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Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm.

26 (1): 26-30 (2007)

Trabajos originales Recibido el 24 de marzo de 2006 Aceptado el 03 de agosto de 2006

Avaliao Histolgica da Pele Aps Exposio Gel Acrescido de Hialuronidase Associado ou No a Ultra-Som
Marlus CHORILLI 1,2*, Vivian ZAGUE 1, Maria Cristina de Almeida Prado RIBEIRO 1, Gislaine Ricci LEONARDI 1, Maria Slvia Mariani PIRES-DE-CAMPOS 1 & Maria Luiza Ozores POLACOW 1 Faculdade de Cincias da Sade, Universidade Metodista de Piracicaba, Rodovia do Acar, km 156, 13400-911, Piracicaba - SP, Brasil. 2 Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Araraquara, Departamento de Frmacos e Medicamentos, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, Rodovia Araraquara-Ja, km 1, 14801-902, Araraquara - SP, Brasil.
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RESUMO. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos na pele de sunos machos de gel (G) contendo hialuronidase (H) associado ou no ao ultra-som (US). Em diferentes reas aplicou-se G; G+H; G+H+US e mesoterapia (M). Fragmentos de pele foram processados em parafina. Para evidenciar cido hialurnico (AH) utilizou-se colorao com Alcian Blue (AB) e para morfometria colorao com Hematoxilina/Eosina. Observou-se que G+H e G+H+US no reduziu colorao pelo AB nem apresentou diferenas significantes pela morfometria. J H aplicada mesoterapicamente diminuiu colorao pelo AB. Logo, o uso da H associada ou no com US no mostrou-se eficaz na reduo de HA. SUMMARY. Histological Evaluation of the Skin After Exposition to the Gel Increased of Hyaluronidase Associated or not to Ultrasound. The objective of this work was to verify the effect in the skin of male swines gel (G) containing hyaluronidase (H) associated or not to ultrasound (US). In different areas was applied G; G+US; G+H; G+H+US and mesotherapy (M). Skin fragment was processed in paraffin. To evidence hyaluronic acid (HA) coloration with Alcian Blue (AB) was used and coloration with Hematoxilin/Eosin for morphometry. It was observed that G+H and G+H+US did not reduce coloration for the AB nor presented significant differences for the morphometry. When H was applied mesoteraphycally coloration for the AB diminished. Then, the use of H associated or with US did not seem efficient in the HA reduction.

INTRODUO Do ponto do vista clnico, a lipodistrofia ginide, conhecida popularmente como celulite um espessamento no inflamatrio das capas subepidrmicas, s vezes doloroso, que se manifesta em forma de ndulos ou placas de variada extenso e localizao 1. A lipodistrofia ginide, alm de trazer desagrados do ponto de vista esttico, pode tambm acarretar complicaes nas zonas acometidas e conseqente diminuio das atividades funcionais, podendo levar quase total imobilidade dos membros inferiores, alm de dores constantes e problemas psicolgicos. A alterao inicial que leva formao deste quadro parece ser a deteriorao da substncia intersticial e rede ca-

pilar, levando reteno excessiva de lquidos na derme e em tecidos subcutneos 2. Para Lotti et al. 3 as mudanas patolgicas so edema, alargamento dos vasos linfticos na derme, e um aumento no volume de clulas adiposas no subcutis. O aspecto casca de laranja presente em um tecido com lipodistrofia ginide formado pelas alteraes da arquitetura da derme e tecido subcutneo associada desidratao epidrmica 4. Estudos de Rosenbaum et al. 5 apontam para a anatomia topogrfica do tecido adiposo, na qual distingem-se duas camadas que so separadas por uma fscia superficial. A camada mais externa, que fica em contato com a derme, chama-se areolar, sendo composta por adipcitos

PALAVRAS CHAVE: Hialuronidase, Histoqumica, Morfometria, Ultra-som. KEY WORDS: Hyaluronidase, Histochemical, Morphometry, Ultrasound.
* Autor a quem dirigir correspondncia: E-mail: mlchoril@unimep.br

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ISSN 0326-2383

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globulares e volumosos, em disposio vertical, com vasos sangneos numerosos e delicados. J a camada mais profunda, chamada de lamelar, apresenta clulas fusiformes, menores e com disposio horizontal, onde os vasos so de maior calibre. Em mulheres, o limite derme-hipoderme irregular e os septos de tecido conjuntivo formam vigas verticais. Dessa forma, se houver hipertrofia da hipoderme, ocorrer formao de herniaes para a derme reticular, resultando no aspecto casca de laranja na pele. Em homens, o limite derme-hipoderme liso, os septos so mais espessos e oblquos e quando ocorre hipertrofia da hipoderme, esses septos, por serem oblquos, pressionam as clulas adiposas contra a musculatura subjacente em direo derme, sem formar, portanto, herniaes. Tais diferenas estruturais na fscia superficial so diferenciadas por hormnio sexual feminino estrgeno 5. Isto explica a presena de lipodistrofia ginide mesmo em mulheres esbeltas, pois reflete a expanso do tecido adiposo para dentro da derme, quando o prprio tecido e sua cpsula de tecido conjuntivo circundante se encontram comprimidos 5. Alguns fatores como idade, hormnios, sol e mudanas bruscas de peso provocam o relaxamento e estiramento do sistema fascial, j que esto intimamente relacionados com as regies de aderncia da fscia superficial em virtude de que as reas de menor aderncia tm menor grau de estiramento e menor volume. Tais elementos, associados s reas de gravidade, provocam ptose dos tecidos moles e formao de lipodistrofia ginide 6. Com relao aos agentes etiolgicos ou etiopatogenia da lipodistrofia ginide, esto presentes os fatores desencadeantes, predisponentes e agravantes 1,7,8. Os fatores desencadeantes compreendem as alteraes de natureza hormonal que ocorrem na adolescncia. Dentre os hormnios envolvidos no processo de lipodistrofia ginide, o principal o estrgeno, que o iniciador do processo e o principal responsvel pelo agravamento da mesma, agindo ao nvel de 8: a) substncia fundamental amorfa, provocando alterao do colgeno e das glicosaminoglicanas, ocasionando conseqentemente o edema intersticial (devido ao acmulo de gua) e levando a fibroesclerose caracterstica da lipodistrofia, b) adipcitos, aumentando a resposta dos receptores alfa-antilipolticos e estimulando a LPL, enzima

responsvel pela lipognese e c) microcirculao, provocando diminuio do tnus venoso e vasodilatao. Os fatores predisponentes so os mltiplos fatores hereditrios como: sexo; raa; biotipo constitucional; distribuio do tecido adiposo; nmero, disposio e sensibilidade dos receptores das clulas afetadas pelos hormnios. J entre os fatores agravantes esto hbitos alimentares, sedentarismo, fatores emocionais, hbitos de vida, patologias, medicamentos e gravidez 8. Uma das mais importantes unidades funcionais do tecido conjuntivo adiposo a unidade matriz-intersticial que constituda por clulas (especialmente fibroblastos), pela matriz extracelular, por uma parte fibrosa (fibras colgenas, elsticas e reticulares) e por substncia fundamental (constituda de proteoglicanas, glicoprotenas e cido hialurnico) 8. As glicosaminoglicanas (GAGs) so cadeias de polissacardios compostas de unidades repetidas de dissacardeos, ligadas covalentemente s protenas para formar molculas de proteoglicana com alta propriedade hidroflica 9. Concentram-se principalmente na matriz extracelular, na periferia e entre a elastina e o colgeno. Sete grupos maiores de glicosaminoglicanas tm sido distinguidos: cido hialurnico, condroitina-4sulfato, condroitina-6-sulfato, dermatana sulfato, heparana sulfato, heparina, queratana sulfato, sendo que o principal deles o cido hialurnico 3. Na pele, o cido hialurnico prov uma alta hidratao que facilita o movimento de clulas que ocorre em estgios prematuros de dano, inflamao ou cicatrizao de feridas. Ele tambm pode contribuir para as propriedades elsticas da derme por formao de uma rede de estruturas helicoidais, e por diferenciao epidermal 10. Na lipodistrofia ginide, alteraes nos fibroblastos causadas principalmente pelo estrgeno levam a modificaes estruturais das GAGs com hiperpolimerizao, elevando seu poder hidroflico e a presso osmtica intersticial. Essa capacidade hidroflica das GAGs resulta em grande incorporao de gua na matriz celular o que a torna a principal responsvel pela presso osmtica intersticial. Isso gera turgor que faz com que a matriz resista s foras compressoras, demonstrando, portanto, que h aumento da concentrao das GAGs 9. Para atuar no tecido adiposo, principal regio acometida pela lipodistrofia ginide, a substncia ativa precisa permear a pele e por is-

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CHORILLI M., ZAGUE V., RIBEIRO M.C. de A.P., LEONARDI G.R., PIRES-DE-CAMPOS M.S.M. & POLACOW M.L.O.

so promotores fsicos de absoro, como o ultra-som (US), vm sendo utilizados como uma alternativa mesoterapia, tcnica invasiva e bastante questionada nos dias atuais. A desorganizao das clulas da camada crnea provocada por esses agentes um importante mecanismo para acelerar a penetrao cutnea 11. A hialuronidase, enzima que despolimeriza o cido hialurnico, reduzindo a viscosidade do meio intercelular, aumentando a permeabilidade de membranas e vasos sangneos, levando reabsoro de excesso de fluidos e mobilizando os edemas 10, tem sido utilizada em associao, ou no, com o US na atenuao da lipodistrofia ginide. Nas reas afetadas pela lipodistrofia ginide, tem-se aumento de GAGs, sendo o cido hialurnico a principal GAG no tecido conjuntivo. Lotti et al. 3 observaram que o aumento da concentrao das GAGs a causa da reteno hdrica, edema e fibroesclerose. Dentre as substncias ativas usadas nas formulaes tpicas para o tratamento da lipodistrofia ginide tem-se a hialuronidase. Porm, a hialuronidase uma molcula muito grande e para facilitar a penetrao desta na pele tem-se recorrido ao emprego de tcnicas fsicas como a fonoforese e a iontoforese. Trata-se tambm de uma molcula sensvel que necessita de cuidados especiais para manter-se estvel na formulao. Logo, estudos de eficcia so necessrios para avaliar-se o efeito desta enzima no tratamento da lipodistrofia ginide. O objetivo deste trabalho foi verificar, na pele de sunos, os efeitos de um gel (G) contendo hialuronidase (100 UTR/g) associado ou no ao uso do US atravs de anlises histoqumica e morfomtrica. Foi realizado tambm um estudo comparativo com a mesoterapia. MATERIAL E MTODOS Foram utilizados cinco sunos machos, hbridos (Landrace X Large White), com 35 dias. Aps tricotomia de 5 reas (4 cm 2) no dorso dos animais, realizou-se os seguintes tratamentos dirios em reas padronizadas: gel, gel + US, gel + hialuronidase, gel + hialuronidase + US e mesoterapia (realizada em 4 sesses). O gel foi constitudo de 5% de propilenoglicol, 1% de cido carboxivinlico, 0,2% de metil dibromoglutaronitrila e fenoxietanol, gua destilada e trietanolamina. O gel foi acrescido, ou no, de hialuronidase (100 UTR/g).

O US utilizado foi o KW Sonomaster Microcontrolado, freqncia de 3 MHz, intensidade de 0,2 W/cm2, com emisso contnua, por 2 minutos. Para a mesoterapia, utilizou-se ampolas com 2 mL de hialuronidase a 5000 UTR por aplicao. Vale salientar que a concentrao de hialuronidase utilizada para mesoterapia diferente da concentrao da mesma no gel, pois em clnicas dermatolgicas, at ento, utilizavam-se esta concentrao do frmaco para mesoterapia 12. Aps 15 dias de tratamento, fragmentos de pele tratados foram retirados dos animais. A fixao dos segmentos foi em BOUIN (24 h), sendo processados rotineiramente em parafina. Para evidenciar cido hialurnico, utilizou-se Alcian Blue (AB) pH 2,5 13, com o propsito de, atravs da intensidade da colorao, observar se houve diminuio de cido hialurnico. Para as anlises morfomtricas e histopatolgicas, por rea de tratamento de cada animal, obteve-se nove cortes de 6-7 m de espessura, no seriados e tratados com Hematoxilina e Eosina (HE). A espessura das camadas da pele foi obtida atravs de vinte medidas feitas aleatoriamente nos cortes, usando-se uma ocular milimetrada da Zeiss 14. As espessuras da epiderme e da camada crnea foram obtidas em micrmetros (m). J as espessuras da derme e hipoderme foram obtidas em milmetros (mm). A camada crnea foi mensurada em reas onde esta se apresentava bem aderida epiderme e foi considerada a distncia entre a poro superior da camada granulosa at a superfcie. Para a epiderme obteve-se medidas em reas planas, sem muitas papilas drmicas, atravs da distncia entre a membrana basal at a borda externa da camada crnea. Para a derme, foram obtidas as distncias entre a membrana basal at o limite da derme com a hipoderme, incluindo, assim, a derme papilar e reticular. Por fim, as espessuras da hipoderme foram obtidas partir do limite derme-hipoderme at a fscia superficial, j que houve muitas variaes na coleta da pele. Portanto, as medidas obtidas referem-se camada areolar (mais externa), desprezando-se a camada lamelar (mais profunda), pois esta no estava ntegra em todos os cortes. Realizou-se anlise no paramtrica pelo teste de Friedman, j que a distribuio dos dados no foi homognea. Para comparao das mdias dos tratamentos entre si, utilizou-se o teste Dunnits de comparaes mltiplas (p<0,05).

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RESULTADOS E DISCUSSO Em relao s lminas coradas com AB observou-se nas reas controle e tratadas com gel, gel + US, gel + hialuronidase e gel + hialuronidase + US a presena de cido hialurnico, evidenciado pela colorao azul, sendo que nos grupos tratados com hialuronidase bem como hialuronidase + US a intensidade da colorao no diminuiu. J nos fragmentos de pele tratados com mesoterapia, observa-se atenuao da colorao entre os feixes de colgeno, principalmente na derme, o que comprova a eficcia do mtodo de colorao (Figs. 1 e 2). Estes resultados confirmam os de Godeau & Robert 15, que observaram, atravs de um estudo por anlise informatizada de imagens, a reduo de cido hialurnico entre as fibras de colgeno em derme de coelho aps tratamento mesoterpico

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com hialuronidase. J trabalho de Laugier et al. em cultura de pele e com aplicao tpica de hialuronidase e cido hialurnico, demonstraram que a hialuronidase veiculada em soluo, numa concentrao de 100 UTR/mL, reduziu a quantidade de cido hialurnico, comprovado pela reduo de reao histoqumica. Na anlise morfomtrica, as espessuras das camadas da pele podem ser observadas na Tabela 1. Na camada crnea, observa-se reduo estatisticamente significante para o tratamento gel + US. Provavelmente, isto se deve ao do ultrasom que provoca desnaturao da queratina e remoo das clulas mortas 16, levando diminuio da espessura da mesma. J na pele tratada com gel + hialuronidase + US no houve reduo estatisticamente significativa. Porm, tes-

Figura 1. Fotomicrografias da pele de sunos. Observa-se principalmente nos tratamentos gel + hialuronidase e

gel + hialuronidase + US a presena de cido hialurnico, evidenciado pela colorao azul - seta. Na pele tratada com mesoterapia, a intensidade da colorao azul menor (AB, 400x). A: Controle, B: Mesoterapia - H, C: Gel + H, D: Gel + H+ US.

Figura 2. Fotomicrografias da derme de sunos. Observa-se no grupo tratado com mesoterapia atenuao da co-

lorao entre os feixes de colgeno, evidenciando diminuio de cido hialurnico, sendo que os grupos controle e tratados com hialuronidase e hialuronidase + US mantiveram a colorao - seta (AB, 400x). A: Controle, B: Mesoterapia - H, C: Gel + H, D: Gel + H+ US.

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CHORILLI M., ZAGUE V., RIBEIRO M.C. de A.P., LEONARDI G.R., PIRES-DE-CAMPOS M.S.M. & POLACOW M.L.O.

Epiderme

Camada crnea

Derme

Hipoderme

Controle Gel Gel + US Gel + Hialuronidase Gel + Hialuronidase + US Mesoterapia Hialuronidase

74,1515,28 90,4014,26 76,7310,66 81,7010,78 74,339,97 81,6314,75

24,137,14 31,989,35 16,756,14* 22,588,68 19,785,46 19,635,11

1,740,10 1,730,11 1,440,16 1,710,17 1,580,17 1,500,11

3,060,28 3,260,22 3,120,24 3,100,30 2,970,30 2,530,24

Tabela 1. Mdia desvio padro da mdia da espessura da epiderme (m), camada crnea (m), derme (mm) e hipoderme (mm) de pele de sunos nos vrios tratamentos (n=5). * Diferena estatisticamente significante (p<0,05).

tes anteriores constataram que a presena da enzima no gel no ocasionou reduo das ondas ultrassnicas. Em relao derme, no houve alteraes significativas nos tratamentos realizados. Este resultado corrobora os dados das lminas tratadas com AB, sugerindo a no eficcia da formulao tpica nas condies experimentais (na concentrao de 100 UTR de hialuronidase / g de gel). Na hipoderme, tambm no houve alteraes estatisticamente significantes, inclusive no tratamento mesoterpico, resultado j esperado, pois no se observava, nos animais, excesso de fluidos para ser diminudo com este frmaco.

CONCLUSES Como no houve reduo de cido hialurnico nos fragmentos de pele tratados topicamente com hialuronidase e hialuronidase + US, sugere-se que no houve a ao desta enzima nas condies experimentais empregadas. A hialuronidase aplicada atravs de mesoterapia provocou diminuio da colorao pelo AB, evidenciando a atividade enzimtica. Comprova-se, ento, a eficcia desta enzima na mesoterapia.
Agradecimentos. Agradecemos ao CNPq e ao FAPUNIMEP pelo apoio financeiro.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Guirro, E.C & R.J. Guirro (2002) Fisioterapia dermato-funcional; fundamentos, recursos e patologias, Ed. Manole, So Paulo, pgs. 20326. 2. Draelos, Z.D & K.D. Marenus (1997) Am. Soc. Dermatol. Surg. 23: 1177-81. 3. Lotti, T., I. Ghersetich, C. Grappone & G. Dini (1990) Int. J. Dermatol. 29: 272-4. 4. Accrsio, W (1999) Rev. Cosmiatria Md. Este tica 7: 25-6. 5. Rosenbaum, M., V. Prieto, J. Hellmer, M. Boschmann, J. Krueger, R. Leibel & A.G. Ship (1998) Plast. Reconstr. Surg. 101: 1934-9. 6. Moretti, E., A. Schapira, G. Kaplan & E. Alonso (1997) Mesoterapia Atual. 7. Pires de Campos, M.S.M (1992) Revista de Cincia e Tecnologia 1: 77-82. 8. Rossi, A.B & A.L. Vergnanini (2000) J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 14: 251-62.

9. Paschoal, V. & A. Naves (2001) Revista - Nu trio, Sade e Performance 9: 18-22. 10. Laugier J.P., S. Shuster, M. Rosdy, A.B. Cska, R. Stern & H.I. Maibach (2000) Brit. J. Derma tol. 142: 226-33. 11. Marjukka Suhonen, T., J.A. Bouwstra & A. Urtti (1999) J. Control. Release 59: 149-61. 12. Oliveira Filho, A.E (1999) Mesoterapia Atual 5: 5-6. 13. Kupchella, C., L. Matsuoka, B. Bryan, J. Wortsman & J. Dietrich (1984) J. Histochem. Cyto chem. 23: 1121-4. 14. De Lacerda, C.A.M. (1994) Manual de quanti ficao morfolgica: morfometria, alometria, estereologia. 2.ed. Ed. CEBIO, Rio de Janeiro, pgs. 8-9. 15. Godeau, G. & A.M. Robert (1988) Pathol. Biol. 36: 833-8. 16. Byl, N (1995) Phys. Ther. 75: 539-53.

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