Mtodos inmunoqumicos de anlisis.

Una paciente a la que hace dos aos se le diagnostic diabetes dependiente de insulina ingresa en el hospital con episodios de hipoglucemia. Con objeto de evaluar las causas de este estado se deben realizar determinaciones peridicas del contenido de insulina y glucosa en el suero. La determinacin del contenido de insulina se lleva a cabo por radioinmunoanlisis (RIA). a. Explicar el fundamento de este ensayo y describir el procedimiento que se empleara para llevar a cabo el mismo si se dispone de inmunoadsorbente unido a anticuerpos contra insulina (sephadex-anti-insulina) e insulina marcada con 125I. Qu tipo de curva dosis-respuesta se obtiene? Cmo podra linealizarse esta curva de respuesta? b. En el ensayo que se propone se incuba 200 L de muestras o patrones con una cantidad constante de insulina marcada con 125I que da lugar a un nmero total de cuentas por minuto de 20000, en ausencia de anticuerpo se mide una radiactividad no especfica de 380 cpm. La radiactividad enlazada a la fase slida medida al final del ensayo para diferentes patrones de insulina se resume en la tabla:

[Insulina] / U mL-1 ] (cpm)fase slida

0 13880

10 11180

20 9580

40 7400

80 5780

160 4025

320 2135

La posibilidad de que en el suero del paciente existan anticuerpos contra insulina hace necesario tratar antes de su anlisis 1 mL de suero con 0,2 mL de HCl 1 M. A continuacin se neutraliza la mezcla con 0,2 mL de Na OH 1 M y se aade 1 mL de polietilenglicol (PEG). Se centrifuga y el lquido sobrenadante se lleva a un volumen de 5 mL del que 200 L se tratan igual que los patrones de insulina, midindose una radiactividad enlazada a la fase slida de 6710 cpm. En un ensayo paralelo se determin un contenido de glucosa en el suero de la paciente de 0,23 g/L. Durante hipoglucemia la relacin entre la concentracin de glucosa (expresada en mg/100 mL) y la concentracin de insulina (expresada en U/mL) debe ser mayor de 25 de lo contrario se sospecha de la presencia de un tumor pancretico generador de insulina, que debe confirmarse. Cmo interpretaras los resultados obtenidos para este paciente?

Lidia Freije Fuente 4A

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a) RIA: Inmunoensayo con marcador. Los radioinmunoensayos usan como marcadores istopos radioactivos (inestables) que experimentan procesos de desintegracin radioactiva para dar lugar, finalmente, a istopos estables. En este caso tenemos un RIA Directo porque tenemos un inmunoadsorbente unido al anticuerpo contra insulina (sephadex-anti-insulina) y tenemos tambin el antgeno (insulina) marcada con 125I (marcador isotpico externo). Este marcador emite radiacin que se puede medir con un contador de centelleo slido.

Es un ensayo competitivo en el que los dos tipos de antgeno,(marcado y sin marcar)compiten por el anticuerpo adsorbido que est en defecto. Por tanto, la curva dosis respuesta (B* vs [Ag] )ser decreciente ya que cuanto ms concentracin de antgeno sin marcar (muestra, insulina sin marcar) menos insulina marcada se unir. Para linealizar la curva dosis respuesta podemos hacer una representacin tal como :

b)

En primer lugar, el problema nos dice que la cantidad constante de insulina marcada da lugar a 20000cpm y que en ausencia de anticuerpo hay una radiacin no especfica de 380 cpm. Por lo tanto: 20000 19620 20000 380 0.981 19620

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[insulina] U/mL 0 10 20 40 80 160 320

seal seal E ln [insulina] logit B/B cpm cpm 13880 13616,28 11180 10967,58 2,302585 1,420875 9580 9397,98 2,995732 0,801063 7400 7259,40 3,688879 0,132759 5780 5670,18 4,382027 -0,337460 4025 3948,53 5,075174 -0,895454 2135 2094,44 5,768321 -1,704961
Tabla 1

Representamos las dos ltimas columnas de la Tabla 1. tomando como B la seal por la eficiencia de cada valor (en blanco de la columna 3) y como B el primer valor de la columna 3. As, la recta de calibrado obtenida es :

2 1,5 1 0,5 logit B/B 0 -0,5 -1 -1,5 -2 ln [insulina] 0 1 2 3 4 5 6 7

. . .

Lidia Freije Fuente 4A

Mtodos inmunoqumicos de anlisis. Por tanto, en la muestra se mide una radiactividad enlazada en la fase slida de 6170cpm. Metiendo este valor en el calibrado obtenemos la concentracin de insulina que hay en los 5 ml que venan de 1ml de suero : 65.4 5 1 327.08

Adems, el problema nos dice que el contenido de glucosa es de 0.23 g/L o, lo que es lo mismo, 23mg/100 ml.

14.22

25

El paciente tiene sntomas de tumor pancretico.

Lidia Freije Fuente 4A