 3 m de longitud y de 3 mm de dimetro interior. Relleno: Carbowax 20 M al 10%, sobre Chromosorb WHP de 80/100 mallas. Tcnica operativa 1. Colocar 2 litros de vino en el matraz de destilacin. Introducir algunos mililitros de alcohol en los dos tubos de recuperacin, hasta completa inmersin de la parte porosa, para la dispersin gaseosa. 2. Enfriar exteriormente los dos tubos, con la mezcla refrigerante. 3. Unir el matraz a los tubos receptores y comenzar la introduccin de una corriente de gas nitrgeno, de aproximadamente 3 litros por hora.

METODO UNICO DE LA CEE

Principio del mtodo El isotiocianato de alilo, eventualmente presente en el vino, y recuperado por destilacin, se identifica por una tcnica de cromatografa de gases. Reactivos ETANOL. SOLUCION PATRON, preparada con 15 miligramos de isotiocianato puro, en un litro de alcohol. MEZCLA REFRIGERANTE, formada por alcohol y nieve carbnica (temperatura -60 C). 3.58

3.59

4. Calentar el vino a 80 C, regulando la calefaccin de forma adecuada para que se mantenga constante la temperatura. Recuperar un total de destilado de 45 a 50 mL. 5. Las condiciones de trabajo del cromatgrafo son: inyector a 200 C, columna a 130 C, gas portador, helio a 20 mL/min. 6. Inyectar una cantidad de solucin patrn, de forma que el pico del isotiocianato de alilo, pueda ser fcilmente identificado en el cromatograma. 7. De igual forma inyectar una parte alcuota del destilado y comprobar el tiempo de retencin y la altura del pico obtenido con el patrn. 8. En las condiciones indicadas de trabajo, no hay interferencia de otros compuestos que puedan hallarse en el vino.

Reactivos CICLOEXANO. SULFATO SODICO ANHIDRO. ISOTIOCIA NATO DE ALILO. Tcnica operativa 1. Condiciones de trabajo del cromatgrafo: Gas portador nitrgeno a 36 mL/min. Temperaturas del inyector y del detector, 200 C en cada uno. Temperatura de la columna 80 C. 2. En un embudo de decantacin de 250 mL, se extraen 50 mL de vino, con 50 mL de cicloexano. 3. La fase orgnica se deseca con sulfato sdico anhidro. 4. Se inyecta en el cromatgrafo un volumen comprendido entre 1 y 5 microlitros, de acuerdo a la sensibilidad del aparato. 5. Solucin de referencia. Se utiliza un vino que no contenga ningn producto interferente. La mejor comprobacin, es efectuar una extraccin e inyectar en el cromatgrafo; no debe aparecer pico alguno, aparte el del disolvente.

METODO POR CROMATOGRAFIA DE GAS

Principio del mtodo

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6. El disolvente tambin se comprobar, de la misma forma que en 5), para verificar que no contenga algn pico coincidente con los que se van a determinar. 7. Se prepara un vino patrn, con 4 ppm de isotiocianato de alilo puro. Observaciones a) Para evitar posible contaminacin de las muestras, por efecto de deficiencia en la limpieza del embudo de decantacin, se aconseja operar de la siguiente forma: Emplear tubos de ensayo nuevos para cada anlisis. El tubo de ensayo puede ser de dimensiones 16 x 160 mm. Se colocan en el mismo partes iguales de vino y cicloexano, se agita enrgicamente durante 2 minutos y luego se centrifuga, para separar las dos fases. Parte de la fase orgnica, se vierte a otro tubo de iguales dimensiones, que contiene sulfato sdico anhidro, se agita, y se toma el volumen para inyectar al cromatgrafo. 3.61

Extraccin del isotiocianato de alilo, con cicloexano, en el vino. Determinacin por cromatografa de gas, con detector especfico de captura de electrones. La presencia de dos picos, prximos a los degradados de la cloropicrina, es caracterstico de este compuesto. Aparato y columnas Cromatgrafo de gases, equipado con detector de captura de electrones, con Ni63 o H3. Integrador, para registrar los tiempos de retencin, as como la superficie de los picos. Columna en acero inoxidable, de 2 m de longitud y 118 de pulgada de dimetro exterior. Relleno con DEGS al 10%, sobre Chromosorb W-AW-HMDS, de 80/100 mallas.

17. INCAVI, Diari Oficial de la Generalitat de Catalunya, n ,277, pgina 2.6715, (1982).

3.60

b) Se recomienda, sustituir el nitrgeno, como gas portador, por la mezcla de argn con 10% de metano, ya que este gas es ms idneo, para el detector de captura de electrones.

Cumarina

COMENTARIOS
Este compuesto ha sido empleado en pocas ocasiones, como aromatizante en algunos tipos de vino. Dado que existe una legislacin limitando los niveles mximos de este producto, es por ello el inters de disponer de metdicas analticas adecuadas.

METODO DYER Y MARTIN

Principio del mtodo

18

Se aprovecha la solubilidad de la cumarina , en cloroformo. La solucin clorofrmica, es la que se emplea para el anlisis cromatogrfico. Aparato y columna Se emplea un cromatgrafo con detector de ionizacin de llama y registrador-integrador acoplado al mismo. La columna de vidrio de
18. R.H. Dar y G.E. Martin, J. Assoc. Off Anal. Chem., 59, pginas 780-782, (1976). 19. Nombre qumico 1,2-benzopirona.

19

3.62

3.63

2 mm de dimetro interior y 1.8 metros de longitud, se halla llena de una fase estacionaria, compuesta por el 10% de SP-1000 (Carbowax 20MTPA), sobre Chromosorb W-AW de 100/120 mallas. Reactivos SOLUCION PATRON DE CUMARINA. Se colocan en un ma20 traz aforado de 200 mL, 100 miligramos de cumarina y se disuelven con etanol, completando despus el volumen. CLOROFORMO Tcnica operativa 1. En dos embudos de decantacin de 250 mL, se vierten 100 mL de vino en cada uno de ellos. 2. A uno de los embudos, se adiciona 1 mL de la solucin patrn de cumarina y 1 mL de etanol, al otro embudo. 3. Se dispone as de una muestra con adicin del componente a analizar y otra sin ella. 4. Se mezcla bien y a continuacin se aaden 20 mL de cloroformo y se agita vigorosamente durante 2 minutos. Se deja en reposo para que las dos capas se separen. 5. Se toman 10-12 mL de la capa clorofrmica y se vierten en un tubo de centrfuga. Se somete a centrifugacin para obtener una solucin lmpida. 6. Se inyectan 5 microlitros en el cromatgrafo. 7. Se repite la inyeccin por tres veces y se toma el promedio de los tres anlisis. 8. Los parmetros de trabajo del cromatgrafo, son: Horno isotrmico a 180 C, inyector y detector a 200 C. Gas portador, helio a un flujo de 30 mL por minuto. El tiempo de retencin de la cumarina, en las condiciones indicadas de trabajo, es de unos 15 minutos.

Clculos La concentracin de cumarina, se calcula con el empleo de la siguiente frmula cumarina = 5 x en donde, U= altura del pico de la muestra sin adicin de cumarina. S= altura del pico de la muestra con adicin de cumarina. Los valores de U y S, que se emplean en la frmula, son cifras promedio de las tres inyecciones. Observaciones Si se emplea el integrador, en lugar de la altura, se anotarn las reas integradas de los picos correspondientes. U en mg/L S-U

20. De la firma Eastman Kodak nm. 9 o similar.

3.64

3.65

Edulcorantes sintticos

cido p-hidroxibenzoico, se pulveriza con una solucin de 4dimetilaminobenzaldehdo. La dulcina, forma un compuesto de color anaranjado; la vanillina y los esteres del cido p-hidroxibenzoico no dan ninguna reaccin coloreada. Reactivos TER DE PETROLEO, zona ebullicin entre 40 y 60 C. CAMBIADOR DE IONES LIQUIDO. Amberlite La-2 u otro semejante. ACETONA. XILOL. n-PROPANOL. METANOL. ACIDO ACETICO GLACIAL. SOLUCION ACUOSAACIDO ACETICO (1+4) ACIDO NITRICO, 1 M. ACIDO SULFURICO al 10 %. ACIDO FORMICO. SOLUCION ACUOSAAMONIACO (1 + 3). SOLUCION DE 2,7-DICLOROFLUORESCEINA al 0. 2 % p/v en etanol. SOLUCION DE 4-DIMETILAMINOBENZALDEHIDO, 1 gramo en un matraz de 100 mL con 50 mL de etanol, 10 mL de cido ntrico al 25% y enrasar a volumen con etanol. SOLUCIONES PATRON: Dulcina 0.1% en metanol; Sacarina 0.1 % en mezcla de metanol/agua 1/1; Ciclamato 1 % en dem; vanillina 1 % en dem; ester del cido p-hidroxibenzoico 1 % en metanol. TRATAMIENTO DEL CAMBIADOR DE IONES. Agitar enrgicamente, 5 mL del cambiador lquido, con 95 mL de ter de petrleo y 20 mL de cido actico diluido. Se emplea la fase lquida superior. MEZCLA LIQUIDA: Xilol 45 mL, n-propanol 6 mL, cido actico 7 mL y cido frmico 2 mL. 3.67

COMENTARIOS
Dentro de la gama de los edulcorantes artificiales, los ms utilizados son: el ciclamato, la sacarina y la dulcina. En el vino, y las bebidas derivadas del mismo, no est permitida la adicin de cualquier tipo de edulcorante artificial. La presencia de cualquiera de los citados, es una adicin fraudulenta, y por tanto, interesa disponer de tcnicas analticas que puedan poner de manifiesto la presencia de los mismos.

METODO CROMATOGRAFICO EN CAPA FINA21

Principio del mtodo Los edulcorantes se separan mediante el empleo del cambiador inico lquido y posterior cromatografa en capa fina. La identificacin se efecta por pulverizacin con 2,7-diclorofluorescena. Para investigar la dulcina en presencia de vanillina y esteres del

21. Comm. Anal. Vini, FV/316, (1969)

3.66

Aparatos y material Recipiente para poder efectuar la cromatografa en capa fina. Cromatofolios Merck, de celulosa y poliamida. Jeringa Hamilton de 10 microlitros. Lmpara ultravioleta de 254 mm o bien 360 nm. Dispositivo de pulverizacin. Tcnica operativa 1. Acidificar 50 mL de vino con 10 mL de cido sulfrico diluido, y extraer por dos veces cada una, con 25 mL del cambiador lquido. 2. Se renen las fracciones, se lavan tres veces, cada vez con 50 mL de agua destilada. 3. Se renen las fracciones amoniacales y se evaporan a sequedad, a 50 C sobre bao maria o en evaporador rotativo. 4. El residuo se toma con 5 mL de acetona y dos gotas de cido ntrico 1 M. Se filtra y de nuevo se evapora a sequedad sobre bao de agua a 70 C. Es importante evitar un exceso de calentamiento. 5. El residuo se toma con 1 mL de metanol. De este lquido, se colocan de 5 a 10 microlitros, en la placa cromatogrfica, as como tambin 2 microlitros de solucin patrn. 6. Se cromatografa hasta una altura de 15 cm, operacin que requiere prcticamente una hora. 7. Se seca la placa al aire y se pulveriza con la solucin de 2,7diclorofluorescena. La presencia de sacarina y ciclamato, se observa de inmediato a la luz del da, bajo forma de manchas claras, sobre un fondo de color salmn. 8. A la luz ultravioleta, se observan las dos anteriores y la dulcina, como manchas de color azul sobre fondo amarillo. A partir de la base, se observan primero el ciclamato, luego la sacarina y finalmente la dulcina. 9. La vanillina y los esteres del cido p-hidroxibenzoico, presentan el mismo Rf, que la dulcina. Para identificar la dulcina en presencia de estos dos, se pulveriza la placa con la solucin de 4-dimetilaminobenzaldehdo. A la luz del da, la dulcina aparece de color anaranjado, mientras que la vaniIlina y esteres del p-hidroxibenzoico, no dan mancha alguna. 3.68

Observaciones Pueden ser detectadas cantidades del orden de: 50 mg/L para el ciclamato, 10 mg/L para la sacarina e igual cantidad para la dulcina.

3.69

-Asarona

Reactivos SOLUCION SATURADA DE CLORURO SODICO. EXANO. SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO 1 M. ACIDO CLORHIDRICO 1 M. Tcnica operativa 1. En un matraz de 500 mL, se vierten 100 mL de vino o 50 mL de vermut. 2. Se aaden 40 mL de agua destilada y 10 mL de solucin saturada de cloruro sdico.

COMENTARIOS
La -asarona es un agente aromtico utilizado como tal, en algunos vinos y sobre todo en vermuts. En este ltimo caso se empleaban en sustitucin del aceite de clamo. Las dosis alcanzaban, desde los 5 a 30 miligramos por litro. Segn los resultados de estudios toxicolgicos efectuados, la FDA estadounidense, ha prohibido su empleo, en cualquiera de sus formas.
22

3. Se destila y se recogen 100 mL del destilado, pasndolos despus a un embudo de decantacin de 250 mL y se extraen con 50 mL de exano, durante 4 minutos. 4. Se separa la capa del disolvente y se lava primero con 20 mL de solucin de hidrxido sdico, y se decanta la capa acuosa. 5. A continuacin se aaden 20 mL de cido clorhdrico y despus de decantada la capa de cido, se aaden 20 mL de agua destilada. 6. De esta solucin de exano, se toma la cantidad suficiente para medir en una cubeta fluorimtrica de 10 mm de paso de luz. 7. Se determina la emisin a 350 nm, con excitacin de 310 nm.

METODO WOJTOWICK Principio del mtodo

23

La -asarona es arrastrada por vapor de agua, en la muestra de vino y posteriormente sometido a extraccin del destilado, con exano. Se efecta una determinacin fluorimtrica.

8. Deber preparase una curva patrn con soluciones de referencia de , -asarona, entre 0 y 20 mg por litro. Clculos Se comparan las lecturas de la muestra problema, con la curva standard. La sensibilidad alcanza 0.1 a 0.2 mg/mL de muestra.

22. cis-2,4,5-trimetoxi-1-propenilbenceno. 23. E.J. Wojtowics, J. Agric. Foad. Chem., 24 Pginas 526-528, (1976).

3.70

3.71

METODO A.O.A.C.
Principio del mtodo

24

4. Se separa la fase acuosa, dejando cuantitativamente el exano en el embudo. 5. Este volumen se vierte en tubo de centrfuga. Se debe recuperar practicamente el volumen de 10 mL, 0.5 mL. 6. Se inyectan en el cromatgrafo, 5 microlitros. 7. Con esta primera inyeccin, se comprueba si aparecen los picos de -asarona y palmitato de etilo. Si no se aprecia pico del primer compuesto, puede considerarse que no se alcanza la concentracin de 0.5 mg/L, ya que este es el lmite analtico que puede medirse en las condiciones de trabajo indicadas. 8. Si el pico observado tiene el mismo tiempo de retencin, que el palmitato, emplese la altura del pico, para determinar la concentracin de -asarona. 9. En el caso de que ste producto est presente dentro de los lmites de la curva patrn y no existe palmitato de etilo, se aaden 200 microlitros de la solucin de patrn interno, mezclar bien y cromatografiar de nuevo. 10. Se utiliza la relacin de alturas de picos para determinarla asarona, de acuerdo a la curva de la solucin de referencia. Si el pico de la -asarona sale del lmite de la escala, se diluye la mezcla con exano, de forma que la concentracin oscile entre 1 y 5 mg por litro. Clculos Se preparan las soluciones de referencia que contengan 1, 2, 3, 4 y 5 miligramos de -asarona por litro. A cinco matraces aforados de 100 mL, que contengan aproximadamente 90 mL de alcohol diluido, se les aaden: 100, 200, 300, 400 y 500 microlitros de la solucin de referencia de -asarona, se mezclan y se completan a volumen, con alcohol diluido. Cada una de estas soluciones patrn, se someten a destilacin y extraccin, como la muestra problema. Al exano contenido en el tubo de centrfuga, se aaden 200 microlitros de la solucin de patrn interno de palmitato de etilo, se mezcla bien y se inyectan 5 microlitros en el cromatgrafo. La relacin de picos de cada cromatograma de las soluciones de referencia, son las que se emplearn para comparar con el problema.

Se separa por destilacin la -asarona, y el destilado se extrae con exano y se inyecta en el cromatgrafo. Se compara con una solucin de referencia, preparada con -asarona pura. Aparato y columna Se prepara el cromatgrafo con detector de ionizacin de llama. La columna en acero inoxidable de 1/8 de pulgada de dimetro exterior o bien de vidrio con 2 mm de dimetro interior por 1.8 m de longitud. La 25 fase estacionaria formada por 10% de SP-1000 sobre Chromosorb WHP de 80/100 mallas. Gas portador helio a 40 mL por minuto. Los tiempos de retencin del palmitato de etilo y la -asarona, son aproximadamente 5 y 6 minutos, respectivamente. Reactivos ALCOHOL ETILICO solucin acuosa al 20% SOLUCION PATRON INTERNO, preparada con 0.1 g de palmitato de etilo, disuelto en 100 mL de exano. SOLUCION DE REFERENCIA, preparada por disolucin de -asarona en alcohol a razn de 1 mg/mL. SOLUCION SATURADA DE CLORURO SODICO, filtrada. Tcnica operativa 1. En un matraz de destilacin, se vierten 100 mL de vino y 50 mL de agua destilada. Destilar hasta haber recogido un volumen de 100 mL. 2. Este volumen se pasa a un embudo de decantacin, al que se aaden 100 mL de solucin saturada de cloruro sdico. Se mezcla bien. 3. A continuacin se aaden 10 mL de exano, agitando vigorosamente durante 2 minutos. Se deja en reposo para que se separen las dos capas.
24. AOAC, 15 edicin, nmero 977.09, (1990).

3.72

3.73

Aparato y columna

Estireno

El cromatgrafo debe disponer de detector de ionizacin de llama. La columna, en acero inoxidable de 1/8 de pulgada y 7.5 metros de longitud. La fase estacionaria, es: Carbowax 1540 al 10% sobre Chromosorb W-AW de 60/80 mallas. Esta columna debe acondicionarse a 150 C, durante 6 horas como mnimo. Reactivos PATRON INTERNO, preparado con 35 mg de cicloexano, reactivo anlisis, disueltos en exano, hasta un volumen de 100 mL. SOLUCION DE REFERENCIA, para comparacin. Se disuelven 30 mg del monmero estireno y 35 mg de cicloexano, en 5 mL de exano.

COMENTARIOS
La determinacin de estireno en los vinos, es muy importante, ya que este producto forma parte del material de construccin de los depsitos de fibra de vidrio, tan empleados en la actualidad en las bodegas. Este compuesto, es muy soluble en el vino.

ACIDO ACETICO. Tcnica operativa 1. Los parmetros de trabajo, son: Horno isotrmico a 130 C, detector a 150 C, inyector a 180 C. Gas portador, nitrgeno a 60 mL por minuto. 2. En un embudo de decantacin de 250 mL, se vierten 200 mL de vino y 20 mL de exano. Se agita durante 3 a 4 minutos.

METODO BRUN Y GIFFONE26

Principio del mtodo Se basa en una tcnica de extraccin del vino, por cierto sencilla, con adicin de un patrn interno e inyeccin en el cromatgrafo de gas. El disolvente de extraccin es el exano y, como patrn interno, se emplea el cicloexano. Esta metdica permite detectar 10 microgramos de estireno por litro de vino.

3. A continuacin se aade 1 mL de cido actico, agtese suavemente y djese en reposo para separar las dos capas lquidas. 4. De la capa superior, se toman 2 mL y se mezclan con 2 mL de la solucin de patrn interno. Se mezcla bien y se toman 5 microlitros, para la inyeccin en el cromatgafo. 5. Para comparacion, se inyecta 1 microlitro de la solucin de referencia. Clculos Para la determinacin cuantitativa, se hace uso de la frmula que se indica a continuacin: A x H2 x h1 x q microgramos por litro Estireno X = B x H1 x h2 x F 3.75

26.S. Brun, M. Giffone y H. Matiras, Trav. Soc. Pharm. (Montpellier), 37, pginas 207-216, (1977).

3.74

en que las letras representan lo siguiente: X = Concentracin de estireno en la muestra. A = Concentracin de la solucin de referencia en g. B = Conc. de cicloexano en solucin referencia (g /L). H2 = Altura pico de cicloexano en solucin referencia. H1 = Atura pico de estireno en solucin referencia. h1 = Altura pico de estireno en la muestra. h2 = Altura pico de cicloexano en la muestra. q = Concentracion de cicloexano en la muestra. F = Relacin de volmenes de inyeccin entre la muestra referencia. Abreviadamente la frmula, se reduce a la siguiente: Estireno = 6 x H 2 x h1 H1 x h2

2. La fase orgnica superior, casi siempre permanece emulsionada. Para obtener una perfecta separacin, la fase orgnica separada, se lleva a un tubo de centrfuga y durante 5 minutos se somete a 3000 rpm. 3. Un volumen de la capa perfectamente lmpida, se coloca en el espectrofotmetro. 4. Se efecta una exploracin del espectro comprendido entre 320 y 200 nm. El estireno presenta un mximo de absorbancia, que se sita en los 248 nm. 5. Medir la absorbancia a aquella longitud de onda y tambin a 275 nm (longitud de onda a la cual el estireno tiene la mnima absorcin). Clculos Simplemente se calcula la diferencia entre la absorbancia a 248 nm y la correspondiente a 275 nm.

en microgramos/L Se traza una curva de tarado, empleando un vino exento de estireno, al que se le aaden: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 miligramos de estireno por litro. Para trazar la grfica, se somete cada una de las soluciones patrn, al anlisis como se ha indicado, llevando la diferencia de absorbancias en funcin de la concentracin de estireno

METODO POR ABSORCION EN EL Uv

Principio del mtodo

27

Por extraccin del vino con exano, puede identificarse y tambin cuantificarse el estireno, por absorcin en el ultravioleta. Reactivos EXANO. Tcnica operativa 1. Se tratan, en un embudo de decantacin, 100 mL de vino con 10 mL de exano puro. Se agita, con relativa energa, durante unos 4 minutos. Se dejan en reposo para que se separen las dos capas lquidas.
27. P.G. Garoglio, Enci. Vitivin. Mondiale, 7, pgina 67, (1973).

3.76

3.77

Metatartrico

de vanadato en 150 mL de hidrxido sdico 1 M, se pasa la solucin a un matraz aforado de 500 mL y se aaden 200 mL de la solucin de acetato sdico, completando a volumen con agua. HIDROXIDO SODICO 1 M. ACIDO SULFURICO 0.25 M. ALCOHOL ETILICO 96 %. Tcnica operativa 1. Centrifugar la muestra antes del anlisis, para que se halle ompletamente lmpida. 2. En un tubo de centrfuga, se colocan 20 mL del vino centrifugado, al que se aaden 5 mL de la solucin de acetato de cadmio.

METODO COLORIMETRICO COMENTARIOS

28

3. Se mezcla y se deja en reposo durante 10 minutos. Transcurrido el tiempo se centrifuga durante 5 minutos. 4. Se decanta con precaucin el lquido lmpido. La presencia de un precipitado en el fondo del tubo, ya indica la presencia del cido metatrtarico. 5. Para confirmarlo, se lava el residuo con 10 mL de agua destilada, procurando dejar suelto el precipitado. 6. Se aade 0.2 mL de la solucin de acetato de cadmio, se centrifuga nuevamente y se decanta el lquido. 7. En el tubo se introduce 1 mL de hidrxido sdico y se coloca en un bao mara hirviente durante 5 minutos. 8. Despus de fro se aade 1 mL de cido sulfrico y 1 mide vanadato amnico. 9. La presencia de cido metatartrico, se pone en evidencia por el color rojo que aparece. 10. Es interesante efectuar una prueba en blanco con todos los reactivos, cuyo color final ser amarillo.

El cido metatartrico se emplea para la estabilizacin de los vinos, con objeto de evitar la precipitacin del bitartrato potsico. Principio del mtodo El cido metatartrico en ambiente dbilmente cido, reacciona con el acetato de cadmio dando un precipitado insoluble en agua, que calentado con hidrxido sdico se descompone formando cido tartrico. Este ltimo reacciona con una solucin de monovanadato amnico, produciendo una coloracin roja. Reactivos
ACETATO DE CADMIO 2-hidrato al 5%, disolviendo 5 g del producto en un matraz de 100 mL con 1 mL de cido actico concentrado y completando a volumen con agua destilada. SOLUCION ACETATO SODICO al 27%. SOLUCION VANADATO AMONICO al 2%. Se disuelven 10 g

28. Deuts. Lebensm.-Rundschau, 6, pgina 167, (1969).

3.78

3.79

ACIDO CLORHIDRICO 2 M.

Acido oxlico

ACIDO CLORHIDRICO 0.1 M, saturado con oxalato de torio. Tcnica operativa 1. Se evaporan en un vaso o cpsula, 50.00 mL de vino lmpido (centrifugado o filtrado) hasta unos 10 mL. 2. Aadir 10 mL de cido clorhdrico 2 M, para obtener una solucin 1 M de clorhdrico. 3. Se aaden 2.5 mL de la solucin de nitrato de torio, agitando, sin frotar las paredes. Se deja en reposo 24 horas. 4. El precipitado formado de sal de torio del cido oxlico, se filtra a travs de un filtro sin cenizas. Dejar que se seque el filtro. 5. Colocar el filtro en una cpsula de platino y se incinera a la temperatura de 500-550 C. 6. Se enfra en un desecador y se pesa el xido de torio. Sea P el peso hallado. Clculos Para calcular la cantidad de cido oxlico, se emplea la siguiente frmula: P x 0.9549 x 20 en g/L

COMENTARIOS
El cido oxlico no est presente en el vino, aunque algunas veces se puede encontrar incidentalmente, como consecuencia del tratamiento no legalizado, para la eliminacin del exceso de calcio en el vino.

METODO HENNING Y LAY29

Principio del mtodo Consiste en la precipitacin del cido oxlico como sal de torio, que despus de calcinacin se determina como xido de torio. Reactivos SOLUCION DE NITRATO DE TORIO, se disueven 6 g del producto pentahidrato, colocado en un matraz de 100 mL, con cido clorhdrico 1 M y se completa a volumen con el mismo cido.
29. K. Henning y A. Lay, Weinberg und Keller, 12, pgina 425, (1965).

METODO ENZIMATICO
Principio del mtodo El cido oxlico se descompone en cido frmico y C02 a pH 5.0, en presencia de la oxalato descarboxilasa. El formiato formado es cuantitativamente oxidado a bicarbonato por la NAD. La cantidad de NADH formada es esteoquimtricamente igual a la cantidad de cido oxlico.

3.80

3.81

Reactivos Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmero 755699, para 10 determinaciones, que contiene 8 frascos con reactivos, que debern reconstituirse algunos con agua destilada. La conservacin, as como su reconstitucin, se indica en el folleto que acompaa a cada test. Tcnica operativa 1. Si la cantidad de cido oxlico presente en el vino es mayor que 0.2 g/L, deber efectuarse una dilucin de 10 veces. 2. Se preparan las cubetas de plstico, como en todo anlisis enzimtico. El espectrofotmetro estar situado en la longitud de onda de 340 nm, con la lmpara de tungsteno. 3. Seguir paso a paso las indicaciones del folleto adjunto al test. Clculos Para hallar la concentracin de cido oxlico, se aplica la siguiente frmula: c = 0.3959 x Ao en g por litro en donde Ao representa la diferencia de absorbancias ledas en el anlisis.

3.82