J Bras Patol Med Lab v. 44 n. 4 p.

263-269 agosto 2008

artigo origiNal original article

Monitoramento em cabine de segurana biolgica: manipulao de cepas e descontaminao em um laboratrio de micobactrias

Biological safety cabinet monitoring: strains manipulation and decontamination in a mycobacteria laboratory

Primeira submisso em 09/11/07 ltima submisso em 07/06/08 Aceito para publicao em 09/07/08 Publicado em 20/06/08

Suely Yoko Mizuka Ueki1; Erica Chimara2; Jonas Umeoka Yamauchi3; Fbio de Oliveira Latrilha4; Fernanda Cristina dos Santos Simeo5; Letcia Lisboa Moniz6; Carmen Maria Saraiva Giampaglia7; Maria Alice da Silva Telles8

unitermos
Cabine de segurana biolgica Radiao ultravioleta Micobactrias

resumo
Objetivos: Verificar evidncias da formao de aerossis durante a manipulao de cepas de micobactrias para teste de sensibilidade s drogas (ANT) e identificao (TIP) e o efeito da descontaminao com soluo de lcool 70% e luz ultravioleta (UV) na cabine de segurana biolgica (CSB), aps os procedimentos laboratoriais. Mtodos: Uma placa foi exposta na CSB durante os procedimentos de ANT e TIP. Ao trmino, a CSB foi limpa e descontaminada com lcool 70% e exposta luz UV por 15 minutos. Aps esse tempo outra placa foi exposta por duas horas, somente com a ventilao da CSB ligada. As placas foram incubadas a 37C e observadas por 30 dias. Os esfregaos das colnias isoladas foram corados pelas tcnicas de Ziehl Neelsen e Gram, e as colnias de bacilo lcool-cido-resistente (BAAR) foram identificadas pelos mtodos tradicionais. Resultados: Nas 38 placas expostas durante o ANT, cresceram micobactrias em 10 placas (26,3%), fungos em uma (2,6%) e outros bacilos em duas (5,3%). Das placas com micobactrias, oito (80%) foram identificadas como M. tuberculosis e duas (20%) tiveram identificao inconclusiva. Mesmo aps a descontaminao com lcool 70% e uso de UV, cresceram fungos em duas placas (5,3%) e cocos em outras duas (5,3%). Nas 30 placas colocadas nas CSB durante a TIP, cresceram micobactrias em 10 placas (33,3%), fungos em duas (6,6%), cocos em uma (3,4%) e uma mistura de micobactrias e outro bacilo em uma (3,4%). No houve crescimento nas placas expostas aps descontaminao das CSB com lcool a 70% e uso de UV ao trmino da TIP. Concluso: Durante os procedimentos houve formao de aerossis contendo micobactrias, fato que ficou comprovado pelo crescimento de colnias de micobactrias nas placas expostas. Tcnicas laboratoriais adequadas devem ser respeitadas para minimizar a formao de aerossis como tambm observar a experincia dos profissionais, a manuteno de um programa de capacitao e a manuteno peridica da CSB.

abstract
Objectives: To verify the evidence of aerosol formation during the manipulation of mycobacteria strains for susceptibility (ST) and identification tests (IT) as well as the decontamination effect of alcohol solution 70% and ultraviolet (UV) radiation in biological safety cabinets (BSC) after laboratory procedures. Methods: One plate was exposed in a BSC during ST and IT procedures. Afterwards, the BSC was cleaned and decontaminated with alcohol solution 70% and exposed to UV radiation for 15 minutes. After that, another plate was exposed for two hours, only with the BSC ventilation on. Both plates were incubated at 37C and observed for 30 days. The smears from the isolated colonies were stained with Ziehl Neelsen and Gram techniques, and acid fast bacilli (AFB) were identified by conventional methods. Results: In 38 plates exposed during ST, there was mycobacteria growth in 10 plates (26.3%), fungi in one (2.6%) and bacilli in two (5.3%). Among those plates that presented mycobacteria growth, eight (80%) were identified as M. tuberculosis and two (20%) had inconclusive identification. Even after decontamination with alcohol solution 70% and UV radiation, two plates presented fungi growth (5.3%) and other two presented cocci growth (5.3%). Among 30 plates exposed during IT procedures, there was mycobacteria growth in 10 of them (33.3%), fungi in two (6.6%), cocci in one (3.4%) and one (3.4%) mixed mycobacteria and another bacillus. No growth was observed when alcohol solution 70% and UV radiation were used for decontamination after IT procedures. Conclusion: During the procedures there was aerosol formation with mycobacteria, which was proved by mycobacteria growth on the exposed plates. Not only should adequate laboratory techniques be respected to minimize aerosol formation, but professional expertise, the continuity of capacity programs and periodic BSC maintenance should also be observed.
1. Especialista em Sade Pblica; pesquisadora cientfica do Instituto Adolfo Lutz. 2. Doutora em cincias; pesquisadora cientfica do Instituto Adolfo Lutz. 3. Graduado em Biomedicina; assessor (Projeto Fundo Global TB-Brasil) da Fundao Ataulpho de Paiva. 4. Graduado em Biomedicina; biologista de apoio pesquisa do Instituto Adolfo Lutz. 5. Graduada em Biologia; tcnica de apoio pesquisa do Instituto Adolfo Lutz. 6. Graduada em Biomedicina; aprimoranda do Instituto Adolfo Lutz. 7. Mestra; pesquisadora cientfica do Instituto Adolfo Lutz. 8. Especialista em Sade Pblica; pesquisadora cientfica; encarregada do Setor de Micobactrias do Instituto Adolfo Lutz. Este trabalho foi apresentado no III Encontro Nacional de Tuberculose, realizado entre 18 e 21 de junho de 2008.

key words
Biological safety cabinet Ultraviolet radiation Mycobacteria

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Introduo
A cabine de segurana biolgica (CSB) o principal equipamento de conteno no laboratrio de microbiologia para proteger tanto os funcionrios quanto o material (evitando contaminaes) e o meio ambiente. Dependendo das caractersticas de construo e aplicaes especficas, as cabines so classificadas em trs tipos (classes I, II e III). A CSB classe I oferece proteo ao manipulador e ao meio ambiente, mas no protege o produto a ser manipulado. semelhante exausto de uma capela qumica, porm possui um filtro high efficiency particulated air (HEPA) para proteo do meio ambiente e um fluxo de ar interior com velocidade mnima de 75 ps lineares/minuto(3) para proteo do manipulador. A CSB classe II projetada com um fluxo de ar interior com velocidade de 75 a 100 ps lineares/minuto para proteger os funcionrios; um fluxo de ar laminar vertical para proteger o produto; e um fluxo de ar de sada, de exausto com um sistema de filtrao, para proteger o meio ambiente. Todo esse sistema filtrado pelo HEPA com fluxo de ar sobre toda a superfcie de trabalho (fluxo laminar vertical). A cabine classe II classificada em dois tipos (A e B), com base na construo, na velocidade e nos padres do fluxo de ar dos sistemas de exausto. As cabines do tipo B so subdivididas em tipos B1, B2 e B3 de acordo com o volume de ar que recircula e a exausto(3, 5). A CSB classe III totalmente fechada e ventilada, adequada para o trabalho com agentes perigosos que requerem a conteno de um nvel de biossegurana 4. operada com presso negativa, e o trabalho realizado por meio de braos com luvas de borracha. Todo o sistema controlado por filtros HEPA, e o material utilizado seguido de esterilizao antes de ser descartado para o ambiente(3). Todos esses tipos de CSB devem ter como acessrio uma lmpada ultravioleta (UV). Chamamos de UV a regio do espectro eletromagntico onde o comprimento de onda dos raios luminosos situa-se entre 400 nm e 15 nm. A radiao UV divide-se em trs categorias, UV-A, UV-B e UV-C, de acordo com o comprimento de onda: 400-320 nm (UV-A), 320-280 nm (UV-B) e 280-15 nm (UV-C). A radiao UV-C com comprimento de onda de 254 nm a que possui a maior atividade germicida, letal para bactrias, esporos, vrus, fungos, algas, embora as doses inativantes sejam variveis. A UV-C absorvida por materiais orgnicos, e sua habilidade de penetrao baixa. Por isso, a limpeza das superfcies antes da exposio UV-C necessria(1).

No Brasil ainda no existe uma norma reguladora sobre a construo desses tipos de equipamentos, por isso muitos fabricantes seguem a norma americana(13), que omite qualquer referncia utilizao da luz UV. Segundo normas de biossegurana(7-10), aps utilizao da CSB, a superfcie desta deve ser descontaminada com UV. No presente trabalho destacamos a importncia da limpeza com um agente qumico antes da descontaminao com luz UV. Vrias solues descontaminantes tm sido citadas, mas a efetividade depende da concentrao, do agente infeccioso a ser eliminado e do tempo de ao. So citados os compostos orgnicos (fenis e derivados, hexaclorofeno, lcoois, compostos quaternrios), halognios (iodo, cloro) e perxidos. Para o trabalho com micobactrias, o manual do Ministrio da Sade recomenda o uso de soluo de fenol a 5% e soluo de lcool a 70%(10). Os tcnicos devem ser treinados para o uso adequado das cabines como em qualquer equipamento de laboratrio. Devem evitar procedimentos que possam romper o fluxo de direcionamento do ar para o interior da cabine, que causem a liberao de partculas aerolizadas de dentro para fora devido a movimentos bruscos dentro da mesma; evitar abertura e fechamento das portas do laboratrio e uma caminhada mais vigorosa prxima CSB enquanto esta estiver sendo utilizada. As caractersticas dos ensaios tambm devem ser levadas em considerao: se geram aerossis, exigem rapidez na execuo, necessitam de tcnicas asspticas, utilizam altas concentraes e grandes volumes de materiais de risco, utilizam culturas em meio slido ou em meio lquido. Por isso, quando prticas laboratoriais padro no forem seguidas, podem ocorrer riscos associados a um agente biolgico, em conseqncia de borrifos ou aerossis infecciosos provocados por vrios procedimentos incorretos, levando contaminao dos produtos expostos na cabine, do tcnico e do ambiente(4, 9, 11). Considerando que as caractersticas dos ensaios e os mtodos de descontaminao das CSB podem aumentar ou diminuir os riscos na manipulao de agentes infecciosos, este estudo teve como objetivo: a) verificar evidncias da formao de aerossis durante a manipulao de cepas de micobactrias no laboratrio de biossegurana nvel 3 (NB3) do Setor de Micobactrias do Instituto Adolfo Lutz/So Paulo; e b) avaliar o efeito da descontaminao com soluo de lcool 70% e exposio da rea de trabalho da CSB luz UV durante 15 minutos, aps os procedimentos laboratoriais.

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Materiais e mtodos
O teste de sensibilidade s drogas antituberculose (ANT) e o teste de identificao de micobactrias (TIP) da rotina laboratorial do Setor de Micobactrias so realizados em duas cabines de segurana biolgica (CSB1 e CSB2), instaladas no NB3 do Instituto Adolfo Lutz/So Paulo. Os modelos das cabines utilizadas so da classe II, B2. Dois funcionrios utilizando as duas cabines realizam os procedimentos de ANT e TIP semanalmente, seguindo os procedimentos: 1. ligar a luz UV e a ventilao antes de iniciar as atividades, durante 15 minutos, e desligar a luz UV aps esse perodo; 2. preparar suspenses bacterianas em frascos com prolas de vidro com 1 ml de gua destilada estril, utilizando um suabe; 3. preparar suspenses bacterianas em Eppendorf com miangas de vidro e 0,5 ml de meio de Sauton com 10% de glicerol, utilizando uma ala descartvel; 4. acertar a concentrao das suspenses bacterianas, comparando com a turvao n 1 da escala de McFarland, utilizando uma pipeta Pasteur; 5. preparar suspenses bacterianas em Eppendorfs para a extrao do DNA, utilizando uma ala descartvel; 6. semear suspenses bacterianas nos diversos meios com drogas, utilizando pipetas e ponteiras descartveis. O estudo foi realizado do mesmo modo nas duas CSBs, durante os procedimentos de 38 ANT (nos quais foram manipuladas 789 cepas) e 30 TIP (manipuladas 344 cepas). Uma placa contendo meio de Middlebrook 7H10 foi colocada dentro da CSB. A placa foi exposta com a tampa aberta e deixada durante todo o procedimento dos testes (duas a trs horas) sobre a superfcie da cabine, na parte central da mesma. Depois desse perodo, a placa foi fechada, lacrada com fita adesiva e incubada a 37C. Aps o trmino dos testes, realizaram-se limpeza e descontaminao da rea de trabalho da cabine com soluo de lcool 70% e exposio luz UV durante 15 minutos. Outra placa foi colocada na CSB e mantida por aproximadamente duas horas, com a UV desligada, mas mantendo a ventilao. Em seguida, a placa foi fechada, lacrada com fita adesiva e incubada a 37C. As leituras foram realizadas aps o stimo, o 15 e o 30 dia, para observar o aparecimento de colnias. Foram feitos esfregaos das colnias formadas em duas lminas. Uma delas foi corada pela tcnica de Ziehl Neelsen; a outra, pela tcnica de Gram. As colnias cujos esfregaos confirmaram presena de bacilo lcool-cido-resistente (BAAR) foram

subcultivadas em meio de Lowenstein-Jensen e submetidas identificao de espcie. A presena de fungos e outras bactrias foi detectada somente por microscopia.

Resultados
Entre as 38 placas expostas nas duas cabines durante o processamento dos ANT, houve crescimento de micobactrias em 10 placas (26,3%), fungos (2,6%) em uma e outros bacilos (5,3%) em duas. Nas 25 (65,8%) restantes, no houve crescimento. Das placas com micobactrias, oito (80%) foram identificadas como Mycobacterium tuberculosis e duas (20%) no tiveram a identificao concluda, pois no cresceram no subcultivo no meio de Lowenstein-Jensen, mas apresentaram caractersticas macroscpicas de M. tuberculosis, pela observao morfolgica das colnias e pela presena de fator corda no esfregao. No foram identificadas outras espcies de micobactrias. Entre as 38 placas expostas aps limpeza e descontaminao com lcool a 70% e exposio da superfcie de trabalho com UV durante 15 minutos, aps realizao dos ANT, houve crescimento de fungos em duas (5,3%) e cocos em outras duas (5,3%). Nas 34 (89,4%) restantes, no houve crescimento. Entre as 30 placas colocadas nas duas cabines durante a realizao da TIP, houve crescimento de micobactrias em 10 placas (33,3%), fungos em duas (6,6%), cocos em uma (3,4%) e com mistura de micobactrias e outro bacilo Gram negativo em uma (3,4%). Nas 16 placas (53,3%) restantes no houve crescimento. Nas placas onde cresceram micobactrias (Figura 1), uma placa apresentou dois tipos de colnias, sendo uma identificada

Figura 1 Placa de Middlebrook 7H10 com crescimento de micobactrias, exposta durante os procedimentos de TIP

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Tabela 1 Teste
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Total

Testes com as placas colocadas durante os procedimentos de ANT e aps descontaminao com lcool a 70% e exposio luz UV N cepas Durante o teste Aps descontaminao CSB1 CSB2 CSB1 CSB2
73 40 40 40 40 40 40 40 40 40 37 40 39 40 40 40 40 40 40 789 NC NC NC NC M. tuberculosis NC NC NC NC NC NC NC NC Fungo NC NC BAAR Outros bacilos NC NC NC NC M. tuberculosis NC M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis NC M. tuberculosis NC NC BAAR NC Outros bacilos NC NC NC NC Fungo NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC Fungo NC NC NC NC NC Cocos NC NC NC NC NC NC Cocos NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC

CSB: cabine de segurana biolgica; ANT: teste de sensibilidade s drogas; BAAR: bacilo lcool-cido-resistente; NC: no houve crescimento de microrganismo.

como Mycobacterium kansasii e a outra apenas como micobactria no-tuberculosa (MNT), pelas caractersticas morfolgicas e pela microscopia. As outras espcies identificadas foram Mycobacterium avium, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium terrae, complexo Mycobacterium avium (MAC), micobactria de crescimento rpido acromgena (CRA), micobactria de crescimento lento escotocromgena (CLE) e M. tuberculosis (Tabela 2). Aps limpeza e descontaminao com lcool a 70% e UV durante 15 minutos (Figura 2) seguintes ao processamento da TIP, no houve crescimento. O nmero de colnias de micobactrias que cresceram variou de um a 16 por placa, entre os dois procedimentos.

No caso de fungos houve crescimento espalhado; cocos e outro bacilo apresentaram uma a duas colnias.

Figura 2 Tcnico realizando o procedimento de ANT (A) e procedimento de limpeza com lcool a 70% aps o trmino das atividades (B)

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Tabela 2 Teste
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Total

Testes com as placas colocadas durante os procedimentos da TIP e aps descontaminao com lcool a 70% e exposio luz UV N cepas Durante o teste Aps descontaminao CSB1 CSB2 CSB1 CSB2
15 14 14 27 14 39 15 10 20 31 28 30 29 29 29 344 M. avium NC CLA NC MAC NC NC MAC Fungo CRA Fungo M. terrae NC MAC Cocos M. kansasii e MNT M. abscessus NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC M. avium e outros bacilos M. tuberculosis NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC

CSB: cabine de segurana biolgica; NC: no houve crescimento de microrganismo; TIP: teste de identificao; CLA: micobactria de crescimento lento acromgena; CRA: micobactria de crescimento rpido acromgena; MAC: complexo M. avium; MNT: micobactria no-tuberculosa.

Discusso
A conteno primria uma estratgia importante para minimizar a exposio a riscos qumicos e biolgicos encontrados no laboratrio. Como parte dessa conteno, as CSBs so essenciais no trabalho seguro de agentes infecciosos. No entanto a manipulao e a manuteno corretas so fundamentais para assegurar o trabalho seguro e a preveno de infeces aos manipuladores. O presente trabalho demonstrou que durante os procedimentos de inoculao dos organismos para os diferentes testes (ANT e TIP) ocorreu, dentro da cabine, formao de aerossis contendo micobactrias. Esse fato ficou comprovado pelo crescimento de colnias de micobactrias nas placas durante a realizao dos testes. Na realizao do ANT, no qual as cepas manipuladas foram todas pertencentes ao complexo M. tuberculosis, segundo triagem realizada observando-se a presena de fator corda e caractersticas fenotpicas da cultura, as co-

lnias que cresceram nas placas expostas tambm foram todas identificadas como M. tuberculosis, indicando que o organismo manipulado ficou circulante dentro da CSB. Durante a realizao da TIP, na qual as cepas manipuladas so na grande maioria de MNT, segundo os critrios acima, as placas apresentaram crescimento de MNT. Estas foram identificadas como M. avium, M. kansasii, M. abscessus, MAC, CRA e CLA. A contaminao de uma nica placa por M. tuberculosis durante a realizao da TIP pode ser justificada, pois cerca de 4% a 5% das cepas para identificao so de M. tuberculosis. O nmero de placas contaminadas por M. tuberculosis (26,3%), durante a realizao do ANT, quando foram manipuladas 789 cepas dessa espcie, sugere que foram realizados procedimentos adequados dentro da cabine, promovendo a minimizao de gerao de aerossis. O mesmo aconteceu com as placas colocadas nas cabines durante a realizao da TIP. A manipulao de 344 cepas com contaminao de 10 placas com MNT pode justificar esses procedimentos. Caso esses procedimentos tivessem

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sido realizados de maneira inadequada, a recuperao desses agentes seria muito superior ao obtido. A preparao das suspenses bacterianas, o descarte dos suabes e das pipetas, podem ser as principais causas da formao de aerossis na manipulao das cepas. A retirada da massa bacilar do meio de Lowenstein-Jensen com auxlio do suabe e a homogeneizao com movimentos rotatrios devem ser realizadas com muito cuidado para evitar a formao de aerossis e o derramamento da suspenso dentro da CSB. O descarte dos materiais nos recipientes com sacos plsticos descartveis deixados dentro da CSB tambm deve seguir os mesmos critrios. Macher et al.(6) estudaram o nvel de conteno das CSB durante procedimentos e observaram que os organismos ficam aerolisados no fluxo de ar dentro da CSB. O grande problema que esses aerossis podem sair da CSB dependendo da movimentao do manipulador, do local onde o manipulador est trabalhando, do fluxo de ar externo e do tamanho da abertura da CSB, ocasionando risco para o manipulador e para o ambiente. A insero e a retirada repetida dos braos dos manipuladores para dentro e para fora das cabines, a abertura e o fechamento das portas do laboratrio, a colocao ou a operao imprpria dos materiais ou dos equipamentos dentro da cabine so fatores de risco que podero levar a uma contaminao cruzada e, conseqentemente, a um falso resultado(3, 6, 14). Pelos resultados obtidos, a descontaminao das CSB com lcool a 70% e UV aps realizao dos procedimentos foi efetiva, pois houve crescimento de apenas uma ou duas colnias de fungos e outros microrganismos, no havendo crescimento de micobactrias. A observao concordante com um estudo desse grupo, no qual a UV foi efetiva na morte de micobactrias expostas diretamente por no mnimo cinco minutos(15), mas vai de encontro a algumas publicaes que no recomendam o uso da UV

para descontaminao(2, 7). Esses trabalhos baseiam-se no fato de que a ao da UV limitada por diversos fatores, tornando-se no-apropriada para descontaminao como nico mtodo de escolha. As limitaes de fato existem, porm se alguns cuidados forem tomados, o uso da UV pode ser um grande aliado do manipulador de CSB. O manipulador deve sempre lembrar que: a) a luz UV um mtodo secundrio de descontaminao e deve ser usada em conjunto com outro mtodo; b) a luz UV no penetra em materiais, agindo somente na superfcie; c) a intensidade da lmpada de UV afetada pelo acmulo de sujidades em sua superfcie e pela distncia da superfcie a ser descontaminada; d) a lmpada de UV no deve ser tocada com as mos nuas, pois o leo natural da pele pode criar uma barreira para a luz; e) a luz deve estar desligada enquanto o manipulador estiver trabalhando dentro da CSB; f) o tempo de utilizao da lmpada deve ser registrado para controle da vida til da mesma(12). Alm dos cuidados citados, muito importante a manuteno peridica da CSB, realizando-se a troca dos filtros HEPA e verificando-se a velocidade do fluxo de ar, a direo do fluxo, a contagem do nmero de partculas e o nvel de estanqueidade da CSB. A manuteno da lmpada de UV, alm das recomendaes citadas, pode ser feita medindo o comprimento de onda que a luz est emitindo.

Concluso
Este estudo demonstrou a produo de aerossis dentro da CSB durante os procedimentos e a eficincia da descontaminao com soluo de lcool a 70% e luz UV aps o processamento das amostras, salientando que a utilizao das boas prticas fundamental na minimizao de riscos.

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Endereo para correspondncia Suely Yoko Mizuka Ueki Instituto Adolfo Lutz Seo de Bacteriologia/Setor de Micobactrias Av. Dr. Arnaldo, 351 9 andar Cerqueira Csar CEP 01246-902 So Paulo-SP e-mail: satie@osite.com.br

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