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ENGENHARIA GENTICA Modificar genes escolhidos, substituindo-os por fragmentos de material gentico externo ou inativando-os para que as protenas

deles derivadas no sejam produzidas, hoje uma das estratgias mais promissoras da pesquisa biolgica. Os animais, em especial camundongos, em que essas mutaes so induzidas permitem estudos que podem revolucionar o tratamento de doenas humanas e abrem caminho para outros avanos, como os transplantes entre espcies diferentes e a produo de animais ou vegetais mais adequados para consumo e de crescimento mais rpido Antonio Jos Oliveira-dos-Santos Amgen Institute, Ontario Cancer Institute eDepartment of Immunology, University of Toronto (Canada) ENGENHARIA GENTICA Modificar genes escolhidos, substituindo-os por fragmentos de material gentico externo ou inativando-os para que as protenas deles derivadas no sejam produzidas, hoje uma das estratgias mais promissoras da pesquisa biolgica. Os animais, em especial camundongos, em que essas mutaes so induzidas permitem estudos que podem revolucionar o tratamento de doenas humanas e abrem caminho para outros avanos, como os transplantes entre espcies diferentes e a produo de animais ou vegetais mais adequados para consumo e de crescimento mais rpido

Antonio Jos Oliveira-dos-Santos Amgen Institute, Ontario Cancer Institute eDepartment of Immunology, University of Toronto (Canada) Animais tran solues para mu Animais tran O objetivo das cincias biolgicas, desde seus primrdios, entender como funcionam os seres vivos, sejam unicelulares como as bactrias ou multicelulares como ns mes mos. Para isso, usamos o mtodo cientfico: estuda mos partes isoladas de um dado sistema (variveis) e tentamos deduzir suas possveis funes no siste ma como um todo. Essa metodologia, apesar de suas limitaes no estudo de sistemas complexos, como os biolgicos, foi responsvel pela revoluo cientfica. Nas cincias biomdicas, em um primeiro mo mento, buscava-se compreender a funo de deter minado tecido ou rgo, removendo-o ou inativan do-o em animais de experimentao e observando as alteraes que o organismo sofria. Demonstrouse assim, por exemplo, o papel do pncreas na regulao do nvel de glicose no sangue atravs da produo de insulina, cuja deficincia caracteriza o diabetes mellitus. Quando o cdigo gentico foi decifrado, ficou claro que o DNA de cada clula um banco de

sgnicos e nocautesENGENHARIA GENTICA uitos enigmas nsgnicos e nocautes sgnicos e nocautesENGENHARIA GENTICA uitos enigmas nsgnicos e nocautes dados bioqumico: ele armazena a informao ge ntica e permite seu uso e sua transmisso prole. O DNA (cido desoxirribonuclico) composto por quatro subunidades (.bases nucleotdicas.) enca deadas em duas longas seqncias (fitas), unidas por interaes qumicas entre bases situadas em fi tas opostas (figura 1). As interaes qumicas entre fitas opostas for mam sempre os mesmos pares de bases nucleot dicas (figura 2). Se cada base for tomada como uma letra, a combinao de trs bases em uma das fitas corresponde a uma palavra (.cdon.), e cada gene pode ser visto como uma frase do cdigo gentico. O genoma humano . conjunto de genes presentes no ncleo de cada uma de nossas clulas . corres ponde a um banco de dados com cerca de trs bi lhes de bases (ou letras). A informao contida em cada gene reproduzida (.transcrio.) em cadeias intermedirias de nu cleotdeos (RNA), que funcionam como .moldes. para a sntese de protenas (.traduo.). As proteFigura 1. Parte da estrutura de fita dupla de DNA (vista lateralmente), com os tomos que formam a molcula representados por pequenas esferas janeiro/fevereiro de 1999 CINCIA HOJE 17

ENGENHARIA GENTICA ENGENHARIA GENTICA Figura 2. As bases nucleotdicas de fitas opostas de DNA unem-se sempre formando os mesmos pares: adenina com timina e citosina com guanina nas tambm so compostas pelo encadeamento de subunidades (aminocidos), e cada cdon em um gene corresponde a um aminocido em uma prote na. H portanto uma equivalncia: um gene uma protena. Esse fato fez as cincias biomdicas mudarem seu foco inicial (rgos, tecidos e clulas) para as protenas. No entanto, avaliar a funo de prote nas em mamferos vivos sempre foi um desafio. A descoberta de drogas que ativam ou inibem prote nas permitiu desvendar a funo de algumas, e a identificao de pessoas com doenas genticas (alteraes na seqncia de bases do DNA) tornou possvel entender como a ausncia ou disfuno de certas protenas afeta o organismo como um todo. Por analogia, animais com doenas genticas simi lares s humanas tornaram-se modelos valiosos no estudo de tais enfermidades e na busca de novos tratamentos. O surgimento de uma tecnologia O aprimoramento e a automao de tcnicas de biologia molecular vm permitindo identificar e seqenciar (.ler. a ordem das bases) um nmero crescente de genes e protenas, em velocidade ini maginvel h poucos anos. A seqncia completa do DNA da nossa espcie deve ser conhecida . pelo projeto Genoma Humano . na primeira dcada do sculo 21. Decifrar um gene, porm, apenas o primeiro passo. Compreender a funo de uma protena tarefa muito mais longa e complexa. Uma alternativa para isso seria induzir uma alterao (.mutao.) em uma base ou um cdon de um gene, alterando assim a protena equivalente. Isso permitiria obter animais geneticamente modi ficados, permitindo estudar os efeitos das muta es (ausncia ou disfuno de uma protena) so bre a fisiologia do organismo. O mtodo tradicional para estudar a funo de um gene baseado na identificao de variedades

(.alelos.) desse gene entre indivduos de uma esp cie. Na maioria das vezes, isso significa traba lhar com grande nmero de indivduos. No caso de seres unicelulares, como bactrias e fungos, poss vel estudar no s variedades naturais como muta es induzidas por drogas (.mutagnese qumica.), que danificam um ou mais genes, dependendo da droga e da dose. Em grandes populaes de bact rias, possvel selecionar as que tm mutaes em um gene especfico e mant-las em cultura, criando uma linhagem mutante para o estudo desse gene. Estratgia semelhante usada com seres multi celulares, como Caenorhabditis elegans, verme mi nsculo do solo, ou Drosophila melanogaster, a mosca-das-frutas. No entanto, mesmo em animais simples, o estudo gentico atravs de mutagnese qumica apresenta dificuldades crescentes, come ando pelo tamanho dos genomas. A bactria Es cherichia coli contm trs mil genes, enquanto a mosca-das-frutas tem cerca de 20 mil e o camundon go carrega um conjunto estimado em 200 mil genes. Outro problema o trabalho com grandes popu laes: quanto maior o genoma, maior a populao necessria. O exame de um bilho de bactrias relativamente simples, mas isso impensvel com moscas. Nesse caso, 100 mil indivduos j um grande experimento. Com camundongos, tal limite estaria em torno de mil indivduos. Alm disso, a maioria dos seres multicelulares herda duas cpias de cada gene, um alelo de cada progenitor, e a mutao de apenas um desses alelos no altera muito o organismo. Assim, preciso um longo e caro trabalho de cruzamento e seleo de descen dentes at obter indivduos com dois alelos mutantes. Camundongos esto separados dos homens por milhes de anos de evoluo, mas estima-se que 99% dos seus genes sejam similares e exeram a mesma funo. Por isso, experimentos de manipu lao gentica em camundongos permitem estudar in vivo genes humanos . hoje identificados em ritmo acelerado . cuja funo ainda desconhecida em nosso organismo. Assim, induzir a mutao especfica de um gene em camundongos nos daria uma chance rara de estudar seus efeitos. Embora a idia fosse bastante atrativa, foi neces srio superar vrios obstculos tcnicos . tarefa a 18 CINCIA HOJE vol. 25 n 146

ENGENHARIA GENTICA que vrios grupos de geneticistas, embriologistas, bioqumicos e bilogos moleculares se dedicaram a partir dos anos 70 (figura 3) . antes de torn-la realidade. Hoje possvel alterar de modo especfi co o DNA de camundongos, plantas e, recentemen te, bovinos. Este artigo discute os principais passos no desenvolvimento de animais transgnicos e no cautes, os tipos de organismos geneticamente mo dificados e o impacto dessa tecnologia em diversas atividades humanas. Mas o que so animais transgnicos e nocau tes? Em resumo, um transgene um fragmento de DNA, em geral a seqncia completa de um gene, artificialmente introduzido no genoma de outro organismo, enquanto nocautear um gene provo car nele uma mutao especfica, que leva sua inativao. A expresso artificial de um gene Em espcies de reproduo sexuada, a obteno de linhagens com alteraes genticas depende da in duo de mutaes em clulas sexuais (.gametas.), para que sejam transmitidas prole. relativamen te simples obter mutaes aleatrias em clulas somticas (j diferenciadas) de mamferos mantidas em cultura, mas o grande obstculo obter muta es especficas em clulas sexuais de um animal vivo. O embrio de um camundongo desenvolve-se a partir da fecundao do vulo por um espermato zide, no oviduto da fmea. Segue-se a formao do ovo, que passa por sucessivas divises celulares at tornar-se detectaram, nos filhotes gerados, DNA estranho (de vrus, por exemplo) injetado em blastocistos de camundongos. Conceitualmente, nascia o primeiro camundongo transgnico. Logo aps, infectaram embries com um retrovrus de rato e mostraram que seqncias do DNA viral integravam-se de modo estvel ao genoma do animal. Alm disso, os filhotes transgnicos transmitiram tais seqncias s suas futuras proles, revelando que clulas em brionrias infectadas de modo aleatrio podiam gerar clulas sexuais tambm transgnicas. Mas ainda era um desafio introduzir em animais um gene especfico, em vez de uma seqncia viral sem funo. A soluo foi obtida em 1980 por Jon W. Gordon e colegas. Seu mtodo (figura 4), to eficiente que continua em uso, emprega embries ainda no est gio de uma clula, quando se pode identificar o grande pr-ncleo. Com agulhas de vidro micros

cpicas, operadas por equipamentos ultra-sens veis, injetam-se vrias cpias da seqncia de DNA (transgene) que se quer integrar ao genoma. J no ano seguinte diversos grupos produziram camun dongos contendo transgenes funcionais, que ex pressavam as protenas associadas em clulas es pecficas. Para obter um organismo transgnico, primeiro o gene de interesse identificado e isolado (.clo nagem gnica.). Depois preciso montar o transge ne, porque nem todo gene expresso (levando a clula a produzir protena) em todos os tecidos. S os glbulos vermelhos do sangue, por exemplo, expressam a hemoglobina, protena que transporta Figura 3. Evoluo tecnolgica rumo a camundongos transgnicos e nocautes

.blastocisto. (ou .blstula.), est-ANO AVANO AUTORES gio em que as clulas embrion1968 Camundongos quimricos via injeo de Gardner rias dispem-se em torno de uma clulas embrionrias em blastocistos cavidade cheia de lquido (seme lhante a um cisto). J em 1968, 1974 Injeo de DNA viral em blastocistos de camundongos e sua deteco em filhotes Jaenisch e Mintz Richard L. Gardner havia isolado clulas de um embrio de camun dongo (embrio A) e injetado em blastocistos (embrio B). Implan 1975 1976 Embries infectados com retrovrus tm seqncias de DNA viral integrado ao genoma Transmisso hereditria de um transgene Jaenisch e colegas Jaenisch tados no tero de fmeas prenhas, 1980 Injeo de DNA viral em embries no estgio Gordon e colegas estes geraram camundongos com de uma clula, gerando animais transgnicos clulas vindas dos dois embries 1981 Integrao e expresso de transgenes Brinster e cole gas; (.quimeras.). Usando progenito-Constantini e Lacy res com alelos diferentes para 1981 Obteno de clulas embrinicas Evans e Kaufman; Mar tin certo gene (.marcador gentico.), totipotentes (clulas ES) foi possvel distinguir no filhote as clulas vindas do embrio A 1986 Camundongos quimricos obtidos a partir de clulas ES Gossler e colegas (injetadas) e as originadas do em brio B (blastocisto). 1987 Recombinao homloga em clulas ES Thomas e Capecchi

Em meados dos anos 70, Ru dolf Jaenisch e Beatrice Mintz 1989 Obteno de camundongos nocautes Schwartzberg e colegas; Thompson e colegas janeiro/fevereiro d e 1 9 9 9 CINCIA HOJE 19

ENGENHARIA GENTICA 1. Cpias do gene Tg (hipottico), previamente clonado, so transformadas em vetor transgene em laboratrio. Isso feito preparando uma seqncia desse gene apenas com seus exons (regies que codificam partes da protena so de qualquer transgene na pe le. Esse o truque usado para dirigir a expresso de um trans em estudo), e ligando um promotor a uma das extremidades, para garantir a expresso do gene Tg somente em um tipo de tecido. gene para determinadas clulas de um camundongo. Preparado o conjunto promo tor-transgene, o passo seguinte injet-lo em pr-ncleos de em bries. Estes so transferidos para o tero de fmeas receptivas (em estado de falsa-prenhez, induzi 2. O vetor transgene injetado em embries no estgio de uma clula, do pelo cruzamento com machos vasectomizados). Os filhotes nasobtidos de fmeas cem em 20 dias, mas ainda ne de camundongos recm-fecundadas. cessrio examinar o DNA para confirmar se tm o transgene e selecionar os positivos (.transg nicos.). Por ltimo, a protena associada ao transgene identi ficada nos filhotes e seu nvel de expresso medido em clulas especficas. Uma linhagem de camundon gos transgnicos com freqn cia uma ferramenta poderosa para o estudo in vivo de proces sos biolgicos. Podem-se repro duzir doenas humanas (cncer, diabetes, imunodeficincias e outras) ou alterar vias metabli cas especficas e avaliar em deta lhe a atuao celular. Esses ani 3. Uma vez no ncleo, o fragmento Tg 4. Embries com Tg integrado ao genoma so implan tados mais permitiram grandes avanos de DNA localizado pela maquinaria celular e integrado aleatoriamente em um dos cromossomos. em fmeas receptivas (prenhez induzida). A gestao gera camundongos transgnicos, que permitem estudar as funes da protena correspondente ao gene Tg. em reas como imunologia, neu rologia, biologia celular e outras. Na imunologia, ajudaram a esclarecer a formao e a atua-

Figura 4. o oxignio aos tecidos. Alm disso, a expresso dos o dos linfcitos, uma das c las de defesa do O desenvolvimento genes em cada clula varia de acordo com o estado organismo. A reao dos linfcitos con tra as infec de camungondos funcional da mesma. es ocorre quando receptores situados em sua transgnicos Mas como montar um transgene? A expresso superfcie reconhecem .antgenos. . protenas ou gnica depende de uma intricada rede de controle, fragmentos do .invasor. (bactria, vrus ou parasi baseada, entre outras coisas, no reconhecimento de ta). Em geral, cada linfcito e xpressa um receptor seqncias de DNA denominadas .promotores.. A diferente, o que permite identificar v ariados agen presena de certo promotor junto a um gene dirige tes infecciosos. Essencial ao si stema de defesa, essa sua expresso para determinado tipo de clula. multiplicidade de receptores um obstcu lo ao Como os promotores no codificam protenas, so estudo dos linfcitos. O problema foi su perado por alvos preferenciais para manipulao. camundongos com um transgene de receptor an-

possvel usar .enzimas de restrio. para cortar tignico. A expresso artificial desse r ceptor im o DNA em locais especficos (.stios de restrio.), pede a dos demais. Os linfcitos do a nimal modi definidos por seqncias de bases que cada enzima ficado s tm um tipo de receptor, sit uao ideal reconhece, e tambm .emendar. fragmentos de DNA para a pesquisa. com outras enzimas. Isso levou idia de ligar um Embora seja um grande avano tecnolg ico, a promotor de funo bem conhecida a um transgene. gerao de animais transgnicos tem limit aes. Em tese, um promotor que coordene a expresso do Por ser aleatria, a integrao do tran sgene ao DNA gene de uma protena da pele pode induzir a expres-pode resultar na mutao de outro g ene (e no do 20 CINCIA HOJE vol. 25 n 146

ENGENHARIA GENTICA gene-alvo). Tambm h variaes no nmero de cpias integradas e no nvel de expresso do trans gene, ou seja, na quantidade produzida da protena correspondente. Alm disso, como o gene-alvo con tinua intacto, no se sabe a priori como sua expres so ser afetada pelo transgene. Isso exige a gerao de vrias linhagens independentes de animais com o mesmo transgene, para comparar o efeito no or ganismo de diferentes doses da protena em estudo. Como nocautear um gene Enquanto os primeiros camundongos transgnicos eram desenvolvidos, outros pesquisadores isolaram clulas embrionrias capazes de gerar qualquer tipo de tecido em um embrio . as clulas ES (do ingls embrionic stem cell). Em cultura, tais clulas multi plicam-se indefinidamente, mas sua injeo em blas tocistos d origem a quimeras, permitindo a trans misso para o organismo de mutaes aleatrias induzidas no perodo de cultura ou de transgenes introduzidos nas clulas ES. Assim, em meados dos anos 80 o desafio da mutagnese induzida e espe cfica de um s gene permanecia de p. O ideal seria poder escolher um gene e mut-lo, eliminando algumas bases nucleotdeas para que o camundongo no produzisse a protena associada. Mas como fazer isso? Estudando a integrao de transgenes ao genoma de clulas de mamferos mantidas em cultura, Mario Capecchi observou que, ao injetar cpias de um mesmo vetor transgene (VT) em um ncleo celular, vrias delas eram liga das entre si, em cadeia (VT-VT-VT...), com as se qncias de bases sempre na mesma orientao. Aparentemente, a clula dispunha de um mecanis mo para organizar mais de uma cpia desse vetor em uma certa ordem antes da sua integrao aleat ria. Com base nessas evidncias, o grupo de Capecchi investigou e descreveu o processo, bati zado de .recombinao homloga., mostrando que podia ser usado para induzir mutaes especficas em clulas ES em cultura. Em geral, a recombinao homloga envolve seqncias de DNA virtualmente idnticas: o vetor nocaute injetado tem suas extremidades alinhadas a regies semelhantes no DNA do ncleo, as quais so cortadas, e em seguida acontece a .troca. dos pedaos, com a religao das extremidades. O reco nhecimento dessas extremidades to preciso que nenhuma alterao ocorre na seqncia das bases nucleotdicas nos stios de ligao. Sabendo disso, o passo seguinte seria mutar um gene especfico e obter animais contendo essa mutao. Essa con quista . a gerao dos primeiros camundongos

nocautes . foi tornada pblica em 1989. Figura 5. 1. Cpias do gene KO (hipottico), previamente clonado,

so transformadas em vetor nocaute em laboratrio. Para isso, Mutao usa-se enzimas de r strio e a bactria E. coli, substituindo-se dirigida parte do gene-alvo (os exons 2 e 3) pelo gene neor, que confere resistncia droga neomicina, e adicionando-se de um gene a uma extremidade do fragmento o gene tk, que confere sensibilidade droga ganciclovir. 2. Clulas ES previamente obtidas de embries no estgio de blastocisto e mantidas em cultura so incubadas com o vetor nocaute e submetidas a eletroporao (rpido choque eltrico que as faz captar fragmentos de DNA). Em seguida, as clulas so novamente colocadas em cultura. 3b. Em muitas clulas, o vetor integra-se de modo aleatrio a um cromossomo, sem substituir o gene-alvo. Nesse caso as clulas sobrevivem neomicina (porque tm o marcador neor), mas morrem quando aplicada o ganciclovir (porque tambm tm o marcador tk). J as clulas que no sofreram mutao so mortas pela neomicina (no tm o marcador neor). 5. Com agulhas especiais as clulas KO so injetadas em blastocistos (de camundongos pretos) e estes enxertados em fmeas pseudoprenhas. A gestao d origem a animais quimricos, formados por clulas derivadas tanto do blastocisto quando das clulas KO. 3a. No ncleo, a maquinaria celular localiza o vetor nocaute. Se houver o alinhamento correto entre vetor e gene-alvo, acontece a recombinao homloga . Com isso, parte do gene-alvo substituda pelo marcador gentico

neor (que confere resistncia droga neomicina). Nesse caso o marcador tk, exterior s regies comuns do vetor e do gene-alvo, no ser integrado ao genoma da clula, que assim continua insensvel ao ganciclovir. As clulas ES nocautes , que tm o gene-alvo mutado e so resistentes neomicina, sobrevivero se essa droga 3c. Assim, aps a aplicao das duas drogas restaro na cultura apenas as clulas em que houve a recombinao homloga desejada (alterao do genealvo). 4. A mutao dirigida do gene-alvo confirmada pela anlise de uma amostra do DNA das clulas KO, que agora carregam um alelo mutante e no-funcional, alm do alelo selvagem. janeiro/fevereiro de 1999 CINCIA HOJE

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1. Camundongos 3. O cruzamento de camundongos com quimeras obtidos pela um alelo mutante permite obter alguns tcnica de mutao filhotes normais (WT-WT), alguns dirigida de um gene so heterozigotos (WT-KO) e alguns cruzados com animais de nocautes, com dois alelos mutantes (KOplo preto (no-agouti). KO). Nos ltimos, o gene-alvo no expresso, permitindo o estudo dos efeitos no organismo da mutao KO. Figura 6. Obteno de camundongos nocautes 2. A prole ter camundongos tanto pretos quanto marrons. Os marrons tm o gene agouti, herdado do gameta da quimera derivada das clulas ES mutadas. A anlise do DNA revela quais deles tm um alelo mutante (KO) do gene-alvo (WT). Como nos animais transgnicos, a deteco e o seqenciamento do gene de interesse o passo inicial (figura 5). Em seguida, altera-se em laborat rio a seqncia de uma regio desse gene, manten do intactas as extremidades (stios de reconheci mento, corte e ligao). O fragmento alterado de DNA o vetor a ser usado na mutao dirigida. Injetado no ncleo de clulas ES, o vetor forma um complexo com as protenas nucleares respon sveis pela recombinao homloga. Esse comple xo percorre todo o genoma da clula at achar uma .seqncia-alvo. similar ao vetor. Mas a etapa final do processo (recombinao homloga, ou seja, ali nhamento e troca) s acontece em uma taxa muito baixa: uma em cada milho de clulas. Alm de no se integrar, o vetor pode ainda se integrar aleatoria mente, como um transgene comum, sem reconhe cer a seqncia-alvo. Como, ento, identificar as clulas com as mutaes corretas? A soluo foi o uso de marcadores genticos que permitem selecionar as clulas em que houve re combinao. O marcador, em geral um gene que confere resistncia ao antibitico neomicina (neor), inserido no vetor a ser injetado em clulas ES. Aps a multiplicao celular, aplica-se neomicina na cultura. A grande maioria das clulas, nas quais no houve integrao do vetor (aleatria ou por recombi nao homloga), continua sen svel droga e morre. Mas as que adquiriram o vetor e expressam o gene neor so resistentes dro ga e permanecem vivas (seleo positiva). Tambm se pode ligar a uma

extremidade do vetor outro mar cador, como o gene da timidina quinase (tk), enzima do vrus da herpes. Quando ocorre a recom binao homloga, o gene tk no se integra ao DNA celular, por estar fora da seqncia similar que orienta o alinhamento entre o vetor e seu alvo. Mas se a inte grao aleatria as clulas rece bem o vetor inteiro. Nesse caso, a aplicao da droga ganciclovir mortal para clulas que expres sam o gene tk (seleo negativa). Com os dois marcadores (neor e tk), possvel selecionar clu las que em sua maioria apresentam a recombinao homloga desejada. Obtm-se, assim, a mutao especfica e controlada do gene escolhido, confir mada pela anlise de uma amostra do DNA das clulas. Tais clulas ES mutantes podem ser transferidas para blastocistos, visando a gerao de camundongos quimricos. Camundongos com clulas ES mutantes so fa cilmente identificados pela cor do plo. Isso por que tais clulas so obtidas de camundongos de plo marrom (com duas cpias do gene agouti), enquanto os blastocistos vm de fmeas de camun dongos de plo preto (com duas cpias defeituosas desse gene). Assim, quando as clulas ES injetadas em blastocistos geram embries normais, nascem camundongos quimricos, com diferentes propor es de plos claros por causa do gene agouti . mesmo uma s cpia desse gene leva deposio de pigmento amarelo, alm do preto, nos plos. Essas quimeras, acasaladas com camundongos pretos normais, geram filhotes tanto pretos quanto marrons (figura 6) . os ltimos tm uma cpia do gene agouti, que s pode vir de gametas das quime ras derivadas das clulas ES mutantes. A anlise do DNA dos animais marrons identifica os que tm no genoma a mutao especfica induzida nas clulas ES em cultura. Os animais heterozigotos (com uma cpia mutante e outra selvagem de um gene) so 22 CINCIA HOJE vol. 25 n 146

ENGENHARIA GENTICA em geral sadios, pois uma cpia selvagem do gene em estudo suficiente para o funcionamento do organismo. O cruzamento desses camundongos heterozigo tos permitir obter alguns filhotes com duas cpias mutantes do gene (homozigotos), que no expres saro a protena associada ao gene nocauteado. Anormalidades funcionais e/ou anatmicas nesses animais revelam em que funes orgnicas o gene nocauteado est envolvido. Hoje, o nmero de genes nocauteados em camundongos aproxima-se de mil, e cresce continuamente. A tcnica, alm de ajudar a entender processos fisiolgicos, abre um caminho para investigar doenas humanas que ainda no tinham modelos animais. Na oncologia, os camundongos mutantes garanti ram grandes avanos no estudo de genes supresso res de tumores . genes cuja inativao contribui para o surgimento ou a progresso de tumores. Na ltima dcada, mutaes de grande nmero de genes foram associadas a tumores humanos, embo ra muitas vezes ainda no se conheam as funes das protenas correspondentes a tais genes. A mu tao do supressor tumoral p53, por exemplo, ocor re em diversos cnceres humanos. O estudo de ca mundongos nocautes com mutaes do gene p53 mostrou que ele atua como um mecanismo de segurana, evitando que defeitos no DNA (que podem levar a crescimento anormal e cncer) se jam transmitidos durante a duplicao das clulas. Portanto, p53 protege o organismo contra muta es perigosas, muitas causadas por agentes am bientais, como radiao e toxinas presentes em alimentos ou drogas (o tabaco, por exemplo). REA Como era de se esperar, mutar um gene especfico no resolve presso de um gene apresenta gradaes: o nvel de uma dada protena presente em uma clula varia em funo do seu estado funcional. Em alguns casos, silenciar um gene em um momento espec fico da vida do camundongo, de forma gradativa e reversvel, seria muito mais informativo. Novos caminhos e muitas aplicaes Os problemas ainda existentes nessa rea exigem um refinamento dos mtodos de mutagnese. Uma opo atraente o .transgene induzvel., que de penderia de um promotor controlado por uma dro

ga. Nesse caso, a administrao ou no da droga ao camundongo .ligaria. ou .desligaria. a expresso da protena associada ao transgene. Ainda mais interessante induzir mutaes em um dado tecido ou rgo. Para isso um gene deriva do de bactria (recombinase cre), ligado a um pro motor especfico para determinado tecido, inte grado ao genoma do camundongo como um trans gene. Ao mesmo tempo, obtm-se outras linhagens de camundongos contendo pequenas seqncias sinalizadoras (loxP) nas extremidades do gene em estudo (introduzidas por recombinao homloga), sem alterar sua expresso. O cruzamento das duas linhagens gera animais em que a recombinase cre, expressa apenas em te cidos especificados pelo promotor, reconhece as seqncias loxP junto ao gene-alvo e o elimina apenas nas clulas desses tecidos. Assim, ao conUSO POTENCIAL Figura 7. Usos potenciais da tecnologia de manipulao gentica

tudo. Se o gene inativado est Cincias biolgicas 4Identificar a funo de genes e proten s envolvido na formao do orgacorrespondentes em animais e vegetais nismo na fase embrionria, a 4Desenvolver modelos animais de doenas humanas, inativao pode ser letal, impepermitindo seu estudo e a busca de novas terapias dindo o nascimento das crias. Alm disso, com freqncia v rias protenas com funes se melhantes participam do controMedicina 4Produo de protenas de interesse mdico atravs de animais transgnicos que expressem genes humanos le de processos biolgicos. A re4Introduo de transgenes em tecidos ou rgos humanos dundncia vantajosa para o orpara tratar doenas genticas ganismo, que pode substituir a protena em caso de falha, mas significa que nocautear um gene 4Desenvolvimento de animais transgnicos para doao de tecidos ou rgos para transplante em humanos s revela suas funes no-redun dantes. Agropecuria 4Desenvolvimento de raas de animais transgnicos, Finalmente, esse tipo de mumais saudveis para consumo e de crescimento rpido tao induzida resulta na ausn4Desenvolvimento de vegetais mais resistentes a pragas cia total e irreversvel da proteou melhor adaptados ao solo e ao clima de uma regio na estudada, mas em geral a ex janeiro/fevereiro d e 1999 CINCIA HOJE 23

ENGENHARIA GENTICA trrio dos nocautes tradicionais, esses animais apre sentam deficincia da protena estudada s no tecido visado . nico modo de investigar genes com funes diversas em tecidos diferentes. A recombinao homloga pode ser usada para inativar totalmente um gene ou para eliminar ou substituir uma ou mais bases (processo chamado de knock in, em oposio a knock out). Nesse caso, so obtidas prote nas com alteraes de funo. A tcnica tambm permite investigar a questo da redundncia de protenas, atravs da gera o de linhagens independentes de camun dongos nocautes para diferentes genes en volvidos em um mesmo processo biolgi co e do cruzamento de tais linhagens para obter animais com diferentes com binaes de mutaes. Os animais transgnicos e nocautes tm permitido avanos sem preceden tes no conhecimento biolgico, mas isso no tudo. A lista de aplicaes da nova tecnologia (figura 7) est em expanso, e os primeiros produ tos dela derivados j alcanam o mercado. Na rea mdica, muitas doenas humanas de correm da ausncia de certas protenas ou de muta es que alteram suas funes normais. Nos hemo flicos, por exemplo, mutaes nos genes responsSugestes veis pela produo de fatores da coagulao para leitura sangnea criam o risco de hemorragias difceis de estancar e s vezes fatais. Transfuses de sangue ALBERTS, B., BRAY, D., LEWIS, J., regulares repem as protenas ausentes, mas envolRAFF, M., vem riscos como a transmisso de doenas infecROBERTS, K., ciosas (Aids, hepatite B, doena de Chagas e ou & WATSON, J.D. Molecular biology tras). Assim, apesar do esforo dos doadores, seria of the cell, muito til a produo segura, barata e em grande New York, Garland Publishing, 1994. escala de fatores de coagulao.

VEGA, M.A. Gene A introduo de um transgene humano em outro Targeting, Boca Raton, mamfero criaria uma .fbrica. da protena humana CRC Press, 1995. correspondente, idia j testada com sucesso emMAK, T.W., camundongos. Hoje, vrios grupos de pesquisa busPENNINGER, J., RODER, J., cam criar vacas ou cabras transgnicas para fatores ROSSANT, J., de coagulao humanos. Para isso, usam transgenes & SAUNDERS, M. The gene ligados a promotores que regulam a expresso dos knockout genes das protenas do leite, de onde o fator de factsbook, coagulao poder ser retirado. Em tese, essa estraLondres, Academic Press, tgia permite produzir qualquer protena de inte 1998. resse mdico, o que revolucionaria o controle de HOUDEBINE, L.M. Transgenic inmeras doenas. animals: Outra opo, aplicvel a muitas doenas genti generation and cas, a substituio, em clulas do paciente, do use, Amsterd, Harwood gene mutante causador do problema por um gene Academic funcional . a terapia gnica. Nesse caso, um transPublishers, 1997. (INTERNET) http:// gene introduzido em tecidos especficos ou uma www.biomednet.com/ mutao knock in regulariza a expresso dos genes db/mkmd originalmente no-funcionais. Nos ltimos anos,

pacientes com vrias doenas genticas vm sendo submetidos a esse tipo de terapia experimental. Tambm promissor o transplante de tecidos ou rgos de uma espcie para outra (xenotransplante). No caso do transplante de corao, por exemplo, uma opo perseguida h dcadas o uso do rgo de um animal (o porco a escolha mais adequada, pelas caractersticas fsicas do corao). Mas preciso superar a rejeio, processo em que o orga nismo do receptor reconhece e ataca protenas das clulas do rgo transplantado, diferentes das suas prprias. Criar porcos em cujos cora es as protenas responsveis pe la rejeio tenham sido substitu das por pro tenas hu manas se ria uma alternati va. Os xeno transplantes, usando r gos de animais geneticamente modi ficados, talvez sejam possveis em alguns anos. Na agroindstria, conceitualmente possvel desenvolver raas de animais que cresam mais rpido ou tenham menor percentual de gordura (ou outro componente) na carne, no leite ou em ovos. Tambm se podem obter animais mais resistentes a doenas, reduzindo gastos com drogas e o risco de intoxicaes causadas por elas. Os mesmos princ pios, aplicados a vegetais, gerariam plantas resis tentes a pragas ou mais bem adaptadas ao clima e solo de uma regio. Tudo isso poderia aumentar a produtividade na agroindstria mundial, ajudando a combater o flagelo da fome. Como todo avano tecnolgico, a manipulao gentica de seres vivos traz, ao lado dos benefcios, alguns riscos potenciais, nem sempre percebidos com facilidade. A riqueza de opes torna necess rio analisar caso a caso o uso da nova tecnologia. Alm disso, para seres sociais, as mudanas, sejam no comportamento ou no modo como garantem sua sobrevivncia, esto sempre associadas a julga mentos ticos. Portanto, cabe a cada sociedade dis cutir o assunto e decidir racionalmente quais tipos de tecnologia so ou no aceitveis para uso entre seus integrantes. O Brasil tambm precisa discutir a questo do uso de tcnicas de manipulao gentica, como vem ocorrendo h anos em vrios outros pases. fundamental que o pas no perca as oportunidades reais de melhorar suas condies de vida, nem aceite a imposio de decises tomadas por outras sociedades, sem discutir sua adequao realidade

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