COLORANTES TPICOS

Muchas de las prcticas realizadas son observaciones con el microscopio ptico. He aqu un cuadro que resume los principales colorantes utilizados para evitar repeticiones en cada prctica: COLORANTE COLOR ESTRU CTUR A TEID A Compue stos nucleare s Citoplas mas Mucopo lisacrid os Colgen o Glbulo s rojos ARN Lpidos Glucge no

Hematoxilina

Eosina Azul alcin Verde luz Orange G Violeta de Cresilo Sudn III Carmn de Brest

PRCTICA I
Manejo del microscopio

El microscopio ptico es un instrumento amplificador de imgenes cuyo espectro utilizable oscila entre 50 nm y 1 mm aproximadamente, lo que quiere decir que permite distinguir clulas con facilidad, aunque no tiene la resolucin suficiente como, por ejemplo, para dejar observar membranas celulares. * Resolucin: capacidad que tiene un dispositivo ptico para ver como separados dos puntos prximos. La resolucin en microscopa ptica es del orden de micrmetros, mientras que en microscopa electrnica es del orden de nanmetros El microscopio ptico posee tres sistemas: Mecnico: sostn de los elementos pticos y muestras a observar: o Pie o Platina o Tornillos macromtrico y micromtrico ptico: sistemas de lentes: o Ocular (hasta x10 aumentos) o Objetivos (x4, x10, x40, x100 aumentos; aunque este ltimo no lo vamos a utilizar en las prcticas, pues la muestra necesita un tratamiento especial) o Condensador (se utiliza para aumentos a partir de x40) Iluminacin: o Fuente de luz

Tinciones
-Hematoxilina eosina: La muestra de hgado ha sido teida con hematoxilina
que tie de morado los ncleos de morado (por ser acidfilo) y eosina que tie el citoplasma de rosa (por ser basfilo). Con el aumento de 3,2 tan slo se divisan con nitidez tres colores: uno amarillento, otro anaranjado y otro rojizo. Con el aumento de 10, ya se ven venas centrolobulillares (de color blanco), sinusoides (blancos tambin) y se intuyen los ncleos de los hepatocitos, que se disponen entorno a estos vasos formando hileras

denominadas trabculas, por su color morado (debido a la hematoxilina). Los hepatocitos con su ncleo y citoplasma ya se distinguen perfectamente con el aumento de 40. En bastantes clulas no slo se distingue el ncleo, sino incluso los nucleolos.

-Tricrmico de masson: compuesto por verde luz, que tie colgeno de azul verdoso, Orange G que tie eritrocitos de naranja, fuccsina tie el citoplasma de rosa y hematoxilina que tie ncleos de morado. Observamos fibras musculares en distintas direcciones, tejido epitelial pluriestratificado, papilas gustativas, vasos sanguneos (huecos blancos), clulas muertas descamadas (naranja) en la superficie.

Colorantes especficos: en este tipo de tincin, se emplea la tincin especfica y otra para contrastar. azul alcin: intestino de rataEs una muestra de intestino teida con hematoxilina-azul alcin, que va a teir los mucopolisacridos, sintetizados por clulas calciformes. Tambin se observan, enterocitos y vasos sanguneos que pueden contener sangre o estar completamente vacos

violeta de cresilo: corteza de cerebelo humano va a teir de violeta el nucleolo y los granos de Nissl, se encuentran en las clulas de Purkinje pues ambas estructuras poseen ARN. Esos granos de Nissl son equivalentes al retculo endoplasmtico rugoso. El ncleo de las clulas del cerebelo se va a ver blanco, pues slo tiene ADN (y no ARN). Se distinguen dos capas, capa granulosa en los somas de las neuronas y capa molecular que contienen sobre todo axones neuronales.

Colorantes enzimticos: la tincin est basada en la obtencin de un producto coloreado mediante una reaccin enzimtica. Succiono DH: corazn de rata: a partir de succianto de sodio en el tejido de corazn se obtienen sales de tetrazolio mediante la succinato DH. El precipitado de las sales tiene color, azul, cuanto mayor sea la intensidad del color, mayor actividad enzimtica tendr la muestra.

Fosfatasa alcalina: hgado rata: A partir de sales de Diazonio se obtienen sales de plata, mediante la fosfatasa alcalina, el color resultante es marrn. De la actividad enzimtica depender la intensidad del color.

PRCTICA II
Preparacin de una muestra para microscopa ptica Esta prctica consiste en el proceso de preparacin de muestras para su posterior observacin con el microscopio ptico. Se divide en dos partes: la primera incluye desde la fijacin del tejido hasta la fijacin en el porta; la segunda abarca desde la tincin hasta el montaje, momento en el que la muestra queda lista. Primeramente se produce la fijacin del tejido en cuestin mediante alguno de los fijadores que se suelen utilizar (alcohol, buen fijador de enzimas; formol, bueno para protenas de membrana...). En segundo lugar se lavan las piezas con agua para quitar el exceso de fijador. El siguiente paso es la deshidratacin de la muestra con alcohol, ya que es necesario para la posterior inclusin en parafina, no miscible en agua. La parafina es una cera slida a temperatura ambiente, con lo que se ha de introducir en un calentador a ms de 56 C, de manera que se funda. Se vierte un poco de parafina lquida entre dos barritas metlicas y se coloca en ella la muestra que se quiere estudiar. Dependiendo del estudio que se vaya a realizar ser indiferente su orientacin o no. Una vez se haya solidificado la parafina, se obtiene un bloque en cuyo interior se haya la muestra. Se llega entonces a la fase de microtoma, en la que, gracias a la utilizacin de un microtomo de rotacin, se cortan secciones de 7 micras de espesor. Tras esto, mediante un pincelillo hmedo, se coge una seccin lo ms estirada posible y se coloca con rapidez, precisin y cuidado en un recipiente con un bao de agua caliente. Si al colocarla all, la seccin no se dobla por la parte de la muestra, podremos utilizarla. Entonces, con un porta se pesca la seccin y sta queda pegada inmediatamente a dicho porta, gracias a que ste ha sido previamente impregnado de una mezcla de glicerina y albmina, con gran poder adhesivo. En este punto termina la primera parte de la prctica. El primer paso de la segunda parte es la tincin, que se realiza con colorantes de origen vegetal que tien determinadas partes. En esta prctica se us hematoxilina (tie de morado el ncleo) y eosina (que tie de rojo el citoplasma). La ltima fase es el montaje, para el cual hay que deshidratar la muestra con alcohol e incluir en el cubre que se va a colocar sobre la misma un par de gotas de blsamo de Canad. No obstante, para ello habr que introducir antes xilol, ya que el blsamo de Canad y el alcohol no son miscibles entre s. Una vez hecho esto se coloca el cubre sobre la muestra del porta y se eliminan las pequeas burbujas de aire que se han podido formar mediante una aguja enmangada. Una vez realizada esta operacin, las muestras estn preparadas para la microscopa ptica.

Microscopa electrnica La prctica trata sobre los mtodos de preparacin de muestras para la microscopa electrnica. Por un lado se habla de la de transmisin y por otro de la de barrido.
En microscopa electrnica de transmisin, lo primero que se hace es la fijacin (ms intensa que en microscopa ptica) mediante, generalmente, glutaraldehdo. En el lavado se incluye lquido de Milloing (sistema tamponador pH = 7,3). Se hace una postfijacin con tetrxido de osmio (incluyendo por tanto metales pesados que van a permitir que los electrones del filamento de Tungsren reboten. El siguiente paso es otro lavado con agua destilada. La inclusin no se hace en parafina, sino en resinas sintticas como aralditas, que formarn bloques en cuyo interior quedar encerrada la muestra objeto del estudio. Como las aralditas son inmiscibles en agua, previamente se lleva a cabo una deshidratacin con acetona y, dado que sta tampoco se puede mezclar con las aralditas, se introducen sustancias intermedias, como xido de propileno. Los cortes que se pueden hacer en la ultramicrotoma son muy pequeos (entre 60 y 200 nm). stos se sitan posteriormente (previa inmersin en agua) sobre una rejilla metlica, que antes hay que cubrir con una membrana de Formuvar (se empapa un porta de esta sustancia y, una vez seco, con una cuchilla, se rodean los bordes del porta, obtenindose la membrana cortada, que se separa mediante un bao en agua). La tincin se lleva a cabo con citrato de plomo. En microscopa electrnica de barrido la fijacin y el lavado son idnticos a los explicados para la de transmisin. La deshidratacin se hace con acetona. Despus se envuelve la muestra en un papel y se introduce en un bote con acetona al 100%. Luego se da una nueva deshidratacin extrema. Es muy importante una buena deshidratacin, pues el agua, al evaporarse deteriorara el microscopio. El posterior metalizado se hace con oro paladio. Se utiliza un instrumento que posee una placa de oro paladio, que al calentarse va a desprender partculas metlicas sobre la muestra. As, va a estar preparada nuestra muestra.

En la microscopia de barrido se observan solo la superficie mientras que en la de transmisin se puede observar el interior de las estructuras. Cultivos celulares Esta parte de la prctica consiste en iniciar la elaboracin de un cultivo de fibroblastos a partir de piel de rata (slo la capa entre la epidermis y la grasa subcutnea). Slo se trabaja con tejido conjuntivo. Obviamente el cultivo no va a ser utilizado ni se va a dejar que progrese, pues las medidas de esterilidad son muy escasas.
El material utilizado es una placa de Petri, dos pipetas Pasteur (una de vidrio y otra de plstico), dos hojas de bistur y un frasco de cultivo (con una superficie de cultivo de 25 cm2).

Es un cultivo primario, es decir, las clulas van a vivir por primera vez en condiciones in vitro. Se considera adems un cultivo adherente, pues el fibroblasto se pega a la superficie de cultivo que ya tiene cargas positivas. Hay interaccin electrosttica con las clulas que van a crecer all. Tambin se dice que es un cultivo de exlpanto, pues hay que hacer fragmentos lo ms pequeos posibles. En el frasco de cultivo se echa medio de cultivo. Se forma una pelcula de adhesin a la que se pega el cultivo. Ese medio de cultivo es el McCoy. Hay que aadirle suero fetal, sin el cual las clulas no se dividiran, pues es muy rico en protenas y factores mitognicos. Adems, el tejido est en MEM (Minimal Essential Medium), necesario cuando el cultivo de la muestra no se hace inmediatamente despus de su extraccin. Sin el MEM, las clulas moriran con el tiempo. Si el cultivo se va a hacer inmediatamente, vale con conservarlo en suero salino. El proceso que se llev a cabo en esta prctica transcurri as: se volc el tejido en la placa de Petri, se cort con las hojas de bistur y se obtuvieron en torno a 40 explantos. Se cogi con la pipeta Pasteur de plstico el McCoy y, con la otra pipeta, se cogan los explantos y se colocaban en la pelcula del frasco de cultivo.

PRCTICA III Inclusiones paraplsmicas Glucgeno. Carmn de Best La muestra de tejido heptico, tambin
de rata, ha sido teida con hematoxilina y con carmn de Best. Se observa nucleos de color morado debido a la hematoxilina, inclusiones de glucgeno rosas por Carmin de Best.

TAB (WAT): Esta muestra ha sido fijada por congelacin para no perder las grasas. Se ha utilizado Oil-red (colorante lipofilico) contrastado con hematoxilina. Se observa un adipocito con el

nucleo (morado) desplazado a la periferia debido a la gran gota lipidica (naranja) se encuentra en el centro y ocupa casi todo el citoplasma.

TAP (BAT): Termogenina animales hibernantes. Se observa un color marron en la periferia debido a que posee gran cantidad de mitocondrias que poseen molculas cromoforas ( Citocromos). Se puede visualizar colgeno, musculo y sangre. Por ultimo, se visualizan grandes huecos que corresponde a la silueta de la inclusin lipidida. El lipido se ha perdido debido a que hemos utilizado el mtodo de tincin convencional.

Preparaciones ciclo cellular y mitosis (clulas en cultivo) Autorradiografa (hepatocito) Se ha inyectado timidina tritiada en el
animal de experimentacin vivo. sta sustituye a la timina, de manera que el tritio hace un marcaje radiactivo. Despus se ha sometido la muestra a una emulsin plateada, que va a dar una puntuacin negra en los ncleos. Al igual que antes, la hematoxilina indicar que la clula no est en fase S. Utilizamos la timidina debido a que un nucleosido especifico del DNA. La inyeccin de la timidina se realizo cuando el animal estaba vivo dado que este al replicar el DNA va a fijar la timidina radiactiva. La fijacin

Tcnica inmunocitoqumica (PCNA)La primera es la tcnica

PCNA, que permite saber si la clula est en fase S o G2, (de interfase). A la muestra se ha aadido un anticuerpo especfico: la anticiclina A, que marca de rojo, y, para el resto, se ha utilizado hematoxilina. As, la

clula se haya en G2 o S, los ncleos se vern rojos, y si no, morados ampliar en internet. El PCNA es un antgeno nuclear de clulas que proliferan. Esta molcula est implicada en la replicacin del DNA y acta como abrazadera deslizante del DNA se trata de un cofactor de la polimerasa delta que proporciona procesividad a la enzima (sirve de enlace entre el DNA y esta).Este antgeno no se encuentra siempre en la clula, aparacece principalmente en la fase S, tambin se pueden encontrar en menor medida en la fase G1 Y G2. El PCNA se presenta en forma de homotrmeros, 3 molculas iguales. Para poder observar el PCNA

-Raz de cebolla: Hemos utilizado raz de cebolla debido a que es un tejido parenquimatico y, por lo tanto, tiene un crecimiento celular continuo que facilita la observacin de las distintas fases del ciclo celular. La tincin que hemos empleado ha sido la hematoxilina que tie de morado. Se pueden observar nucleos en clulas que se encuentran en interfase. El resto de clulas presentaran diferente grado de condensacin de su material gentico igualmente teido de color morado. PRCTICA IV Da 1. Frotis sanguneo La primera pare de esta prctica se bas fundamentalmente en la extraccin de la sangre para los posteriores ejercicios. Se explic la metodologa para extraer la sangre y se hizo. 0,3 ml de esa sangre fueron mezclados con medio de cultivo en una cabina de flujo laminar. Dicha mezcla servira posteriormente para hacer el cariotipo.
En segundo lugar, se verti una gota de la sangre sobrante en un porta y, con otro, se extendi, para poderlo ver con microscopa ptica. Tras esto, se fij con metanol. Para terminar el frotis, slo falta la tincin con Giemsa y el lavado con agua. Clulas sanguneas Para determinar el grupo sanguneo y el Rh se sigui el siguiente procedimiento: En un porta hay aglutinina aglutinina otro con antgeno D. As, las , y dos primeras indican el grupo sanguneo y la tercera determina el Rh. En mi caso, se produjeron sendas reacciones antignicas en la primera y en la tercera, con lo cual soy A+. Si no se da reaccin en la tercera es un Rh negativo; si en vez de en la primera, se da en la segunda, el grupo sanguneo sera B; si se produjera tanto en la primera como en la segunda, el grupo sera AB; y, si no se produce en ninguno de los dos, el grupo ser 0. Para realizar el cariotipo hubo que dejar el tubo con sangre y medio de cultivo durante tres das a 37C. El cariotipo se va a obtener de los linfocitos mononucleados, a los

que se ha aadido fitohemoglutinina, que estimula la entrada en mitosis de las citadas clulas. La sangre no se coagula pues en la aguja con la que se extrajo, haba una pequea capa de heparina, que impide la coagulacin. El medio de cultivo tena RPMI, suero bovino fetal, HEPES buffer, glutamina y una mezcla de penicilina y estreptomicina. Tras esos tres das, se aadieron 0,01 ml de colcemida, que detiene las clulas en metafase, de manera que se van a poder observar los cromosomas metafsicos.

Grupos sanguneos Cultivo Da 2 Cariotipo La prctica del segundo da se bas en pipetear y centrifugar. Se pasaron los cultivos a tubos de fondo cnico. Se centrfugo durante diez minutos a 200 g. Tras esto, se desech el sobrenadante y, al sedimento, se le aadi una solucin hipotnica de cloruro potsico al 0,56%. Despus incub durante quince minutos y se aadi Carnoy y se centrifug a 200 g. Nuevamente se desech el sobrenadante y se aadi Carnoy. Se dej veinte minutos a temperatura ambiente y se centrifug durante diez minutos a 200 g. Se repiti tres veces la operacin de desecho del sobrenadante y centrifugacin. Por ltimo, al ltimo sedimento se le aadieron unas gotas de Carnoy y se resuspendi (cada vez que se echaban nuevos elementos en el tubo, se suspenda). Ms tarde se dejaron caer desde cierta altura tres gotas. Luego, ha de secarse. Curiosidad: En esta clase aprendimos cuan barato y sencillo es la inyeccin letal junto con su mecanismo. Esta basado en la inyeccin de potasio que se encuentra en la sal yodada. El potasio rompe el equilibrio electroqumico que permite la contraccin muscular entre ellas la del miocardio.