Acta Farm.

Bonaerense 25 (1): 17-21 (2006)

Recibido el 07 de abril de 2005 Aceptado el 04 de septiembre de 2005

Trabajos originales

Caracterizao Fsico-qumica de Nanoemulses Catinicas como Sistemas de Liberao de Oligonucleotdeos

Carolina SILVA 1, rico MARTINI 1, Guilherme TAVARES 2, Tamara SILVEIRA 2, Mnica Cristina DE OLIVEIRA 2 e Helder TEIXEIRA 1 *
1

Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre. 2 Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Belo Horizonte.

RESUMO. O presente artigo descreve a influncia da adio de quantidades crescentes do lipdeo catinico estearilamina (SA) e da presena do tensoativo no-inico poloxmero 188 sobre caractersticas fsicoqumicas de nanoemulses catinicas como sistemas de liberao de oligonucleotdeos. As formulaes foram preparadas atravs do procedimento de emulsificao espontnea. As nanoemulses foram compostas de triglicerdeos de cadeia mdia, de lecitina, de quantidades crescentes de SA [NE] e de poloxmero 188 [NEP]. O dimetro das gotculas, potencial zeta e viscosidade das formulaes das sries NE e NEP foram caracterizados. Os resultados demonstram o efeito da SA no potencial zeta das nanoemulses, enquanto que a adio do poloxmero [NEP] influencia significativamente o dimetro mdio das gotculas e a viscosidade das formulaes (p<0,05). A eficcia de associao de um oligonucleotdeo modelo, politimidilato (pdT16), foi superior com as nanoemulses contendo as diferentes concentraes de SA (>90%) do que com a nanoemulso controle isenta de SA (<70%), independente da presena de poloxmero 188. SUMMARY. Physicochemical Characterization of Cationic Nanoemulsions as Delivery Systems for Oligonucleotides. The present paper reports the influence of increasing amounts of the cationic lipid stearylamine (SA) and the presence of the non-ionic surfactant poloxamer 188 on physicochemical characteristics of cationic nanoemulsions as delivery systems for oligonucleotides. The formulations were prepared by spontaneous emulsification procedure. The nanoemulsions were composed by medium chain triglycerides, lecithin, increasing amounts of SA [NE] and poloxamer 188 [NEP]. The mean droplet size, zeta potential and viscosity of formulations of NE and NEP series were characterized. The results show the effect of SA on zeta potential of nanoemulsions, whereas the addition of poloxamer 188 [NEP] influences significantly the droplet size and the viscosity of formulations (p<0,05). The association efficiency of a model oligothymidilate (pdT16) was higher with nanoemulsions containing different amounts of SA (>90%) than with control nanoemulsions in the absence of SA (<70%), whatever the presence of poloxamer 188.

INTRODUO Oligonucleotdeos antisenso (ON) so fragmentos curtos de cidos nuclicos investigados em diversas aplicaes teraputicas. O princpio da terapia com ON est baseado na ligao especfica de uma seqncia de ON complementar ao RNA mensageiro, impedindo a sua traduo 1. A especificidade da hibridao, de acordo com as regras de complementaridade de Watson-Crick, torna ON potenciais agentes teraputicos visando a modulao de genes envolvidos em diferentes doenas 2. Recentemente, uma seqncia de ON foi aprovada para o tratamento local de retinite induzida por citome-

galovirus, e vrias outras potenciais aplicaes, em especial na terapia do cncer, encontram-se em estudo clnico 3. Entretanto, vrias potenciais aplicaes teraputicas dos ON permanecem limitadas principalmente pela sua reduzida penetrao intracelular, seu elevado peso molecular e seu carter polianinico 1-3. Uma promissora estratgia para a administrao dos ON consiste na formao de um complexo ON-lipdeos catinicos, via interao eletrosttica entre os ON carregados negativamente e os lipdeos catinicos carregados positivamente 4. Geralmente, os lipdeos catinicos so estruturados na forma de li-

PALAVRAS-CHAVE: Estearilamina, Nanoemulses, Oligonucleotdeos, Poloxmero 188. KEY WORDS: Nanoemulsions, Oligonucleotides, Poloxamer, Stearylamine.
* Autor a quem dirigir correspondncia. E-mail: helder@farmacia.ufrgs.br

ISSN 0326-2383

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possomas catinicos e a complexao com os ON ocorre espontaneamente em meio aquoso 5. Vrios estudos tm demonstrado um aumento da penetrao intracelular de ON in vitro aps sua complexao com lipossomas catinicos 4-6. Contudo, limitaes relacionadas com a estabilidade dos complexos formados, principalmente em presena de protenas, limitam o seu emprego in vivo 7. Neste contexto, nanoemulses catinicas leo em gua tm sido propostas como potenciais sistemas de liberao para macromolculas como ON ou DNA 8,9. Teixeira e colaboradores estudaram a eficincia de associao de ON naturais de diferentes tamanhos (at 50 nucleotdeos) com nanoemulses lipdicas catinicas constitudas de um ncleo de triglicerdeos de cadeia mdia estabilizado por lecitina de gema de ovo e pelo lipdeo catinico estearilamina 8. ON de at 30 nucleotdeos so eficazmente associados com nanoemulses catinicas atravs da formao de um complexo com a estearilamina na interface leo/gua 10. Alm disso, foi evidenciado um aumento significativo da penetrao dos ON associados com as nanoemulses, obtidas em presena de estearilamina, em clulas tumorais (P388/ADR), aps administrao intratumoral em camundongos 11. Recentemente, a obteno de nanoemulses catinicas contendo ON, atravs do procedimento de emulsificao espontnea, foi descrita na literatura 12-14. O interesse desse procedimento reside, entre outros, na sua adequao para preparao de pequenos lotes de formulao em estudos de bancada e na possibilidade de funcionalizao da interface das nanoemulses atravs da nanodeposio de polmeros pr-formados. Em continuidade ao desenvolvimento de nanoemulses como sistemas de liberao de ON, o objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo de formulao visando caracterizar a influncia da concentrao do lipdeo catinico estearilamina e da presena do tensoativo no inico poloxmero 188 sobre propriedades fsico-qumicas de nanoemulses contendo um ON modelo de 16 bases (pdT16), obtidas atravs do procedimento de emulsificao espontnea. MATERIAL E MTODOS Materiais Triglicerdeos de cadeia mdia (contendo principalmente cidos cprico e caprlico) e Lipoid E-80 foram gentilmente cedidos pela Lipoid KG (Ludwigshafen, Alemanha). Polaxme-

ro 188, estearilamina e glicerol foram obtidos da Sigma (So Paulo, Brasil). pdT16 foi obtido da Eurogentech (Seraing, Blgica), T4 polinucleotdeo quinase foi adquirido da Biolabs (Hitchin, Reino Unido) e 33P-ATP foi fornecido por Isotopchim (Ganagobie-Peyruis, Frana). Preparao das nanoemulses por emulsificao espontnea As nanoemulses foram preparadas atravs do procedimento de emulsificao espontnea descrito previamente 12-14. Esse procedimento consiste em solubilizar os constituintes da fase oleosa e da fase aquosa, em uma mistura de etanol/acetona (70:30) e gua, respectivamente. Em seguida, a fase orgnica vertida atravs de funil calibrado, sob agitao moderada e constante, na fase aquosa, seguido da retirada do solvente atravs de destilao sob presso reduzida em um evaporador rotatrio Bchi B-480 (Bchi, Flawil, Suia). Duas sries de nanoemulses foram ento preparadas, na ausncia (NE) e presena do tensoativo no inico, poloxmero 188 (NEP), adicionadas de quantidades crescentes do lipdeo catinico, estearilamina (SA), nas concentraes de 0,025; 0,05; 0,25 e 0,5 (%, p/p), conforme descrito na Tabela 1. Formulaes das sries NE e NEP em ausncia de estearilamina foram preparadas como controle. Aps a preparao dos diferentes lotes de nanoemulses, o pH das formulaes foi ajustado ao valor de 7,4.
NE NEP

Estearilamina Lipoid E-80 TCM q.s.p. Poloxmero 188 Glicerol gua q.s.p.

0 - 0,5 2,00 10,00 2,25 100,00

0 - 0,5 2,00 10,00 1,68 2,25 100,00

Tabela 1 . Composio final das nanoemulses (%, p/p) obtidas em ausncia (NE) ou presena (NEP) de poloxmero 188.

Caracterizao das nanoemulses O dimetro mdio das gotculas e o potencial zeta das formulaes foram determinados atravs de espectroscopia de correlao de ftons e da mobilidade eletrofortica, respectivamente, utilizando-se um Zetasizer 3000HS (Malvern Instruments Ltd., Reino Unido), aps adequada diluio das amostras. O pH das nanoemulses foi determinado utilizando-se um potencimetro digital Micronal B 474 (Micronal,

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So Paulo, Brasil). A viscosidade das nanoemulses foi determinada por viscosimetria capilar segundo a Farmacopia Brasileira IV edio 15. Aps a determinao do tempo de escoamento, calculou-se a viscosidade das nanoemulses utilizando a densidade determinada em picnmetro. Os resultados foram expressos como a mdia (s) de trs experimentos. Marcao do pdT16 com o 33P-ATP O pdT 16 radiomarcado foi preparado de acordo com o mtodo previamente descrito 8,10,11: 5 L da soluo de pdT 16 (10 M), 1 L de T4 polinucleotdeo quinase e 1 L de 33P-ATP foram incubados durante 30 minutos, temperatura de 37 C. O final da reao foi obtido atravs de aquecimento, durante 15 minutos, a 80 C, com o objetivo de desnaturar a enzima responsvel pela reao (quinase). O pdT16 radiomarcado (33P-pdT16) foi purificado em coluna de excluso molecular do tipo Bio-spin 6 (Biorad, USA) aps centrifugao a 2400 rpm, durante 1 min. A pureza do 33P-pdT16 foi avaliada em gel de poliacrilamida (20% poliacrilamina, 7M uria) seguida de anlise atravs de um leitor linear de radiatividade (EG&G Berthold, France) conforme descrito previamente por Aynie e colaboradores 16. Preparao e caracterizao das nanoemulses contendo pdT16 A associao do pdT16 foi realizada atravs da mistura de uma soluo concentrada do pdT16 com as nanoemulses previamente formadas 8. Uma mistura do pdT16 radiomarcado (33PpdT16) e no radiomarcado foi realizada na proporo 1/1000, obtendo-se uma concentrao final de 12,5 M. Aps incubao, alquotas de 200 L foram submetidas ao procedimento de ultrafiltrao/centrifugao, utilizando-se unidades de ultrafiltrao de 30.000 Da (Millipore, Bedford, Estados Unidos), e a radioatividade foi determinada por cintilao lquida no ultrafiltraSrie NE [SA] (% p/p) Dimetro mdio (nm) Potencial zeta (mV)

do obtido. A taxa de associao do pdT16 com as nanoemulses foi estimada pela diferena entre a quantidade presente na amostra antes e aps a ultrafiltrao/centrifugao. A caracterizao do dimetro mdio das gotculas e do potencial zeta aps associao do pdT16 foi realizada nas mesmas condies utilizadas para as formulaes antes da associao do pdT16. Os resultados foram expressos como a mdia (s) de trs experimentos. Anlise estatstica Os resultados foram analisados atravs de teste t de student, considerando-se um nvel de significncia de 0,05. RESULTADOS E DISCUSSO A Tabela 2 apresenta o dimetro mdio de gotcula, o potencial zeta e a viscosidade das nanoemulses obtidas com a adio de quantidades crescentes do lipdeo catinico estearilamina (srie NE). Independentemente da concentrao de estearilamina utilizada, todas as formulaes obtidas apresentaram-se monodispersas (ndice de polidispersidade <0,2), com dimetro das gotculas inferior a 300 nm. Esses resultados esto de acordo com o observado para nanoemulses obtidas atravs do procedimento de emulsificao espontnea em outros estudos 12-14. A adio do co-tensoativo poloxmero 188 (um copolmero do xido de etileno e propileno de natureza no inica), na formulao das nanoemulses catinicas, foi realizada devido as suas propriedades de estabilizao estrica de nanoestruturas 17. Como pode ser observado na Tabela 2, uma reduo significativa do dimetro das gotculas das nanoemulses foi detectada para todas as formulaes da srie NEP (p<0,05) em relao srie NE. Rabinovich-Guilatt e colaboradores (2004) 18 descreveram recentemente um fenmeno similar, sendo que a reduo do dimetro das gotculas observada foi atribuda
Srie NEP

Viscosidade (cP)

Dimetro mdio (nm)

Potencial zeta (mV)

Viscosidade (cP)

0 0.025 0,050 0,250 0,500 NE e NEP.

2744,2 2869,5 2800,7 2664,9 2660,2

-34,32,0 49,32,8 54,32,3 55,62,1 56,13,3

1,360,01 1,440,06 1,320,01 1,470,27 1,690,16

2164,2 2621,4 2484,9 2416,3 2365,6

-32,80,1 55,42,8 55,42,3 55,92,1 57,63,3

1,780,15 1,930,11 1,900,19 2,010,06 2,190,03

Tabela 2. Propriedades fsico-qumicas das nanoemulses contendo concentraes crescentes de SA das sries

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provvel insero da poro hidrofbica do poloxmero 188 interface das nanoemulses. O efeito do poloxmero 188 tambm foi observado nos estudos de avaliao da viscosidade (Tabela 2). Existe uma tendncia significativa (p<0,05) ao aumento da viscosidade de todas as formulaes da srie NEP, em comparao s formulaes da srie NE. Esse resultado pode estar relacionado ao menor dimetro das gotculas detectado para a srie NEP; um menor dimetro das gotculas da fase interna conduz a uma maior superfcie especfica, podendo resultar em um aumento das interaes interparticulares, e consequentemente, em uma maior viscosidade 19. Alm do efeito do dimetro de gotcula sobre a viscosidade, essa propriedade pode tambm ter sido influenciada pela presena de poloxmero disperso na fase aquosa externa das nanoemulses, como descrito anteriormente por Trimaille e colaboradores (2001) 12. As nanoemulses obtidas em ausncia de lipdeo catinico apresentaram um potencial zeta negativo de cerca de -32 mV para as sries NE e NEP (Tabela 2), indicando a presena de fosfolipdeos cidos na lecitina de gema de ovo (Lipoid E-80), como a fosfatidilserina e o cido fosfatdico 17. A adio de estearilamina s nanoemulses conduz inverso do potencial zeta das nanoemulses para valores positivos, indicando a sua localizao na interface leo/gua. A estearilamina um lipdeo catinico que apresenta um pKa de 10,6, conferindo assim uma carga global positiva s nanoemulses no pH das formulaes (pH = 7,4) devido ao seu grupamento nitrogenado. A adio crescente do lipdeo catinico, estearilamina, conduz a um aumento do potencial zeta que varia de +50 at no mximo +57 mV para a concentrao mais elevada do lipdeo catinico (0,5% p/p). Valores de potencial zeta praticamente constantes, com a adio crescente de lipdeos catinicos em nanoemulses, tambm tm sido descritos por outros autores. Essas observaes tm sido atribudas a diferentes fenmenos incluindo a possibilidade de saturao da interface e a reduo da ionizao devido ao elevado pH da interface nesse tipo de nanosistema 18. A Figura 1 apresenta a taxa de associao do pdT16 com as nanoemulses das sries NE e NEP, determinada atravs da tcnica de ultrafiltrao/centrifugao. Verifica-se que a taxa de associao do pdT16 significativamente superior (p<0,05) para todas as formulaes contendo estearilamina em relao formulao controle isenta de lipdeo catinico. Para ambas as

Figura 1. Taxa de associao do pdT16 (12,5 M) com

as nanoemulses contendo concentraes crescentes de estearilamina das sries NE (barras pretas) e NEP (barras cinzas).

series, a taxa de associao do pdT16 (12,5 M) com as nanoemulses catinicas superior a 90%. Como esperado, devido a sua carga positiva, a estearilamina pode estabelecer interaes eletrostticas entre os ON e as gotculas da fase interna das nanoemulses, favorecendo a associao dos ON 10. Apesar da superfcie carregada negativamente, os ON associam-se com as nanoemulses em ausncia de lipdeo catinico, contudo, com uma menor eficincia (<70%). A observao prvia da liberao instantnea de ON associados com nanoemulses, obtidas em ausncia de lipdeos catinicos, aps diluio em tampo fosfato, indica a existncia de fracas interaes entre os ON e os fosfolipdeos da lecitina de gema do ovo presentes na interface das nanoemulses 8. A adio do pdT16 no altera de maneira significativa (p<0,05) o dimetro das gotculas e o potencial zeta das nanoemulses de ambas as sries (Figs. 2 e 3). O potencial zeta permanece positivo e reflete a preponderncia de cargas positivas provenientes da estearilamina em relao ao nmero de grupamentos fosfato dos ON. De fato, a razo entre o nmero de cargas positivas das diferentes concentraes de estearilamina utilizadas na composio das nanoemulses (0,025 - 0,5 % p/p) e o nmero de grupamentos fosfato dos ON na concentrao de 12,5 M varia de 5 a 100. CONCLUSO Este estudo demonstrou o efeito do lipdeo catinico estearilamina e do tensoativo no-inico poloxmero 188 sobre propriedades fsicoqumicas de nanoemulses catinicas como sistemas de liberao de ON. As formulaes con-

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Figura 2. Dimetro mdio das nanoemulses das sries NE e NEP contendo concentraes crescentes de SA antes (smbolos vazios) e aps (smbolos preenchidos) a associao do pdT16 (12,5 M).

Figura 3. Potencial zeta das nanoemulses das sries NE e NEP contendo concentraes crescentes de SA antes (smbolos vazios) e aps (smbolos preenchidos) a associao do pdT16 (12,5 M).

tendo as menores concentraes de lipdeo catinico, de ambas as sries, so as mais promissoras para estudos futuros. Tais formulaes apresentam propriedades fsico-qumicas e eficcia de associao do pdT16 similares s formulaes contendo as maiores concentraes de estearilamina.
Agradecimentos. Rede Nanobiotec/CNPq, CNPq, FAPERGS e FAPEMIG.
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