Alim. Nutr., Araraquara v.17, n.3, p.345-352, jul./set.

2006

ISSN 0103-4235

ESCURECIMENTO ENZIMTICO EM ALIMENTOS: CICLODEXTRINAS COMO AGENTE ANTIESCURECIMENTO *

Andria Aparecida Jacomassi CARNEIRO** Heloiza Ferreira ALVES-PRADO*** Eleni GOMES**** Roberto DA SILVA***

RESUMO: As reaes de escurecimento enzimtico e no enzimtico so uns dos mais importantes fenmenos que ocorrem durante o processamento e armazenamento dos alimentos. Devido s restries ao uso de sulfito em alimentos, ciclodextrinas esto sendo estudadas como uma alternativa para inibir o escurecimento de alimentos. Elas so molculas cclicas compostas por monmeros de Dglicoses produzidas pela ao da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) sobre o amido, e so capazes de formar complexos de incluso com outras substncias em soluo aquosa. A incluso de compostos precursores de reaes de escurecimento podem evitar a complementao destes processos. Esta reviso descreve algumas propriedades das CDs, tendo como principal caracterstica a sua complexao com compostos fenlicos presentes em vegetais, frutas e bebidas, proporcionando a reduo do escurecimento enzimtico desses alimentos, os quais podero ter uma maior vida de prateleira, visto que o escurecimento poder alterar as propriedades organolpticas e a aparncia dos produtos alimentcios. PALAVRAS-CHAVE: Escurecimento enzimtico; ciclodextrina; alimentos; inibidores.

caramelizao tambm existem.9 O mtodo mais comum para controlar o escurecimento enzimtico e no enzimtico o uso de sulfito em alguma de suas formas (dixido de enxofre, metabissulfito de sdio ou potssio e bissulfito de sdio ou potssio).35 Entretanto, devido aos efeitos adversos aos seres humanos a Agncia Food and Drugs Administration (FDA), proibiu em 1986 o uso do sulfito e derivados nos E.U.A.16 evidente que isto ter efeito mesmo no Brasil onde ainda se utiliza o bissulfito, considerando as restries impostas a produtos importados pelos E.U.A., que tenham na sua composio a presena desta substncia qumica. Portanto, o sucesso para prevenir o escurecimento de frutas e vegetais por mtodos alternativos ainda um desafio. As ciclodextrinas tm se mostrado eficiente para inibir o escurecimento enzimtico de alimentos40. Esta alternativa ser discutida nesta reviso. Fundamentao terica As ciclodextrinas (CDs) so maltooligossacardeos cclicos no-redutores contendo de 6 a 13 unidades de glicose7, 25 ligadas entre si, por ligaes glicosdicas -1,4. Elas so produzidas pela ao da CGTase, uma enzima microbiana que atua sobre o amido formando as CDs.7, 47 As CDs mais comuns so do tipo - , - e -, constitudas de seis, sete e oito unidades de glicose, respectivamente. Suas cavidades internas so hidrofbicas, mas externamente so hidroflicas. Formam complexos de incluso com uma variedade de substncias, mudando as suas caractersticas fsicas e qumicas. Essa propriedade das CDs tem levado a um aumento na sua aplicao nas indstrias de alimentos, farmacuticas, cosmticos, produtos agroqumicos, plsticos e outras.2, 3, 4, 7, 32, 39, 41, 42, 45 A principal via de escurecimento enzimtico iniciase com a oxidao de fenis endgenos por ao da enzima PPO na presena de oxignio formando o-quinona e a subseqente polimerizao destas, num mecanismo complexo envolvendo protenas, aminocidos e fenis,

INTRODUO As reaes de escurecimento de alimentos esto entre as mais importantes alteraes que sofrem os alimentos, seja na forma in natura ou durante a cadeia de processamento e armazenamento. Por causa das alteraes que provocam, tm implicaes tanto nutricionais, tecnolgicas e econmicas. Por isto so motivos de intensa atividade de pesquisa. Os principais grupos de reaes de escurecimento so conhecidos como escurecimento enzimtico (REE) da polifenoloxidase (PPO) e escurecimento no enzimtico (RENE), causado pela reao de Maillard (RM). Outros mecanismos de escurecimento de alimentos, tais como oxidao de vitamina C, ao das peroxidases e

*Parte da Dissertao de Mestrado do primeiro autor no curso de Engenharia e Cincia de Alimentos - UNESP - So Jos do Rio Preto - SPBrasil. Trabalho elaborado com apoio financeiro da CAPES (Programa n 33004153070M-3). ** Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos - Instituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas - UNESP - 15054-000 - So Jos do Rio Preto-SP- Brasil. *** Departamento de Qumica - Instituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas - UNESP - 15054-000 - So Jos do Rio Preto-SP-Brasil. **** Departamento de Biologia - Instituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas - UNESP - 15054-000 - So Jos do Rio Preto-SP - Brasil.

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culminando com a formao de pigmentos escuros denominados melaninas.30 Recente mudana no estilo de vida do consumidor tem levado a uma demanda maior pelos alimentos naturais e seguros, e a uma menor adio qumica nos alimentos processados. Devido a esta tendncia tem sido renovado o interesse pela pesquisa por agentes naturais antiescurecimento. Com isso as ciclodextrinas se mostraram como uma alternativa. A sua cavidade hidrofbica capaz de formar complexos de incluso com uma ampla classe de molculas orgnicas, incluindo os precursores do escurecimento, uma vez encapsulados, estes compostos se tornam indisponveis e conseqentemente h inibio da reao de escurecimento enzimtico.12 Formao da CD O amido o substrato da CGTase para a formao de CD. Ele um polmero relativamente simples, composto de molculas de glicose, de alta massa molecular. Encontra-se na forma de substncia de reserva em plantas, incluindo sementes, frutas, tubrculos e razes. Ele formado basicamente por amilose e amilopectina. 24 um dos polissacardeos de grande importncia para a indstria alimentcia, devido s suas caractersticas funcionais e qualidade nutricional. Assim tem uma grande aplicao industrial seja diretamente como alimento, agente texturizante e estabilizante ou como substrato para produo de uma srie de derivados pela ao de enzimas. 51 A degradao parcial ou total do amido ocorre pela ao combinada de enzimas amilolticas, as quais atuam na hidrlise das ligaes -1,4 e -1,6. Exemplos dessas enzimas esto ilustrados na Figura 1.

A utilizao de enzimas amilolticas tem aumentado abundantemente. Entre elas a CGTase vem ganhando grande importncia industrial. Elas tm a capacidade de degradar o amido, catalisando a hidrlise das ligaes glicosdicas e a subseqente reao de transglicosilao intramolecular ou ciclizao dos oligossacardeos (Figura 2A), formando as CDs.50 A CGTase tambm catalisa outros dois tipos de reaes. A reao de acoplamento (Figura 2B) reversa a ciclizao, onde o anel de CD clivado e transferido para um substrato receptor linear. A reao de desproporcionao (Figura 2C) uma reao de transferase propriamente dita, onde um maltooligossacardeo clivado e transferido para um substrato receptor linear. A enzima apresenta ainda, uma fraca atividade hidroltica em presena de amido (Figura 2D) formando maltooligos- sacardeos.1, 3, 7, 10, 47, 48, 50, 52

Fonte: Adaptado Van Der Veen et al.50

FIGURA 2 - Representao esquemtica das reaes de transglicosilao catalisadas pela CGTase. A) ciclizao, B) acoplamento, C) desproporcionao e D) hidrlise. Cada crculo representa uma unidade de glicose.

CGTase dextrina limite

Ciclodextrina Glicosiltransferase

+
CD

Alfa-amilase

Glicose

Glucoamilase

Oligossacardeos lineares

Oligossacardeos ramificados Isoamilase/ Pululanase

Beta-amilase

= No redutor = Redutor

Oligossacardeos lineares

Beta-dextrina + +

Maltose

Fonte: Adaptado Van Der Veen et al. 50

FIGURA 1 - A ao das enzimas envolvidas na degradao do amido. () Molcula de glicose com extremidade redutora; (o) Molcula de glicose sem a extremidade redutora. As setas indicam a preferncia pela quebra na molcula de amido. 346

Caracterizao das ciclodextrinas As estruturas qumicas da -, - e -CD so apresentadas na Figura 3A . A forma circular da CD devido conformao do carbono C1 da unidade de glicose e suas ligaes glicosdicas. Sua forma ovalada, semelhante a um cone truncado, tem um lado com dimetro maior que formado pelos grupos hidroxilas secundrios (nos tomos de C2 e C3) e um lado com dimetro menor, onde esto situadas as hidroxilas primrias (nos tomos de C6), tornando a CD hidroflica externamente (Figura 3B). Formao do complexo de incluso Os complexos de incluso so definidos como o resultado da interao entre compostos nos quais uma

molcula hspede menor se encaixa dentro e fica envolvida pela cavidade de uma outra molcula. A cavidade da ciclodextrina uma regio apolar, sendo ocupada pela molcula hspede (ou sua parte) apolar.19 A forma e dimenso da cavidade da -CD permite total ou parcial incluso de uma variedade de compostos. Os complexos podem ser formados em qualquer soluo sendo a gua o principal solvente de escolha. Em soluo aquosa, a cavidade central apolar da CD ocupada por molculas de gua que podem ser facilmente substitudas por "molculas hspedes" como, por exemplo, o xileno e a fenolftalena que so menos polares que a gua (Figura 4a). Outro exemplo de complexao o que ocorre entre o -clorofenol e a CD, conforme Figura 4b, onde os tomos de oxignio e hidrognio glicosdicos localizados no interior da molcula interagem com os tomos do -clorofenol para formar o complexo de incluso.14

Alfa

Beta

Gama

Fonte: Adaptado Alves-Prado et al.4

Cavidade apolar

Hidroxilas primrias

Hidroxilas secundrias

Fonte: Adaptado Cyclodex15 e Purdy.33

FIGURA 3 - A) Estrutura da -CD, -CD e -CD com seis, sete e oito monmeros de glicose, respectivamente. B)Estrutura da ciclodextrina.

Cavidade Hidrofbica

CH3

CH3

+
CH3
CH3

Exterior Hidroflico Fonte: Adaptado Szejtli.43 FIGURA 4 - Representao esquemtica da formao do complexo de incluso da ciclodextrina. A) A molcula hospede o Xileno e os crculos menores representam as molculas de gua.

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a-CD

OH OH

O O

OH
OH

Enzima-2 Cu

2+

Enzima-2 Cu+

OH OH

R Monofenol (sem cor) PPO

CH3

Fonte: Adaptado Castilho & Boyd.14

Protenas OH

FIGURA 4 - B) O -clorofenol no interior da ciclodextrina, vista frontal e lateral.

R Difenol (sem cor) OH

PPO + O2 R

O O Aminocidos Polmeros complexos marrons (Melaninas)

o -quinona (colorido) Agente Redutor

As ligaes envolvidas na formao dos complexos so foras de van der Waals, interaes dipolo-dipolo e pontes de hidrognio. Essas ligaes so fortes o suficiente para impedir a separao do complexo mesmo em estado slido, mas fracas o suficiente para permitir a liberao da molcula encapsulada, quando necessrio.20 O complexo de incluso exerce um efeito intenso nas propriedades fsico-qumicas da molcula hospedeira. Dentre essas propriedades encontram-se: o aumento da solubilidade da molcula hospedeira, a estabilizao da molcula hospedeira lbil contra os efeitos de degradao pela oxidao, o controle da volatilidade e sublimao.38 O complexo tambm impede reaes como polimerizao e oxidao, necessrias para completar a reao de escurecimento enzimtico. A encapsulao pode ser analisada por calorimetria de varredura diferencial (DSC) a 300C, visto que a temperatura em que a CD se decompe. Quando a molcula hospedeira encapsulada pela CD no ocorre absoro de energia, no entanto observa-se um aumento na temperatura de fuso, de aproximadamente 10C. 19 Reao de escurecimento enzimtico O escurecimento enzimtico, com algumas excees (caf, coco, figos pretos e ch), considerado um problema que diminui a qualidade das frutas e suas caractersticas nutricionais. 27 As reaes oxidativas deste processo, independentemente de sua causa (amassamento, corte, descascamento, ferimento e ao de microrganismo, etc), envolve o contato entre as enzimas oxidativas e vrios compostos fenlicos. A principal enzima envolvida neste processo a polifenoloxidase (PPO), que utiliza o oxignio molecular na catlise de o-hidroxilao de monofenol para o-difenis (atividade da monofenolase) e, posteriormente, a oxidao do difenol (atividade de difenolase) em o-quinona. Essas o-quinonas se polimerizam e/ou reagem com aminocidos endgenos e protenas formando pigmentos marrons complexos denominados melaninas (Figura 5). A enzima localiza-se nos plastdios das clulas 348

Fonte: Adaptado Mc Evily.28

FIGURA 5 - Esquema do escurecimento enzimtico da PPO.

vegetais e os substratos fenlicos esto armazenados nos vacolos. Esta separao fsica previne qualquer oxidao dos fenis sem danificar o tecido vivo. A separao pode ser rompida como resultado de danos clula durante a colheita e transporte (no intencional) ou o processamento (intencional). Com isso a oxidao dos fenis por meio da PPO se inicia.11 Os fatores mais importantes no aumento do escurecimento provocado por esta enzima so a concentrao de compostos fenlicos, o pH, a temperatura e o oxignio disponvel no tecido.26 A escolha do cultivar tem demonstrado efeito no potencial de controle de escurecimento de batatas minimamente processadas, uma vez que diferentes cultivares tm diferentes composies qumicas. Em tubrculos como batatas, os compostos fenlicos esto principalmente distribudos nos tecidos entre o crtex e a pele. Na verdade, cerca de 50% dos compostos fenlicos esto localizados na pele e tecidos adjacentes, enquanto que os outros 50% esto no centro do tubrculo.17 Os nutrientes mais importantes presentes em batatas so os carboidratos, como o amido, cidos orgnicos e fenis, como o cido clorognico. A concentrao de cido clorognico representa cerca de 90% do total de compostos fenlicos em batatas.6, 18, 29 As pras so particularmente propensas ao escurecimento enzimtico e seu uso muito restrito em produtos processados como o suco ou pur. O grau de envolvimento das peroxidases no escurecimento enzimtico permanece duvidoso, especialmente por causa da maior afinidade da PPO com os substratos naturais e o baixo nvel de perxido de hidrognio em frutas.34 Inibidores das reaes de escurecimento enzimtico A preveno ou a inibio do escurecimento

enzimtico uma das principais preocupaes da indstria de alimentos em todo o mundo e trabalhos tm sido realizados para eliminar algum dos fatores essenciais da reao, como o oxignio, a enzima, o cobre ou fenis.40 Os inibidores podem operar por trs diferentes modos de ao: primeiro, a inibio direta da PPO, segundo, a reduo qumica da oquinona em compostos o-difenlicos e por ltimo a modificao qumica ou a remoo dos substratos fenlicos da PPO.31 A enzima (PPO) relativamente sensvel ao calor acima de 50C e a escolha do tempo apropriado de tratamento permite uma diminuio na sua atividade. No entanto, ela completamente destruda a 80C. Tambm pode ser inibida por cidos, sulfitos, agentes quelantes e agentes redutores como o cido ascrbico.49 Embora os sulfitos sejam eficientes nas REE e RENE existem diversos fatores negativos associados como seu uso em alimentos e bebidas, acarretando diferentes problemas de sade, principalmente em certos indivduos sensveis como os asmticos dependentes de esterides. Em casos mais extremos podero ocorrer reaes anafilticas e at mesmo a morte.46 Em busca de mtodos alternativos em substituio aos agentes qumicos, as ciclodextrinas tem mostrado efeitos promissores. Essas molculas foram propostas como agentes no controle do escurecimento enzimtico de produtos de ma causado pela PPO5, 8, 36 e seu uso na preveno do escurecimento enzimtico foi patenteado. 21 A -CD mostrou que inibe o escurecimento enzimtico de suco de ma.36 Os autores propuseram que a -CD forma complexo de incluso com o substrato da PPO, desse modo prevenindo a oxidao das quinonas e a sua subseqente polimerizao em pigmentos escuros. Isto tambm poder representar um novo conceito em tecnologia de frutas minimamente processado. Sojo et al.40 avaliaram o efeito da CD na oxidao enzimtica dos fenis da polpa de banana. Esse trabalho mostrou pela primeira vez que as CDs, ao contrrio do que geralmente se pensava que elas somente agiam como inibidores, mostrou tambm que dependendo da forma de uso, elas podem ativar o escurecimento em extratos de frutas cruas. Assim, a CD apresentou dois efeitos, um ativador e outro inibidor do escurecimento, conforme o produto utilizado. Quando se usou o fenol hidrofbico como o tertbutilcatecol (TBC) observou-se uma acentuada inibio tanto com o derivado -hidroxipropil-CD quanto com o maltosil-CD. Essa inibio foi ocasionada pela complexao do TBC com o centro da CD, demonstrando que a PPO da polpa de banana reagia somente como substrato livre e no com o complexo TBC-CDs. O aumento das concentraes de CDs na presena de dois inibidores da PPO (4-iodofenol e o cido cinmico) foi capaz de reativar a enzima, antes inibida, para o nvel no inibido (ausncia do inibidor). Isto ocorreu pela complexao dos inibidores com o centro hidrofbico da CD, impedindo sua ao inibidora. Isto mostrou que um efeito sinrgico inverso com CD e outro inibidor pode ocorrer se o inibidor for capaz de incluso com a CD.

A maior parte dos estudos de aplicao de CD como antiescurecimento so com mas e seus produtos. A -CD no foi efetiva no suco de ma em concentraes de 0,31,8 mM. Observou-se o escurecimento gradual do suco de ma nas concentraes testadas, indicando que no houve a formao completa do complexo. Se a concentrao fosse aumentada, a eficincia poderia ser maior, embora isso pudesse causar reduo no "flavour", por causa da tambm complexao com compostos aromticos devido falta da especificidade da CD na formao de complexos.30 Sapers et al.37 verificaram que a combinao de CD com o cido ascrbico 2-fosfato ou ascorbil palmitato foi significativamente mais efetiva como inibidor do escurecimento em suco de ma comparado com o uso da -CD e do cido ascrbico isoladamente. A -CD e as combinaes dessa com o cido ascrbico ou seus derivados apresentaram efeitos promissores na inibio do escurecimento em suco de ma, entretanto, a mesma no foi efetiva em mas fatiadas. A capacidade da -CD de inibir o escurecimento enzimtico em suco de ma provavelmente resultou da sua capacidade de formar complexo de incluso com o substrato da PPO prevenindo, dessa forma, a oxidao das quinonas e a sua subseqente polimerizao em pigmentos escuros. Irwin et al. 23 avaliaram que a CD forma um complexo de incluso na proporo 1:1 com o substrato da PPO (cido clorognico) em suco de ma, protegendo o substrato da oxidao enzimtica. A -CD dissolvida em suco de ma "Granny Smith" inibiu o escurecimento enzimtico de forma diretamente proporcional concentrao de CD entre 5,9 e 13,6 mM, entretanto, - e -CDs foram menos efetivas. A inibio do escurecimento por -CD foi mais efetiva com a adio do cido ascrbico (1,14 mM) ou de outros derivados ascorbil. Misturas contendo maltosil- -CD, dimaltosil- -CD e -CD foram efetivas na concentrao de 1 a 4%, com a adio de cido ascrbico e cido ctrico. 22 A CD foi empregada em sucos de uvas verdes, mas "Granny Smith", pras "Anjou" e aipo. O suco de ma controle escureceu significativamente em 1 hora. No entanto, na amostra submetida ao tratamento com CD, o escurecimento foi prevenido por 82 horas. Em suco de pra, o escurecimento ocorreu em aproximadamente 60 horas. 22 Estes autores tambm utilizaram as CDs solveis e insolveis, sozinhas ou em combinao com o fosfato orgnico e inorgnico para inibir o escurecimento em suco de ma, onde verificaram que a -CD inibiu o escurecimento por 2 horas na concentrao de 1% (8,8 mM). Resultados similares foram encontrados com o maltosil- -CD. Entretanto, com o aumento na sua concentrao a 4% (28 mM), o perodo de inibio foi maior, aproximadamente 6 horas. A combinao de 1% de -CD com 0,5% de cido pirofosfato de sdio ou cido hexametafosfato de sdio e com 0,25% cido difosfato ou cido fosfrico proporcionou a inibio do escurecimento por mais de 25 horas temperatura ambiente. Billaud et al.9 estudaram o efeito da CD na atividade da PPO de ma, utilizando como substrato fenlico o cido clorognico e a (+) catequina. A CD diminuiu a atividade da 349

PPO, por complexao com o substrato. A eficincia da CD como inibidor do escurecimento depende do equilbrio entre o substrato livre e o complexado e da proporo da formao do complexo. O Hidroxipropril- -CD pode ser considerado melhor inibidor do escurecimento enzimtico em suco de ma quando comparado com a -CD, uma vez que a sua solubilidade em gua maior (>5 g/100 mL a 25C). So mais estveis em condies cidas e na presena da amilase do que a -CD 9. A -CD tem uma solubilidade menor em gua (1,85 g/100 mL a 25C), comparada com a - e -CD (14,5 e 23,3 g/ 100 mL, respectivamente). A baixa solubilidade devido principalmente s ligaes de hidrognio intramolecular. Vrios derivados tm sido propostos para aumentar a solubilidade em gua. 9, 44 Em trabalho recente, Carneiro 13 mostrou que a CGTase diminuiu o escurecimento enzimtico de batatas. Isso ocorreu devido produo de CD por ao da CGTase sobre o substrato natural (amido de batata) e sua subseqente polimerizao com os agentes responsveis pelo escurecimento, evitando assim o desenvolvimento da reao. Inconvenientes Embora as CDs paream ser efetivas em retardar o escurecimento, existem diversos inconvenientes potenciais para o seu uso, entre esses a falta de especificidade da formao do complexo de incluso poder resultar na diminuio do "flavour" 22. Esta caracterstica poder ser minimizada pelo uso de derivados de CDs. No entanto esses tm como desvantagem o custo elevado.

restriction of the use of sulfite in food, cyclodextrin has been studied as an alternative to control the browning of foods. They are cyclic molecules, composed by monomers Dglucose produced by action of the enzyme cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) on starch. The most remarkable property of these molecules is their ability to form inclusion complexes with others substance in aqueous solution. The inclusion of precursor compounds of browning reactions may avoid the completion of these processes. This review describe some properties of CDs, having as main characteristic a complexation with polyphenols present in vegetables, fruits and beverages, taking the reduction of enzymatic browning these foods, they could have a longer shelf-life, once that the browning can change organoleptic properties and appearance of the food product. KEYWORDS: CGTase; cyclodextrin; browning enzymatic; foods; inhibitor.

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CONCLUSO As CDs so uma alternativa para substituir o uso de agentes qumicos em alimentos processados que tendem ao escurecimento, uma vez que no traz prejuzos sade humana. Sua aplicao aumentar se os custos forem reduzidos. O alto custo da produo da CD ainda o fator limitante no seu emprego na tecnologia de alimentos. Dessa forma, pesquisas dirigidas produo, tanto da CGTase quanto da CD que resultem em menor custo, so importantes para viabilizar de maneira econmica o uso de CD em escala comercial e conseqentemente aumentar a sua aplicabilidade em alimentos sujeitos ao escurecimento.

CARNEIRO, A. A. J; ALVES-PRADO, H. F.; GOMES, E.; DA SILVA, R. Enzymatic browning in foods: cyclodextrins as antibrowning agents. Alim. Nutr., Araraquara, v.17, n.3 , p.345-352, jul./set. 2006.

ABSTRACT: The enzymatic and non-enzymatic browning reactions are one of the major phenomenon which occurs during the processing and storage of foods. Due to the 350

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