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Brazilian Journal of Microbiology (2009) 40:254-261 ISSN 1517-8382

Deteco de resistncia a meticilina e produo do fator slime por Staphylococcus aureus em mastite bovina
Este estudo objetivou a deteco de Staphylococcus aureus resistente a meticilina e produtor do fator slime em casos de mastite bovina. Um PCR triplex foi otimizado, com alvo no genes 16SrRNA, nuc e mecA para deteco de Staphylococcus spp, S. aureus e resistencia a meticilina, respectivamente. Para deteco das cepas produtoras do fator slime, empregou-se um PCR com alvo nos genes icaA e icaD. No estudo, 59 cepas foram identificadas como S. aureus por testes convencionais e PCR, sendo 13 resistentes a meticilina e quatro positivas para o gene mecA. Embora 22 das 59 cepas tenham sido produtoras do fator slime em Agar Vermelho Congo, no teste PCR somente 15 foram positivas para os genes icaA e icaD. Dezesseis e 38 das 59 cepas foram positivas para os genes icaA e icaD, respectivamente. Somente duas das 59 cepas foram positivas simultaneamente para resistncia a meticilina e produo do fator slime, sugerindo falta de correlao entre estas caractersticas. Em concluso, o PCR triplex otimizado neste trabalho mostrou-se ser um mtodo rpido e confivel para deteco de S.aureus meticilina resistente. Por outro lado, somente PCR para os genes icaA e icaD pode no ser suficiente para detectar produo de fator slime e outros estudos com alvo em outros genes ica so necessrios para um avaliao correta da produo do fator slime por S. aureus. .

Material e Metodos Isolados bacterianos e identificao fenotpica As bactrias utilizadas neste estudo consistiu de 161 Staphylococcus spp. isolados de amostras de leite masttico subclnica. Os isolados de estafilococos foram identificados morfologicamente e bioquimicamente por procedimentos laboratoriais do standart (35). Para a discriminao de S. aureus a partir coagulasenegative stahylococci (ECN), o teste de coagulase foi realizada. Slime ensaio de produo Slime ensaio de produo foi realizada pelo cultivo das cepas de S. aureus em Agar Congo Vermelho (CRA) placas contendo 0,8 g de corante vermelho Congo e 36 g de sacarose (49). Cepas foram inoculadas em placas CRA e incubadas por 24-72 horas a 37 C. Slime cepas produtoras e no-cepas produtoras de slime constitui grosseira colnias preto e vermelho em colnias CRA, respectivamente. PCR deteco de genes ICAA e ICAD Por determinao genotpica da produo de lodo, a PCR genes alvo ICAA e ICAD foram realizadas (47). os primers para ICAA e ICAD genes foram designados a partir publicado seqncia do locus ica no GenBank e sintetizado a partir do Bio Bsico Inc. Para o amplificador da ICAA, AF (5'-CCT AAC TAA CGA AAG GTA G-3 ') e AR (5'AAG ATA TAG CGA TAA GTG C -3 ') e primers de ICAD gene, DF (5'-AAA CGT AGA AAG GGT GG-3 ') e DR (5'-GGC AAT ATG AAG ATC ATA-3 ') foram usados primers. A PCR com os genes ICAA e ICAD foram amplificados um produto de 1315 pb e 381 pb, respectivamente. Dez microlitros do DNA extrado rpida foi usado como um modelo em uma mistura PCR 50 ul, contendo 1X tampo de PCR (50 milmetros KCl, 20 mM Tris HCl), 5 mL de 25 mM MgCl2, 5 mL de 10 mM desoxinucletidos trifosfato mix (dNTP), 1 ml de 20 mM de cada primers e 1U de Taq DNA polimerase. Os buffers e enzimas usadas no ensaio foram obtidos a partir Fermentas Inc. A amplificao do DNA foi realizada da seguinte forma: 92 C por 5 min de desnaturao

inicial; 30 ciclos de 92 C por 1 min, 49 C por 1 min e 72 C por 1 min e uma extenso final a 72 C por 7 min. Amplicons foram carregados em gel de agarose 1,5% contendo 1 mg / ml brometo de etdio. A presena e peso molecular de os fragmentos de DNA amplificados foram confirmados por gel de agarose eletroforese e visualizados sob luz ultravioleta. Resultados: Caracterizao inicial de cepas bacterianas As bactrias isoladas de mastite bovina foram identificados por mtodos convencionais. Todos os 161 cepas foram encontrados cocos Gram positivos e catalase positivos. Eles foram identificados como estafilococos. Entre esses estafilococos, 59 cepas foram coelho plasma-coagulase positivo e eles foram considerados como S. aureus. Confirmaes das cepas foram realizadas utilizando-PCR triplex. Agar teste de difuso em disco para a deteco de MRSA Treze dos 59 (22,0%) isolados de S. aureus testadas neste estudo deu uma zona de 12 mm ou mais e foram considerados como resistentes meticilina (Tabela 1). Slime ensaio de produo Rough-preta colnias em placas CRA foram considerados cepas produtoras de slime e colnias vermelhas foram avaliados como cepas no slime produzindo. Entre as 59 estirpes de S. aureus testadas, 22 (37,2%) foram encontradas para a produo de colnias negras dentro de 24-48 h. Aps 72 h, no cepas mais produzido colnias pretas (Fig. 1). Triplex PCR Triplex PCR foi usado para discriminar estirpes de S. aureus entre todos os isolados de mastite nosso e, simultaneamente, detectar cepas resistentes meticilina. Este ensaio foi alvo genes do 16S rRNA, nuc e mecA. Fragmentos de tamanhos esperados foram 756, 279 e 310 pb para o 16S rRNA, mecA e genes nuc, respectivamente (Fig. 2). Todas as 59 cepas de S. aureus identificadas fenotipicamente foram encontrados para ambos possuem 16S rRNA e genes nuc e foram confirmados como S. aureus. Cepas foram caracterizadas nesta anlise PCR visando mecA gene simultaneamente para resistncia meticilina. Entre as 13 estirpes de S. aureus resistente meticilina encontrada como fenotipicamente, 4 (30,7%) foram positivos para o gene mecA. Alm disso, o fenotipicamente meticilina sensveis 46 estirpes de S. aureus foram encontradas como negativo para o gene mecA. PCR deteco de genes ICAA e ICAD Entre todos os isolados de S. aureus, 15 dos 59 (25,4%) foram positivos para ambos os genes ICAA e ICAD e apenas 8 deles (53,3%) foram positivos na slime CRA. 16 de 59 (27,1%) amostras foram positivas para a ICAA e 38 deles (64,4%) foram positivos para ICAD gene (Figura 1, Tabela 1 e 2). Discusso: Mastite bovina a doena mais caro para a indstria de laticnios em todo o mundo, assim como na Turquia. O Staphylococcus aureus uma causa freqente de mastite bovina e tcnicas de diversas so usados para caracterizar as cepas de Staphylococcus bovina em S. veterinria microbiologia. Deteco rpida de resistncia meticilina em

conjunto com a identificao de S. aureus necessrio para fins teraputicos e epidemiolgicos (16,36). S. aureus nuc gene codifica a TNase produzir por estas bactrias. S. aureus tem TNase espcie-especficos seqncias e amplificao do gene nuc tem potencial para o diagnstico rpido das infeces por S. aureus (11,16). A principal ferramenta para o controle de mastite estafiloccica a terapia antimicrobiana. Portanto, os testes de susceptibilidade antimicrobiana so to importantes que os resultados dessas ajudar a orientar o veterinrio na escolha do agente antimicrobiano mais adequado para o tratamento de mastite causada por S. aureus (19). Muitos estudos esto disponveis sobre a resistncia a antibiticos de Staphylococcus aureus (24,29,33,39). Staphylococcus aureus resistente meticilina (MRSA) e cepas multiresistentes de S. aureus tambm foi relatada em alguns casos na medicina veterinria (9,31). MRSA mostram uma resistncia intrnseca penicilinase-resistentes antibiticos beta-lactmicos. Essa resistncia baseada na "mecA" gene de codificao PBP2a, uma induzvel e um PBP alterados que tem baixa afinidade para a ligao -lactmicos. mecA gene est localizado no cromossomo de resistncia meticilina MRSA e no devido destruio do antibitico por beta-lactamase. MRSA cepas mostram tambm um carter heterogneo, com o nvel de resistncia variando de acordo com as condies de cultura e -lactmicos antibitico a ser utilizado. Devido a esta resistncia heterognea, a deteco de MRSA por mtodos fenotpicos torna-se problemtica. Embora as condies de laboratrio foi alterado (Por exemplo, NaCl adicionais a mdio prolongado de incubao, incubao,em baixas temperaturas, maior inculo) para melhorar a fenotpica expresso, todas as cepas no podem ser classificadas. Alm disso, o condies que so usados para aumentar a expresso de meticilina resistncia tambm pode causar os resultados dos testes de susceptibilidade para cepas suscetveis mudana na direo ou acima do ponto de interrupo para resistncia (25). A (multi-resistente meticilina e outros antibiticos mais comuns, tais como oxacilina, penicilina e amoxicilina fentipo) de cepas de MRSA e sua intrnseca lactmico resistncia torn-los difceis e dispendiosas de tratar (12,28,41). Meticilina e oxacilina no so utilizados em medicina veterinria em Turquia exceto cloxacilina usado em casos de mastite (45). Considerando a resistncia a mltiplos antibiticos, a rpida e deteco correta de cepas de MRSA deve ser realizada para selecionar apropriada regimes de antibiticos. No entanto os mtodos selecionados deteco de cepas de MRSA deve ser til, confivel, simples e rpido (27). Vrios mtodos fenotpicos, tais como oxacilina de difuso em disco teste, tela placa de gar, a diluio microbroth eo E-testes tm sido utilizados para detectar os isolados MRSA (5). Phenotypicbased mtodos de teste de identificao e sensibilidade so o tempo consumindo mais e tm limitaes inerentes (16). No entanto, reao em cadeia da polimerase (PCR) baseada em mtodos mostraram- ser uma abordagem rpida e confivel para a identificao e caracterizao genotpica destes organismos. mecA baseada em PCR mtodos tem aceito como "padro ouro" (5,12,40). No presente estudo, estirpes de S. aureus provenientes de bovinos mastite foram identificadas fenotipicamente por alguns convencionais testes e tambm foram caracterizados genotipicamente por um PCR triplex segmentao 16srRNA (staphylococcus gnero-spesific), nuc (S. aureus espcies spesific) e mecA (um determinante da meticilina resistncia). Neste estudo, todos os 59 isolados de S. aureus identificadas por testes convencionais foram confirmados como S. aureus pela PCR genotipicamente e, ao mesmo tempo, resistncia meticilina desses cepas foram detectados. Enquanto que 13 de 59 (22,0%) isolados de S. aureus foram encontrados para ser resistente meticilina em oxacilina disco difuso mtodo, apenas 4 dos 59 (6,7%) isolados de S. aureus foram encontrados para ser MRSA em triplex PCR. Da

mesma forma, alguns pesquisadores (5,46) tm relatou os resultados discrepantes entre os mtodos de difuso em disco e PCR para deteco de resistncia meticilina. relatado que os testes de sensibilidade convencionais, tais como difuso em disco de gar e mtodos de diluio em caldo no pode dar resultados confiveis em deteco de MRSA por causa da expresso heterognea de resistncia (46). Neste estudo, MRSA falta mecA gene so classificados como resistentes falsas pelo mtodo de difuso em disco de oxacilina e foi considerou que pode ser devido a outro mecanismo de resistncia como a hiperproduo de beta-lactamase. Polissacardeos extracelulares, fator de lodo, so considerados ser fatores de virulncia importantes para alguns estafilococos (20). Camada de lodo em torno da estirpes de S. aureus ajudar na adeso ea colonizao desses microrganismos na mamrias epitlio glandular. relatado que a produo de fator de slime em S. aureus isolados de mastite causar resistncia a antibiticos que devido diminuio da difuso de antibiticos atravs da biofilme matriz e diminuio da atividade metablica de bactrias (4,36). Vrios mtodos fenotpicos, como mtodo de tubo padro, Mtodo de Christensen, Congo Agar Vermelho e microdiluio mtodos so usados para detectar a produo de lodo (2). No presente estudo, os isolados aureus slime produzindo S. foram detectados em Agar Congo Vermelho (CRA) placas in vitro. CRA teste da placa foi relatada como uma simples e rpida, sensvel e reprodutvel vantajosa nessas colnias permanecem viveis no meio e tambm mais especfica do que tubo de ensaio padro (23,37,48). Ns constatou que apenas 22 dos 59 (37,2%) isolados de S. aureus foram slimeproducing em Agar Congo Vermelho. Slime produtoras de S. aureus isolados de diferentes origens clnicas, tais como infeco da ferida (49), cateter de infeces associadas (6) a mastite, bovino (47) tem foram detectados in vitro, usando placas de Agar Congo Vermelho, como 52%, 60,8% e 91,4%, respectivamente. Knobloch et al (30) relataram que o fentipo na CRA foi encontrado para ser um confivel indicador de lodo de formao de capacidades entre os isolados clnicos de S. aureus. Portanto, embora os mtodos CRA pode ser mais fcil executar do que uma anlise molecular dos genes implicados na produo de biofilme e pode ser realizada facilmente em um diagnstico laboratrio, pode ser um mtodo pobre para determinar a slimeproducing capacidade de isolados clnicos no diagnstico laboratrio (21). Recentemente desenvolvidos mtodos moleculares proporcionou um direto evidncia da base gentica da produo de slime complementares para o teste CRA. Sntese Slime controlada pelo ica (Adeso intercelular) operon (7). O locus ica consiste ica A, D, B, C genes que codificam as protenas mediadoras da sntese de polissacardeo capsular adesina intercelular e polissacardeo / adesina (PS / A) em S. epidermidis e S. aureus, respectivamente (49). N-cetylglucosaminyltransferase que sintetiza o polissacardeo adesina intercelular de UDPN-acetilglicosamina codificada pelo ICAA particularmente. Contudo expresso exclusiva do ICAA induz apenas baixa atividade enzimtica, co-expresso de ICAA com ICAD leva a um aumento significativo na atividade e est relacionada expresso fenotpica dos capsular polissacardeo (6). No operon co-expresso, da ICAA e ICAD necessria para a sntese de slime completo. Neste estudo slime produo de isolados de S. aureus foram detectados por PCR visando ICAA e ICAD. PCR em anlise, nem todos os isolados, apenas 15 de 59 foram positivos para ambos os genes ICAA e ICAD e apenas 8 deles slime foram positivos em CRA. 16 de 59 amostras foram positivas para ICAA e 38 deles foram positivos para o gene ICAD. Este resultado foi contraste com Arciola et al. (6) que relataram que todas as cepas que foram positivos

para ICAA tambm foram positivos para o ICAD. Alm disso Vasudevan et al. (47) relataram que, embora apenas 24 de 35 S. aureus isolados de mastite fator de lodo produzidas in vitro, todos eles foram encontrados para possuir o locus ica, bem como o ICAA e ICAD. Arciola et al. (8) que foram encontrados os genes de o locus ica aparecer, em todos os isolados clnicos analisados em seus estudo, estritamente ligados uns aos outros, ento eles so ou todos os presentes ou todos os ausentes. Nossos resultados discrepantes que os genes ICAA e ICAD se no ficar juntos em alguns isolados podem, devido a algumas mutaes em ICAA. Apesar de co-expresso de ICAA e ICAD necessrio para a produo de lodo, considerou-se que outros genes ica lcus papel desempenham na expresso slime controle. Fitzpatrick et al (21) relataram que h ica mecanismos independentes de formao de biofilme em S. aureus. Neste estudo, entre os 37 cepas que no produzem factor de slime na CRA placa in vitro, 7 cepas foram positivos para ambos os genes ICAA e ICAD. Este sugere a possibilidade de que algumas condies ambientais ou a presena de genes acessrios podem influenciar o fentipo comportamento na placa de gar vermelho Congo, dando colnias que fez no expressar plenamente os genes ica. Fator de lodo tambm pode desempenhar um papel na resistncia a antibiticos (18,44) e relatado que as cepas produtoras de slime so mais resistentes aos antibiticos do que cepas no produtoras slime (4). Emre et al. (26) so tambm informou que h uma correlao entre a produo de lodo e mltiplas resistncias aos antibiticos. Em contraste com estes estudos, Ciftci et al. (15) no encontraram qualquer efeito do lodo produzindo sobre a resistncia a antibiticos em seu estudo e alm disso eles relataram cepas que produzem lodo so mais suscetveis aos antibiticos do que produzir nonslime cepas. Neste estudo, descobrimos que apenas 2 de 59 cepas foram positivo para a resistncia meticilina e slime produo, fenotipicamente. Assim, sugerimos que no h correlao entre resistncia meticilina e lodo produzindo em nossa isolados. Em concluso, foi demonstrado que vrios casos de mastite em vacas na Turquia foram causadas por MRSA, apesar da baixa percentuais. Considerou-se que a PCR triplex otimizado em Neste estudo til para diagnstico laboratorial por causa de sua personagens rpida e confivel para a deteco de Staphylococcus resistncia de S. aureus. Usando o fenotpica e genotpica mtodos em conjunto necessrio para a identificao precisa das MRSA. Assim, verificou-se que nem todos os isolados fenotipicamente slime positivos foram positivos tanto ICAA e ICAD e havia diferenas na presena destes dois genes. Considerou-se que apenas PCR ICAA segmentao e ICAD no foi suficiente para detectar a produo de lodo. Mais estudos visando outros genes que esto presentes no lcus ica e estudos para investigao de mutaes nesses genes devem ser realizados para precisas avaliao de caracteres slime produo de estirpes de S. aureus