Pesquisa

Glicerol de biodiesel
RESUMO A intensiva busca por fontes alternativas de energia e processos sustentveis visando a reduo da poluio ambiental e o aquecimento global do planeta tem estimulado o mercado mundial de combustveis limpos. Os biocombustveis, como o biodiesel, representam uma alternativa renovvel e ambientalmente segura aos combustveis fsseis. Sua produo encontra-se em crescimento acelerado, e como conseqncia, a quantidade de subprodutos gerados de sua produo, principalmente o glicerol bruto. Com o objetivo reduzir os futuros problemas ambientais por acumulao de glicerol e tornar a produo de biodiesel mais rentvel, a implementao de estratgias biotecnolgicas que utilizam o glicerol como nica fonte de carbono para obteno de produtos de maior valor agregado, vem sendo estudado como uma promissora alternativa e soluo. Este trabalho descreve estudos bem documentados sobre o mecanismo metablico de glicerol por microrganismos e pertinentes com a proposta de utilizao do glicerol em processos microbianos. Da mesma forma so apresentadas novas estratgias que podem ser exploradas visando o aproveitamento deste material e sua bioconverso em bioprodutos de alto valor agregado. Palavras-chave: glicerol, fermentao, bioproduto. Biotechnological strategies for glycerol utilization derived from biodiesel production ABSTRACT The claim for reducing environment pollution stimulates the world market of clean fuels. Biofuels as biodiesel, represents a renewable and environmentally safety alternative to fossil fuel. Nonetheless, its production is increasing considerably, and as a consequence, the amount of raw glycerol (byproduct) generated is growing exponentially. With the aim to reduce environment problems due to accumulation of glycerol, biotechnological strategies for its bioconversion in value-added products are being implementing. This work presents detailed arguments on the metabolic mechanisms of glycerol assimilation by microorganisms, as well as, a description of the most recent biotechnological processes applied to obtain bioproducts from glycerol. Keywords: glycerol; fermentation; bioproduct. INTRODUO A utilizao de fontes alternativas de energia umas das grandes prioridades atuais, que vem contribuir significativamente para contornar os graves problemas ocasionados pelo desenvolvimento tecnolgico. A preocupao atual pela reduo da poluio e a crise energtica tm estimulado o mercado mundial de biocombustveis. A economia global mantmse em crescimento e a demanda por energia limpa e recursos renovveis encontra-se em contnuo aumento (BILGEN et al., 2006). Neste sentido, a busca intensiva por combustveis alternativos ao petrleo, como o biodiesel, apresenta grande importncia principalmente para os pases emergentes, uma vez que sua produo auxilia conservao do meio ambiente, mediante a reduo dos gases responsveis pelo aquecimento global, e contribui para o desenvolvimento social mediante a gerao de empregos (OLIVEIRA et al., 2006). No Brasil, a produo e comercializao de biodiesel possui importantes vantagens devido grande disponibilidade de matria-prima para sua produo e ao crescimento contnuo da indstria de leos vegetais e etanol (OLIVEIRA et al. 2006, OISTI, 2006). A produo de biodiesel est significativamente acelerada, uma vez que o governo brasileiro estabeleceu a obrigatoriedade da adio de biodiesel ao combustvel de petrleo mediante a lei 11097/2005. No ano 2013, a quantidade de biodiesel a ser adicionado dever alcanar 5 % do volume total de diesel utilizado (ANP, 2007). O glicerol o principal subproduto gerado na produo de biodiesel, sendo que aproximadamente 10 % do volume total de biodiesel produzido correspondem a glicerol (DASARI et al., 2005). Estima-se que com o incremento do volume de biodiesel, o glicerol co-produzido aumentar de 83 para 330 milhes L/ano at o ano 2010 (MME, 2007). Com o intuito de evitar futuros problemas derivados da acumulao de glicerol e para tornar a produo de biodiesel mais competitiva, torna-se necessrio a busca de alternativas para o uso do glicerol bruto gerado nesta produo. Este subproduto, na forma pura, possui inmeras aplicaes industriais (aditivos para a indstria de alimentos, qumica e farmacutica). O glicerol obtido resultante da transesterificao de triglicerdios com lcool apresenta impurezas como gua, sais, steres, lcool e leo residual, que lhe conferem um baixo custo (OOI et al.,2004). A rentabilidade de vrios processos qumicos

Estratgias biotecnolgicas para o aproveitamento do glicerol gerado da produo de biodiesel

Ilustraes cedidas pelos autores

Juan Daniel Rivaldi* Engenheiro Qumico, Mestre em Biotecnologia Industrial Escola de Engenharia de Lorena (EEL), Universidade de So Paulo(USP) *Autor para correspondncia: danielrivaldi@gmail.com Boutros Fouad Sarrouh Licenciado em Qumica; Mestre em Anlise de Processos na Indstria Qumica; Doutor em Biotecnologia Industrial Escola de Engenharia de Lorena (EEL), Universidade de So Paulo (USP) Rodolfo Fiorilo Engenheiro Qumico Gerente Industrial DAFFER Qumica Ltda. Silvio Silvrio da Silva Engenheiro de Alimentos; Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos; Doutor em Tecnologia Bioqumico- Farmacutico Escola de Engenharia de Lorena (EEL), Universidade de So Paulo (USP)
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depende em parte, da venda dos subprodutos, permitindo a reduo dos custos de produo e conseqentemente, do preo final do produto. Dessa forma, existe um grande interesse na purificao do glicerol ou no seu reaproveitamento direto, sem tratamento, o que proporcionar viabilizao do processo de produo de biodiesel, permitindo que este se torne competitivo no crescente mercado de biocombustveis. Os processos para sua purificao incluem filtrao, destilao a vcuo, descolorao e troca de ons para a remoo principalmente de K+ e Na+ utilizados como catalisadores (YONG et al. 2001). No entanto, os tratamentos de purificao so de custo excessivamente elevados para pequenos e mdios produtores nacionais de biodiesel. Devido a este fato, uma maior quantidade de efluentes contendo glicerol poder ser descartada no meio ambiente sem nenhum tratamento, aumentando conseqentemente os problemas e riscos ambientais. A converso microbiana de glicerol por processos biotecnolgicos em produtos de maior valor agregado como biomassa e biomolculas, uma alternativa relevante para a maior valorizao da produo de biodiesel (ITO et al., 2005). Neste sentido, a biotecnologia moderna, com todo seu avano trar grandes contribuies e permitir a obteno de biomolculas e produtos com importantes propriedades. NATUREZA E CARACTERSTICAS DO GLICEROL Glicerol o nome comum do composto orgnico 1,2,3-propanotriol, descoberto por Carl W. Scheele em 1779 durante a separao de uma mistura aquecida de PbO preparada com leo de oliva. Os seus sinnimos so glicerina, trihidroxipropano, glicil lcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano. Na natureza, o glicerol existe em vegetais (soja, mamona, babau, girassol, palma, algodo, coco, dend, pinho manso) e animais em formas combinadas de glicerina com cidos graxos. O glicerol tambm um composto considerado fundamental dentro do sistema metablico de microrganismos; onde atua como precursor de numerosos compostos; e como regulador de vrios mecanismos bioqumicos intracelulares (LAGES, SILVA-GRAA, LUCAS, 1999). Em microrganismos eucariticos, o glicerol constitui o principal composto formado para regular as variaes de atividade de gua em ambientes altamente osmoflicos (WANG et al., 2001). Em humanos, o glicerol participa na termo-regulao do corpo, resistncia a altas temperaturas, na resistncia dos msculos em atividades fsicas e na resposta neural da variao da glicemia (YANG et al., 1999). O glicerol na sua forma pura apresenta-se como um lquido viscoso, incolor, inodoro e higroscpico, com sabor doce, solvel em gua e lcool, insolvel em ter e em clorofrmio. Devido s suas caractersticas fsicas e qu-

micas e ao fato de ser incuo, o glicerol puro apresenta diferentes aplicaes na indstria de cosmticos, farmacutica, detergentes, na fabricao de resinas e aditivos e na indstria de alimentos. Apesar de o glicerol apresentar estas aplicaes na forma pura, poucos estudos esto sendo direcionados para a utilizao de glicerol bruto na forma direta. OBTENO E TRATAMENTO DO GLICEROL BRUTO Subproduto natural do processamento de leos e gorduras, o glicerol pode ser obtido mediante reao de saponificao de cidos graxos (leos, azeites ou sebo) com hidrxido de sdio ou hidrxido de potssio, como co-produto da fabricao de biodiesel e em menor proporo, mediante sntese microbiana. A produo sinttica de glicerina a partir de cloreto de alil via epicloridrina encontra-se em declnio devido ao excesso no mercado de glicerol do processo de biodiesel. Dentro deste contexto, o glicerol constitui o maior subproduto gerado no processo de produo do biodiesel via esterificao de cidos graxos vegetais ou gordura animal com lcool (metanol ou etanol) para produzir steres e glicerol na presena de catalisador (KOH ou NaOH) (DIECKELMANN e HEINZ, 1988) A equao global de transesterificao apresentada na Figura 1a, onde so necessrios trs moles de lcool por cada mol de triglicerdeo utilizado. Esta reao global conseqncia de um nmero de reaes reversveis e consecutivas mostradas na Figura 1b. A primeira consiste na converso de triglicerdeos em diglicerdeos, seguida da converso destes diglicerdeos em monoglicerdeos, e finalmente de glicerdeos a glicerol, rendendo uma molcula de s-

ter de lcool por cada glicerdeo em cada etapa da reao. No final da etapa de transesterificao, o glicerol e steres formam uma massa lquida de duas fases, que so facilmente separveis por decantao ou centrifugao. A fase superior, a mais leve ou menos densa, contm os steres metlicos ou etlicos constituintes do biodiesel. A fase inferior ou pesada encontra-se composta de glicerol bruto e impurezas. O valor do glicerol bruto obtido da produo de biodiesel encontra-se entre 0,2 a 0,4 R$/kg. Este baixo valor atribudo ao contedo de aproximadamente 30 % (p/p) de impurezas e ao grande volume deste co-produto gerado pelas indstrias. O glicerol bruto apresenta-se na forma de lquido viscoso pardo escuro, que contm quantidades variveis de sabo, lcool (metanol ou etanol), monoacilglicerol, diacilglicerol, oligmeros de glicerol, polmeros e gua (OOI et al., 2004). A porcentagem de glicerol na mistura varia entre 65 a 70 % (p/ p), sendo a maior parte das impurezas sabo formado pela reao dos cidos graxos livres com excesso de catalisador (saponificao). Dessa forma, o aspecto do glicerol bruto encontra-se estreitamente relacionado ao contedo de sabo, que proporciona aparncia de viscoso e escuro. Para reduzir o sabo gerado, recomenda-se conduzir a reao de transesterificao com matrias primas (triglicerdeos) com baixo contedo em cidos graxos livres e gua, ao mesmo tempo de reduzir a quantidade de catalisador (OOI et al., 2004). A mistura residual resultante submetido ao processo de acidulao com cido concentrado (HCl, H2SO4, ou H3PO4) para a separao de glicerol e cidos graxos do sabo (Figura 2a). No entanto, a maior parte dos processos de tratamento de glicerol conduzida utilizando HCl ou H2SO4, sendo

Figura 1. (a) Reao global e (b) Reaes consecutivas de transesterificao de triglicerdeos. R1, R2, R3 e R representam grupos alquilas
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o H3PO4 restrito pelo alto custo. Durante a acidulao, forma-se certa quantidade de sal (reao do cido inorgnico com on do sabo) que se deposita na fase inferior de um lquido de trs fases, estando a fase superior constituda pelos cidos graxos livres, e a fase intermdia composta principalmente por glicerol e lcool (Figura 2b). O glicerol recuperado alcana concentraes superiores a 80 % (p/p), com quantidades variveis de gua, corantes e lcool. Posteriormente, o glicerol com excesso de cido neutralizado com soluo de NaOH e submetido a tratamento trmico (70 oC) para eliminar os componentes volteis (recuperao de lcool)(OOI et al., 2004; FUKUDA, KONDO, NODA, 2001). Nesta forma, parcialmente livre de impurezas, o glicerol pode ser utilizado como substrato de fermentao por vrias espcies de microrganismos. As caractersticas fsicas, qumicas e nutricionais do glicerol bruto dependem do tipo de cido graxo (gordura animal ou leo vegetal) e do tipo de catlise empregada na produo de biodiesel. No entanto, a procura pela glicerina purificada muito maior, devida ao seu valor econmico. A

aplicao do glicerol na indstria est condicionada ao grau de pureza, que deve ser igual ou superior a 95%. Para obter grau de pureza superior a 95% (p/p)(grau alimentcio ou farmacutico), o glicerol deve ser submetido a destilao, mas sob custo elevado . Por outro lado, de acordo com a Tabela 2, o glicerol bruto contm elementos nutricionais, como, fsforo, enxofre, magnsio, clcio, nitrognio e sdio, e que so factveis de serem utilizados por microrganismos para o seu crescimento durante processos fermentativos (THOMPSON, HE, 2006). ASSIMILAO, METABOLISMO E CONVERSO MICROBIOLGICA DO GLICEROL. O glicerol considerado uma fonte de carbono altamente reduzida e assimilvel por bactrias e leveduras sob condies aerbicas e anaerbicas19 para a obteno de energia metablica, como regulador do potencial redox e para a reciclagem de fosfato inorgnico dentro da clula (DILLIS et al., 1980).

Vrios estudos foram desenvolvidos visando a utilizao de glicerol como fonte de carbono por microrganismos, especialmente por bactrias. Muitos deles apontam principalmente a mecanismos de assimilao de glicerol por estes microrganismos para a produo de compostos intermedirios de polmeros, resinas e aditivos para combustveis (PAPANIKOLAOU et al., 2002; ITO et al., 2005; CHENG et al 2007). O transporte do glicerol atravs da membrana celular constitui a primeira etapa para o seu metabolismo. De uma forma geral, a assimilao de glicerol por parte dos microrganismos envolve o transporte passivo (GANCEDO, GANCEDO, 1968) e transporte ativo (LAGES, SILVA-GRAA, LUCAS, 1999) atravs da membrana plasmtica. O transporte passivo inclui a difuso simples (permeao no especfica) e a difuso facilitada mediada por protenas localizadas nas camadas mais internas da membrana plasmtica (MIP), as permeases. A difuso simples, sendo ATP no dependente, requer um gradiente de concentrao para o transporte do substrato atravs da membrana. Conseqentemente, a concentrao do substrato no interior da clula no

Figura 2. (b)- Separao do glicerol aps tratamento com cido concentrado, a fase superior corresponde a cidos graxos, fase intermdia: glicerol, fase inferior: glicerol + sais

Figura 2. (a) - Fluxograma de produo de biodiesel e tratamento de purificao do glicerol

supera aquela encontrada no meio de cultura(MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002). Na levedura Saccharomyces cerevisiae, estudos desenvolvidos por Luyten et al. (1995), assinalaram a existncia de permeases FPS1, especficas para transporte de glicerol (Figura 3). O glicerol um dos poucos substratos que atravessa a membrana celular por difuso facilitada nas clulas procariticas. Em bactrias como Escherichia coli, a protena do

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tipo poro-canal-G1pF atua por sensibilidade mecnica sem gasto energtico na presena de glicerol. Este facilitador permite a assimilao, alm de glicerol, de pequenas molculas de polihidroxi lcoois, uria e glicina, mas exclui molculas carregadas como gliceraldedo-3-fosfato e dihidroxiacetona fosfato(HOLST et al., 2000). Em quanto aos mecanismos genticos, foram descritos trs genes responsveis pela assimilao e regulao do contedo intercelular de glicerol em Saccharomyces cerevisiae, o GUP1 e GUP2 (HOLST et al., 2000) e FPS1(LUYTEN et al.,1995) associados diretamente com o transporte facilitado e que so expressas conforme estmulos provocados nas clulas, como o estresse osmtico. Por outro lado, mecanismos de transporte ativo simporte glicerol/H+ e simporte glicerol/Na+ (dependentes de ATP) foram descritos em numerosas espcies de leveduras, entre elas Debaryomyces hansenii, Pichia sorbitophila, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii (LAGES, SILVA-GRAA, LUCAS, 1999). Tanto as acumulaes de glicerol por estresse, como a existncia de mecanismos ativos, so comuns em grande variedade de leveduras (LAGES, LUCAS, 1997). Aps a passagem do glicerol atravs da membrana plasmtica pelos possveis mecanismos, o glicerol pode ser catabolisado por vrias rotas metablicas independentes, apresentado na Figura 4. Uma das rotas, provavelmente a principal para a oxidao de glicerol por leveduras, consiste na fosforilao do glicerol pela enzima glicerol-quinase para formar glicerol3-fosfato, que reduzido a dihidroxiacetona fosfato pela enzima mitocondrial glicerol fosfo-ubiquinona oxidoreductase (FAD dependente)(GANCEDO, SERRANO, 1989).

Figura 3. Tipos de transporte para a assimilao de glicerol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. FPS1 e YFLO54c so protenas de transporte, GUT1 e GUT2 so genes para expresso de enzimas de assimilao de glicerol. (Baseado em: NEVES, LAGES, LUCAS, 2004)
Estudos demonstraram que, os genes que controlam a sntese das enzimas glicerolquinase e fosfo-ubiquinona oxidoreductase so GUT1 e GUT2, respectivamente (GRAUSLUND, LOPES, RONNOW, 1999). A expresso dessas enzimas reprimida durante o crescimento celular em substratos fermentescveis como glicose, mas desregulado quando glicerol ou etanol utilizado como a principal fonte de carbono (GRAUSLUND, RONNOW, 2000).

Outra possvel via catablica do glicerol corresponde oxidao de glicerol e conseqente formao de dihidroxiacetona pela enzima glicerol desidrogenase. Aps, a dihidroxiacetona fosforilada a dihidroxiacetona fosfato pela enzima dihidroxiacetona quinase dependente de Adenosina Trifosfato (ATP). Gancedo e Gancedo (1968) reportaram que leveduras da espcie Schizosaccharomyces pombe, por exemplo, oxida glicerol mediante essa via sob condies de stress osmtico. A dihidroxiacetona fosfato considerada uma importante molcula intermediria para a gliconeognese (sntese de hexoses), assim como para a obteno de numerosos compostos atravs das vias oxidativas, incluindo, cido ctrico, cido succnico, cido actico, cido frmico, cido ltico, etanol e outros compostos de interesse comercial (MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002). O crescimento de microrganismos em fontes de carbono alternativas aos carboidratos, como L-malato, acetato, ou glicerol, requer a capacidade de sintetizar hexoses necessrias para a produo de mucopeptideos da parede celular, armazenagem de glicognio, e outros compostos derivados de hexoses, como as pentoses, envolvidos na biosntese de cidos nuclicos (MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002). Tambm, Hauge, King e Cheldelin (1955), fazem referncia sobre a capacidade de algumas bactrias, entre elas Acetobacter suboxydans, de oxidar a molcula de dihidroxiacetona fosfato pela via pentose-fosfato, incrementando o nmero de bioprodutos possveis de serem obtidos por via biotecnolgica a partir de glicerol. Em espcies de leveduras do gnero Yarrowia sp., e em bactrias como Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobacter agglomerans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri and Bacillus welchii (ZHAO, CHEN, YAO, 2006; GONZLEZ PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007), observa-se que sob condies de anaerobiose, o glicerol sofre desidratao pela enzima glicerol desidratase para produzir 3-dihidroxipropionaldedo. Posteriormente, este intermedirio transformado pela enzima NADH dependente 1,3propanodiol oxido-reductase para gerar 1,3propanodiol, principal intermedirio para produo de polmeros, resinas e aditivos de importantes aplicaes industriais (GONZLEZ PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007). Uma vez que o glicerol assimilado no interior da clula, numerosos compostos so produzidos como conseqncia do seu metabolismo. BIOPRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO MICROBIANA DO GLICEROL A extraordinria expanso da indstria de biodiesel no Brasil e no mundo vem originando grandes volumes do principal co-produto, o glicerol. A superproduo de glicerol afeta negativamente o preo do biodiesel no mercado, tornando imperiosa a busca de novas

Tabela 1. Composio do glicerol bruto obtido durante a produo de biodiesel em funo de diferentes matrias prima. (Adaptado de: THOMPSON, HE ,2006)

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Figura 4. Vias metablicas de assimilao de glicerol por microrganismos e seus possveis produtos. (Adaptado de: GANCEDO, GANCEDO, 1968; HAUGE, KING, CHELDELIN, 1955; XIU et al., 2007)
aplicaes para este co-produto. Neste contexto, o glicerol vem sendo investigado como a futura fonte de carbono em processos microbianos para a obteno de bioprodutos de alto valor agregado. A continuao, detalham-se os recentes processos fermentativos aplicados nos laboratrios de pesquisa cientfica para a obteno de bioprodutos a partir do glicerol, independente do seu origem. 1,3-Propanodiol O propanodiol um composto intermedirio para a sntese de compostos cclicos e monmeros para polisteres, poliuretanos
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e polipropileno tereftalato. conhecido que os processos qumicos tradicionais de produo so altamente nocivos devido ao compostos txicos formados. As pesquisas mais importantes na utilizao biotecnolgica do glicerol bruto apontam principalmente produo do composto intermedirio 1,3propanodiol (GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007). Atualmente, estes compostos so produzidos quase exclusivamente a partir de um derivado do petrleo, o xido de propileno, mediante processos qumicos convencionais (SULLIVAN, 2003). O campo de aplicao do composto 1,3propanodiol considerado amplamente

abrangente, diferentes setores comerciais, desde a produo de polimeros, tintas, resinas de polister, lubrificantes, anti-cogelante, at produo de cosmticos. Mediante fermentao de glicerol bruto por Klebsiella pneumoniae foram obtidos concentraes de at 56 g/L em escala de laboratrio. No entanto, a produo de 1,3-propanodiol a escala industrial encontra-se limitado devido a que os a maioria dos microrganismos produtores, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Propionibacterium and Anaerobiospirillum, so considerados patognicos e requerem de condies estritas de anaerobiose e nutrientes especficos para seu desenvolvimento (BARBIRATO et al., 1997). Uma soluo futura para o scale-up consistiria na utilizao de ferramentas da engenharia gentica para inserir genes que expressem enzimas geradoras de 1,3-propanodiol em microrganismos mais adaptados a condies industriais, como por exemplo, a bactria Escherichia coli (DHARMADI, MURARKA, GONZLEZ, 2006). Notoriamente, muitas espcies apresentam a capacidade de fermentar o glicerol produzindo 1,3propandiol, entre elas podem ser citadas Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobacter agglomerans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri and Bacillus welchii (BARBIRATO et al., 1997; GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007) . Atualmente, as bacterias Clostridium butyricum e Klebsiella pneumoniae so consideradas as de maior utilizao e provavelmente sejam as melhores produtoras deste composto (XIU et al., 2007). Recentemente, Gonzlez-Pajuelo et al. (2005) comparando uma espcie natural de Clostridium butyricum VPI 3266 com outra geneticamente modificada Clostridium acetobutylicum DG1(pSPD5) (contendo genes para produo de 1,3-propanodiol), observaram que no tempo de 47 h de fermentao em batelada alimentada, a cepa modificada alcanou maior produtividade (0,65 mol/mol de glicerol, 1,7 g/L h) que a cepa natural (0,69 mol/mol, 1,21 g/L.h). Em fermentao contnua de glicerol bruto e comercial (pureza: 80-90% ) em uma taxa de diluio (D) de 0,05 h-1 (pH 6,5; 35 oC) com a mesma cepa modificada, foram obtidos valores de rendimento e produtividade similares aos observados em batelada alimentada (0,61-0,64 mol/mol glicerol, 1,49-1,56 g/L.h). Os mesmos autores reportaram alta produtividade em 1,3-propanodiol (10,3 g/L.h) em cultivo contnuo da bactria Clostridium butyricum (GONZLEZ-PAJUELO, ANDRADE, VASCONCELOS, 2005). Outro aspecto considerado de importncia a imobilizao de clulas em diferentes polmeros para sua re-utilizao em fermentaes consecutivas. O encapsulamento de clulas de Klebsiella pneumoniae em celulose-sulfato de sdio e policloreto de metil dialil amnia desenvolvido por Zhao, Chen e Yao (2006), permitiu executar fermentaes em batelada repetida, batelada alimentada e processo contnuo para a obteno de 1,3propanodiol sob concentraes de glicerol to elevadas quanto 120 g/L. A quantidade de produto obtido foi de 63,1 g/L (5,7 g/L.h), 51,86 g/L(1,08 g/L.h) e 13,6 g/L (4,5 g/L h) para fermentao em batelada simples, batelada alimentada e fermentao contnua, respectivamente. Apesar dos valores de produtividade na fermentao por batelada alimentada serem menores que na batelada simples, os resultados sugerem a potencialidade da

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reutilizao de clulas imobilizadas, principalmente por fornecer um ambiente estvel para a clula frente a altas concentraes de substrato. A co-fermentao de glicerol e glicose foi avaliada por Xiu et al. (2007) para a produo de 1,3-propanodiol por Klebsiella pneumoniae DSM2026. Na relao glicose-glicerol igual a 0,2 e sob condies de microaerao foram alcanados valores de produtividade igual a 1,95 g/L.h. Os primeiros estudos tecnolgicos para o aumento de escala foram desenvolvidos por Cheng et al. (2007), utilizando reator em processo por batelada alimentada de 5000 L de volume total. Sob condies de baixo potencial de oxidao, alcanado mediante fluxo de nitrognio gs (0,15 vvm), foram fermentados 4000 L de meio contendo 40 g/L de glicerol a pH 6,8 ; 90 rpm e 37oC. A concentrao mxima de produto foi de 58,8 g/L, mas com uma produtividade ainda baixa de 0,92 g/L.h. Estes resultados iniciais demonstram a factibilidade da produo de 1,3propanodiol a escala piloto, mas novas tentativas devero ser conduzidas para a sua otimizao visando a projeo industrial. Etanol Etanol, butanol, e outros compostos so coproduzidos durante a fermentao de glicerol (DABROCK, BAHL, GOTTSCHALK, 1992). Ito et al. (2005) demonstraram a possibilidade de produzir etanol e hidrognio por Enterobacter aerogenes HU-101 utilizando efluentes da indstria de biodiesel contendo ate 41% (p/p) de glicerol. Convenientemente diludo (7,3 g/L), o efluente foi fermentado em forma descontnua em frascos anaerbicos e em forma contnua utilizando reator de coluna empacotada. Na fermentao descontnua, os rendimentos em hidrognio e etanol foram de 0,89 mol/mol de glicerol e 1 mol/mol glicerol, respectivamente. Rendimentos acima de 10 g/L foram obtidos em processo contnuo empregando cermica porosa como suporte de microrganismos. Neste processo, comparando meios contendo efluente de biodiesel e glicerol comercial, os mesmos autores observaram que produo de hidrognio foi maior naquele meio com glicerol parcialmente purificado (60 mmol/L.h) que utilizando efluente (30 mmol/L h). Aparentemente, as impurezas que acompanham o efluente aumentaram a fragilidade dos flocos de microrganismos, facilitando o wash- out das clulas do reator na mesma taxa de diluio. Em outros trabalhos, etanol e cido frmico foram os principais produtos da fermentao de glicerol pela bactria Klebsiella planticola, em concentraes equimolar acima de 2 g/L (JARVIS, MOORE, THIELE, 1997). Estes resultados estimulam a procura de novos microrganismos para a fermentao de glicerol visando a produo de etanol e hidrognio. cidos orgnicos Tambm, existem numerosos trabalhos direcionados para a produo de cido ctrico e cido succnico por fermentao de glicerol. Estes compostos so de ampla aplicao na

indstria de alimentos e constituem importantes intermedirios para a indstria de polmeros e produo de compostos qumicos como o 1,2-butanodiol e 2,4-butanodiol. Papanikolaou et al. (2002) obtiveram considervel quantidade de cido ctrico, de ordem de 35 g/L, mediante fermentao de glicerol por Yarrowia lypolitica. Por sua parte, Rymowicz et al. (2006) publicaram estudos de assimilao de glicerol desenvolvidos com trs cepas mutantes de Yarrowia lypolitica, obtendo concentraes de at 124,5 g/L de cido ctrico. A produo de cido succnico e cido actico a partir de glicerol por Anaerobiospirillum succiniciproducens resultou em concentraes 6,5 vezes superiores a aquelas obtidas utilizando glicose como nica fonte de carbono (LEE et al., 2001). A sntese de cido propinico por clulas de Propionibacteria acidipropionici e Propionibacteria freudenreichii ssp. shermanii imobilizadas em alginato de clcio foi reportado por Bories et al. (2004). Sob condies de alta concentrao de glicerol obtiveram-se concentraes de cido propionico de at 42 g/L. Polihidroxialcanoatos A preocupao pela reduo dos contaminantes ambientais vem acelerando novas pesquisas para a produo de polmeros biodegradveis. Espcies de Pseudomonas produzem naturalmente polihidroxialcanoatos (PHA), polisteres lineares de compatvel com uma ampla faixa de potenciais aplicaes devido a suas propriedades fsicas e biodegradabilidade (ASHBY, SOLAIMAN, FOGLIA, 2005). Muitos microrganismos acumulam PHA sob condies de estresse, principalmente quando submetidos falta de nitrognio, fsforo ou oxignio, e utilizam esse polmero quando a fonte externa de carbono limitada. Historicamente, os cidos graxos foram utilizados extensivamente para a sntese de PHA (ASHBY, SOLAIMAN, FOGLIA, 2005). Glicerol proveniente da produo de biodiesel apresenta-se como uma opo de substrato econmico para a produo deste tipo de biopolmeros. Borman e Roth (1999) utilizaram Methylobacterium rhodesianum para produzir polihidroxibutirato (PHB) na concentrao de 10,5 g/L em fermentao por batelada com meio contendo 5 g/L de glicerol e casena peptona. Koller et al. (2005) obtiveram polihidroxialcanoatos numa concentrao mxima de 16,2 g/L, mediante fermentao em batelada alimentada de soro de queijo e glicerol bruto por uma cepa selvagem de levedura. Para estressar as clulas, o cultivo foi conduzido sob tenso de oxignio (taxa de 10 mL/min) e sem outra fonte de fsforo alm daquela fornecida pelos 2,5 g/L de extrato de levedura. Um ponto interessante nesta pesquisa foi a capacidade da cepa selvagem de produzir simultaneamente 3-hidroxivalerato (8-10 % do total de PHA) sem necessidade dos precursores cido propinico ou cido valrico.

Ashby, Solaiman e Foglia (2005) utilizaram duas cepas, Pseudomonas oleovorans B-14682 e Pseudomonas corrugata 388 para a produo de PHA. Partindo de concentraes mximas de 50 g/L glicerol, as cepas P. oleovorans e P.corrugata produziram 0,97 g/L de Poli 3-hidroxibutirato (P3HB) e 0,67 g/L de acido hidroxidodecenico, respectivamente. De igual forma, foi observada a capacidade de produo de blend de P3HB and PHA em diferentes propores por cultura mista dos microrganismos estudados. cido graxo poliinsaturado mega-3 De conhecidas propriedades teraputicas contra numerosas enfermidades cardiovasculares, cncer e Alzheimer, os cidos graxos poliinsaturados mega-3 (AGPI -3) so geralmente obtido a partir de fontes naturais como leos vegetais ou de peixes. Recentemente foram desenvolvidos trabalhos para a produo de AGPI-3 a partir da microalga heterotrfica Schizochytrium limacinum que possui capacidade produzir altos nveis de cido docosahexaenico (DHA). Pyle e Wen (2007) observaram que aps 5 dias de crescimento em frascos Erlenmeyer (pH 8, 20 oC, 170 rpm), aproximadamente 18 g/L de clulas da microalga se formavam em meios independentes contendo glicose, glicerol puro e glicerol bruto na concentrao de 90 g/L. Foram analisados alguns parmetros cinticos como a velocidade especfica de crescimento , 0,685/ h; rendimento em biomassa, 0,284 g/g glicerol bruto; rendimento de DHA, 171,27 mg/g glicerol bruto e rendimento volumtrico de 3,08 g/L. Tambm, foi estudado o efeito de diferentes concentraes de glicerol bruto contendo sabo sobre o crescimento da microalga. Concentraes superiores a 40 g/L deste glicerol, influenciaram negativamente no crescimento da microalga, sendo que na concentrao de 90 g/L observou-se a morte das clulas aps 2 dias de cultivo. Estes resultados podem ser considerados timos, desde que no se necessitaria de uma etapa de prtratamento do glicerol para a separao do sabo, etapa geralmente longa e de custo elevado. O trabalho demonstra que um leque de oportunidades pode ser aberto com pesquisas utilizando exclusivamente algas heterotrficas e glicerol como fonte de carbono. Avanos tecnolgicos no aproveitamento do glicerol no Brasil Recentemente, no XVI Simpsio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM 2007) foram apresentados numerosos trabalhos na busca de solues biotecnolgicas para a utilizao de glicerol originado da produo de biodiesel. Por exemplo, Meinicke, Vendruscolo e Ninow (2007) compararam diferentes meios contendo concentraes variveis de glicerol e glicose como fonte de carbono para a produo de corantes naturais pelo fungo filmamentoso Monascus ruber. A mxima produo de pigmentos vermelhos em frascos Erlenmeyer foi de 5,2 UDO480 nm (1 unidade UDO (Abs) corresponde a 15 mg/L de pigmento) e produtividade de (0,0596 UDO480nm./h) utili49

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zando fonte de carbono mista (5 g/L de glicose e 15 g/L de glicerol). Os autores observaram que variaes no valor de pH podem regular a proporo do tipo de pigmentos encontrado no meio. Valores de pH inferiores a 5,5 encontram-se associados formao de pigmentos amarelos, sendo que os valores superiores favorecem a produo de pigmentos vermelhos. Tambm, o glicerol resultante da transesterificao de leo de mamona demonstrou ser uma fonte de carbono apropriada para produo de biosurfactante ramnolipdeo (uma ou duas molculas de ramnose e cido graxo de cadeia longa) por Pseudomona aeruginosa59. A concentrao da fonte de nitrognio (NaCO3) representou ser um fator preponderante na produo do biosurfactante, comprovado pela reduo da tenso superficial da gua maior a 45,7 % e ndice emulsificao s 24 h superior a 56,1 % para os diferentes hidrocarbonetos testados (querosene, hexadecano e isso-octano). Prieto et al 2007 obtiveram resultados similares na produo de ramnolipdeos, comprovando a maior influncia do NaNO3 na produo de biosurfactante pela mesma espcie de microrganismo, seguido por NH4NO3, uria e NH4SO4. Recentemente, em trabalhos de pesquisa visando a seleo de leveduras aptas para a assimilao e crescimento em glicerol comercial, verificamos que algumas espcies, incluindo Kluyveromyces marxianus e Candida batistae, apresentaram elevada capacidade de crescimento neste substrato. Dentre as leveduras estudadas, Hansenula anomala e Candida tropicalis mostraram capacidade de produzir etanol em concentraes de 3,5 e 6,1 g/L, respectivamente61. Estes resultados, ainda preliminares, so promissores para produo de etanol a partir de glicerol por esses microrganismos. Por outro lado, Volpato et al (2007) isolaram de ambientes amaznicos diferentes cepas de Bacillus com capacidade de produzir lpases utilizando glicerol como fonte de carbono. A mxima atividade lipoltica em glicerol (24,3 U/L) foi obtida com o isolado BL74. Destaca-se tambm a possibilidade da fermentao de glicerol de biodiesel por Streptomyces clavuligerus para a produo de cido clavulnico, potente inibidor de betalactamases, que junto com a penicilina e cefalosporina so utilizados contra infecciones bacterianas. O trabalho desenvolvido por Gutierrez e Costa Arajo (2007) comparou a suplementao continua de meios de cultura contendo concentraes variveis de fonte de aminocidos e glicerol para a produo de cido clavulnico. Aps 120 h de fermentao, a mxima concentrao de cido clavulnico obtido foi de 60 mg/ L. Na busca de novas cepas fermentadoras de glicerol, Silva e Contiero (2007) isolaram a bactria GLC29 produtora de 10,8 g/L de 1,3-propanodiol a partir de 20 g/L de glicerol. Este estudo soma-se s numerosas pesquisas desenvolvidas em outros pases para a produo deste glicol com impor50

tantes aplicaes industriais (GONZALEZPAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007). Estes e outros estudos demonstraram a potencialidade da utilizao do glicerol, proveniente da produo de biodiesel, como fonte de carbono para a produo de compostos qumicos de interesse comercial. Embora, em etapas iniciais, novas linhas de pesquisas esto sendo definidas para obter compostos de maior valor agregado, que incluam principalmente molculas bioativas, como protenas e ribonucleotdeos, para a indstria alimentcia e farmacutica. A utilizao de biorefinarias para converso de glicerol bruto apresenta-se como uma estratgia promissora para evitar futuros problemas de acumulao deste subproduto, ao tempo de aumentar a rentabilidade da produo de biodiesel. Aspectos econmicos O excesso de glicerol proveniente da produo de biodiesel associado baixa demanda mundial (0,5 bilhes ton/ano) e baixo custo, projetam um desequilbrio econmico nas indstrias oleoqumicas e de refino de glicerol, ao tempo de pr em risco a sustentabilidade econmica de usinas de biodiesel no mundo (HGCA, 2007). No Brasil, a maioria das plantas industriais de biodiesel no valoriza efetivamente o glicerol. A projeo do volume de glicerol no pas para o ano 2013 de 488 milhes e as perspectivas, nesse sentido, no so auspiciosas, devido a que poucas apresentam planos futuros para sua converso em produtos de maior valor agregado. O uso intensivo deste co-produto essencial para a sustentabilidade econmica da indstria de biodiesel no pas. A queda brusca do preo do glicerol no cenrio internacional nos ltimos 5 anos tem obrigado paralisao da produo da glicerina sinttica a partir de propileno. O excesso de volume de glicerol, o alto preo do propileno e as vantagens de produzir compostos derivados da indstria petroqumica de maior valor, conspiraram para o severo declnio das indstrias de glicerina sinttica (HGCA, 2007). Nos Estados Unidos, o valor do glicerol diminuiu de 1048 R$/t em 2004 para aproximadamente 125 R$/t no ano 2006 (YAZDANI, GONZALEZ, 2007). No Brasil, atualmente o preo FOB (Free on Board) do glicerol bruto varia de 200 a 400 R$/t, sendo o valor do glicerol loiro (parcialmente tratado para remoo de impurezas) de 600 a 800 R$/t. Estimase que na prxima dcada, sempre que se mantenha a tendncia favorvel para o biodiesel, o preo do glicerol co-produzido poderia diminuir ainda mais. Considerando a situao e a projeo para os prximos anos, a utilizao do glicerol como substrato para fermentao poderia torna-se vantajoso em relao ao preo de outros resduos tradicionalmente utilizados como fonte de carbono para a obteno de bioprodutos. Por exemplo, o preo do melao de cana de acar no mercado internacional varia entre os 120 e 170

R$/t, outro exemplo corresponde ao valor do bagao de cana que oscila entre 9,5 e 24 R$/t. Neste ltimo caso, o bagao deve ser submetido a tratamentos fsicos, qumicos ou enzimticos para disponibilizar a glicose, o que elevaria o preo final do substrato. A produo industrial de biomolculas por fermentao de glicerol economizaria custos de processos tradicionais que requerem etapas de elevado consumo energtico para extrao e acondicionamento do substrato (sacarose de cana de acar ou glicose de amido de milho). O grande desafio no Brasil ser incentivar as pesquisas biotecnolgicas que, timidamente, vem sendo desenvolvidas no pas. Alem disso, facilitar a imediata transferncia tecnolgica dessas descobertas na prpria usina de biodiesel, permitindo reduzir custos de transporte para converter o biodiesel em um biocombustvel de alta rentabilidade econmica. CONCLUSO Desde que alguns governos estipularam normativas que obriga a adio de biodiesel ao combustvel de petrleo, grande quantidade de glicerol vem sendo gerada, tornando-se necessria a busca de alternativas para sua utilizao. Numerosas pesquisas esto sendo desenvolvidas nesse sentido, no entanto, os esforos ainda constituem uma soluo em longo prazo para a acumulao de glicerol. A biotecnologia apresenta alternativas para a obteno de produtos de alto valor agregado como bio-pesticidas, pigmentos, aromas, polmeros, antibiticos e protenas recombinantes. No entanto, preciso estudar com maior detalhe aspectos de engenharia bioqumica como agitao, aerao, cintica de crescimento e obteno de produtos, e transferncia de massa e energia. Estes parmetros so considerados essenciais para entender os mecanismos de utilizao de microrganismos assim como para a otimizao de processos, objetivando a futura ampliao de escala. Estratgias mais detalhadas para a utilizao biotecnolgica do glicerol so esperadas em poucos anos, de forma a reduzir os impactos ambientais e tornar o biodiesel um produto altamente competitivo no mercado mundial de biocombustveis. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro da CAPES e o CNPq para o desenvolvimento de projetos de pesquisas. REFERNCIA AHN, W.S.; PARK, S.J.; LEE, S.Y.; Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 3624 ANSELL, R.; GRANATH, K.; HOHMANN, S.; THEVELEIN, J.M.; ADLER, L.; EMBO J. 1997,16, 2179

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