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BIORREMEDIACIN DE HIDROCARBUROS UTILIZANDO CEPAS ANTRTICAS.

Nombre del autor. Miguel Gualoto.

Director del Proyecto Landfarming, para tratamiento de cortes de perforacin- ENCANA. Asesor de EMASEO, proyecto de Relleno Sanitario Jalonguilla. Miembro de la Comisin del Cierre tcnico del Relleno de Zmbiza, Participante del II Congreso de Biotecnologa y I de Bioseguridad, en representacin de la Escuela Politcnica Nacional, Investigador de Ingeniera Ambiental de la UDLA. Director de la Maestra en Medio Ambiente de la ESPOJ, Director Cientfico del Primer Seminario Internacional sobre Derecho Gentico enfocado en la Salud, Ambiente y Biodiversidad. Director de Investigaciones de Humifarm del Ecuador. Perito ambiental; Caso Oxy- Red Amaznica y caso OCP- Red Amaznica. Perito de la Auditora Ambiental, caso Ecuavital- EMAP, Remediacin del Derrame de crudo en Papallacta. Investigador de la XIV Misin Cientfica a la Antrtida, Estacin Antrtica Pedro Vicente Maldonado de Ecuador, 2010. Asesor del programa de remediacin ambiental, campo libertador, lnea de flujo del pozo Shushuqui 13, CTT-FICAYA. Direccin del autor principal (*): calle Guayaquil 230 y Meja, Zmbiza. Quito Ecuador, Provincia de Pichincha Tel: 593-2 2886354 Email: mijail62veeo@gmail.com Abstract: The arduous task of decontaminating affected areas Andean oil spill has been affected by the low efficiency of microbial strains used in bioremediation, they have shown the work of bioremediation conducted in the lagoon of Papallacta, the same as today is an environmental liability. Our work is directed in the pursuit of psychrotolerant microorganisms with capacity to metabolize hydrocarbons. Thanks to research conducted in the Pampa Argentina and Chile. (Mac Cormack 2007). We know the existence of such microorganisms . The search was conducted in the areas of fuel loading and unloading stations Pedro Vicente Maldonado scientific, Arturo Prat station and Greenwich Island, and in the fuel storage area of the Russian scientific station Belinshaussen of King George Island, where the 50's of last century there was a significant spill of Bunker. Soil samples were taken at a depth of 25-30cm, and from them, direct seeding were prepared in culture media by dilution. Isolated colonies were transported to Ecuador for identification and characterization. After morphological identification work and biochemistry of microorganisms found, we performed experiments of degradation of hydrocarbons each of the strains found. Of the 33 strains, a total of 9 strains showed this ability and with them were tested for biodegradation of hydrocarbons in terrariums. Cells were maintained treatment in a cold room at 4 C, to recreate the average summer temperature of the study area. Temperature is a limiting factor in these processes, so it is appropriate to use psychrotolerant bacteria (Whyte et al. 2001).

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Among the identified strains that were used in bioremediation, we can mention: Pseudomonas sp, Rhodococcus sp, Pseudomonas putida, Bacillus sp, Clostridium perfringens, Aspergillum niger?, Penicillium chrysogenum, Micrococcus antarticus?, And Sphingomonas sp, which according to several sources consultation has shown the ability to degrade hydrocarbons. (Shivaji et al 1989, Logan et al.2004, Liu et al.2000; Miwa 1975, Arenz 2006). Strains were reproduced and added to the treatment cells, following the recommendation of biomagnification as the most effective strategy (Collerman 1997, Coulon and Delille 2003, Cunningham and Philp 2000), although others consider unnecessary the application of techniques of biomagnification ( Ruberto et al. 2003). The soils of the treatment cells thermally disinfected at 80 C for 60 minutes to stimulate evaporation of VOCs and eliminate the native microflora. After each cell was added an amount of 18 degree API oil (sample obtained from Petroecuador in 2005), to achieve a concentration of 5000 ppm and 850 ppm TPHS HAPs. Key Words: Bioremediation, Landfarming, adsorption, molecular sieve, sludge disposal, autochthonous strains.

BIORREMEDIACIN DE HIDROCARBUROS UTILIZANDO CEPAS ANTRTICAS.

1. Resumen.- La ardua tarea de descontaminar zonas andinas afectadas por derrames de hidrocarburos se ha visto afectada por la baja eficiencia de las cepas microbianas empleadas en la biorremediacin, as lo han mostrado los trabajos de biorremediacin realizados en la laguna de Papallacta, la misma que en la actualidad es un pasivo ambiental. Nuestro trabajo se direccion en la bsqueda de microorganismos psicrotolerantes, con capacidad para metabolizar hidrocarburos; de cuya existencia conocimos gracias a varios estudios realizados en la Pampa Argentina y Chilena. (Mac Cormack 2007). La bsqueda se efectu en las zonas de carga y descarga de combustibles de las estaciones cientficas Pedro Vicente Maldonado y Arturo Prat de la Isla Greenwich y en la zona de almacenamiento de combustibles de la estacin cientfica rusa Belinshaussen de la Isla King George, donde en los aos 50 del siglo pasado se produjo un derrame considerable de bunquer. Las muestras de suelos, se tomaron a una profundidad de 25-30cm y, a partir de ellas, se prepararon siembras directas en medios de cultivo, mediante diluciones. Las colonias que crecieron fueron transportadas al Ecuador para su identificacin y caracterizacin. Luego de los trabajos de identificacin morfolgica y bioqumica de los microorganismos encontrados, hemos realizado experiencias de degradacin de hidrocarburos con cada una de las cepas encontradas. De las 33 cepas1, un total de 9 cepas mostraron esta capacidad y con ellas se realizaron pruebas de biodegradacin de hidrocarburos en terrarios. Las celdas de tratamiento fueron mantenidas en un cuarto fro a 4C, para recrear la temperatura cercana al promedio de verano de la zona de estudio. La temperatura es un factor limitante de estos procesos, por lo que resulta adecuado el uso de bacterias psicrotolerantes (Whyte y col. 2001). Entre las cepas identificadas2 que se emplearon en la biorremediacin, podemos mencionar a: Pseudomonas sp, Rhodococcus sp, Pseudomona putida, Bacillus sp, Clostridium perfrigens, Aspergillum niger?, Penicillum Chrysogenum, Micrococcus antarticus?, y Sphingomonas sp, las cuales segn varias fuentes de consulta han mostrado la capacidad de degradar hidrocarburos. (Shivaji et al 1989; Logan et al.2004; Liu et al.2000; Miwa 1975, Arenz 2006). Se reprodujeron las cepas y se adicionaron a las celdas de tratamiento, siguiendo la recomendacin de la biomagnificacin como la estrategia ms efectiva (Collerman 1997, Coulon y Delille 2003, Cuningham

Informe Preliminar de la investigacin Aislamiento e identificacin de bacterias con capacidad de degradar hidrocarburos. FUNDEMAR- UDLA. 2010. Pag: 32 PDF. 2 Es necesario reconfirmar los datos mediante estudios de ARNs16s, en un laboratorio especializado.

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y Philp 2000); aunque otros consideran innecesaria la aplicacin de tcnicas de biomagnificacin (Ruberto y col. 2003).3 Los suelos de las celdas de tratamiento se desinfectaron trmicamente a 80C durante 60 minutos, para estimular la evaporacin de COVs y eliminar la microflora autctona. Luego a cada celda se adicion una cantidad de hidrocarburo de 18 grados API (muestra obtenida de Petroecuador en el 2005), hasta lograr una concentracin de 5000 ppm de TPHS y 850 ppm de HAPs. 2. Introduccin.- Es indudable el rol de los microorganismos en la circulacin de la materia y energa de los ecosistemas y del planeta en su conjunto, en consecuencia su distribucin es amplia y sus facultades metablicas son incomparables. Bajo esta premisa, nos hemos impuesto la tarea de buscar microorganismos psicrfilos capaces de degradar hidrocarburos a bajas temperaturas. La Misin Antrtica nos ha permitido hallarlas y probarlas en condiciones de laboratorio. Esperamos en el futuro transferir sus genes a especies nativas y con sus descendientes recuperar amplias zonas, que constituyen las fuentes de agua para las ciudades del Ecuador, afectadas por derrames de hidrocarburos. Texto del ensayo.- Como se acot en el resumen en la primera etapa de la investigacin ejecutada en la XIV Misin Cientfica a la Antrtida, se obtuvieron 33 cepas de microorganismos, las mismas que fueron sembradas in situ y aisladas en el laboratorio de la Universidad de las Amricas de Quito. Materiales. Los materiales empleados para las pruebas, a ms de medios de cultivo, nutrientes minerales y materiales de microbiologa, fueron: suelos andinos, bandejas de plstico (terrarios), paletas de madera, atomizadores de plstico Mtodos. Identificacin de microorganismos degradadores de hidrocarburos. Las bacterias aisladas se conservaron en TSB (Triptona Soya Agar) con glicerol al 20% a -37C, y los hongos filamentosos en AM (Agar Malta 2%) a 4C. Los microorganismos con capacidad para degradar hidrocarburos fueron identificados mediante un medio enriquecido con 150 mg L-1 de crudo esterilizado y 10g de suelos antrticos. Los erlenmeyer se incubaron en condiciones ptimas a 4 C, pH 8,0, y la salinidad de 30 partes por mil durante 30 das. Frascos que resultaron turbios dentro de dos semanas fueron considerados como positivo. Los microorganismos disponibles en los frascos positivos, fueron aislados en medio agar marino (DIFCO, 2216), para ser empleados en las pruebas experimentales de biodegradacin de hidrocarburos mediante terrarios. La composicin de diferentes especies bacterianas fu evaluada por el mtodo de recuento en placa (ASM, 1981). La poblacin de cada bacteria especfica se calcul teniendo en cuenta el porcentaje de las colonias y la poblacin total de bacterias en el suelo. Medio de identificacin. La solucin nutritiva utilizada en las pruebas fue un medio sinttico que contiene los siguientes componentes en agua doblemente destilada: KH2P04 (85 mg/L), K2HP04 (217,5mg/L), Na2HP04.2H20 (334mg/L), NH4Cl (25mg/L), MgS04.7H20 (22,5 mg/L), CaCl2(27,5 mg/L); FeCl3.6H20 (0,25 mg/L), MnS04.H20 (0.0399 mg/L), H3B03 (0.0572 mg/L), ZnSO4.7H20 (0,0428 mg/L), (NH4)6Mo7O24 (0.0347 mg/L); FeCl3.EDTA (0.1 mg/L) y extracto de levadura (0,15 mg/L) 4. El contenido de nutrientes e hidrocarburos en los suelos se determin cuantitativa y cualitativamente como se describe en el mtodo estndar del PNUMA (1992). Mientras que los nutrientes del suelo (C, N, P) se evaluaron mediante el uso de los mtodos propuestos por Cleveland y Liptzin (2007). Preparacin de las unidades experimentales.- La metodologa de tratamiento empleada fue la de terrario, en bandejas de plstico de 20kg (un total de 10). Los suelos fueron tomados en las inmediaciones del nevado Antisana; y fueron limpiados de restos de materiales orgnicos; se sometieron a tratamiento trmico durante 60 minutos a 80C, en un horno de mufla. Luego de su enfriamiento se

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Ruberto, Lucas; Vazquez, Susana. Biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos utilizando bacterias antrticas

sicrotolerantes.; Mac Cormack, Walter, pp: 3

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Henry H. Tabak, Rakesh Govind, Chunsheng Fu, and Chao Gao. Protocol for Determining Bioavailability and Biodegradation Kinetics of Organic Soil Pollutants in Soil Systems to Enhance Bioremediation of Polluted Soil Sites. Bioremediation Protocol. 2008. 320.

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tamiz para eliminar el material ptreo e impurezas presentes con una malla 70 y se dispuso en las bandejas experimentales. A los suelos se adicion crudo de 18 grados API disueltos en acetona, en tal forma que los 20 kg de suelos estriles adquieran una concentracin de 5000ppm en TPHs y 850 ppm en HAPs, conforme al anlisis inicial de la composicin del crudo empleado. Bioaumentacin.- En cada una de las celdas experimentales, excepto la testigo, los microorganismos se adicionaron con la solucin nutritiva antes mencionada a razn de 15ml/kg, por tres ocasiones; al inicio a los 30, y 60 das. Bioestimulacin.- La Bioestimulacin se efectu en forma peridica simultnea a la humectacin, al efecto se emplearon sales de cidos hmicos con siete micro elementos: Cu, Fe, Mn, Co, Mo, B y Zn, en solucin al 0,01%. Se aplicaron cada 15 das en cantidades suficientes para garantizar un promedio de humedad en las celdas experimentales de 50-60%. Control de parmetros. Los parmetros de control del proceso de biorremediacin fueron: temperatura, pH, conductividad, humedad, aireacin, control de UFCs. Se realiz un control rutinario de parmetros de proceso cada 72 horas. Toma de muestras. Las muestras para anlisis de laboratorio y comprobacin del avance del proceso de biodegradacin de hidrocarburos se realizaron cada 30 das, a razn de 0,5 kg/celda, en sobres de papel aluminio dentro de fundas sifloc y enviadas a un laboratorio certificado con la cadena de custodia correspondiente Cintica del proceso. Tasa de degradacin.- Basados en experiencias personales decidimos emplear la ecuacin modificada de Monod.

LnCo mMax.Bo kt C Y *t (1)

Con la ayuda de esta ecuacin se traz una grfica de dependencia lnCo/C del tiempo, para las unidades experimentales. La constante K (tasa de biodegradacin), se determinar por la pendiente de la curva. Se determinaron tambin los tiempos de vida media de los TPHs y HAPs, la eficiencia del tratamiento en % y la tasa de crecimiento para cada una de las cepas empleadas. Las ecuaciones empleadas fueron: Pendiente = Y2-Y1 / X2 X1 Tasa de crecimiento especfica Tiempo de vida media. t=-ln (0,5)/k (3)

LnN 2 LnN1 t2 t1

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Resultados. Tasa de crecimiento especfica. Las tasas de crecimiento especficas fueron bajas, si las comparamos con las que normalmente se obtienen con cepas empleadas en biorremediacin bajo condiciones ambientales similares a las del territorio ecuatoriano. Segn datos bibliogrficos (Rittman 2001), las tasas de crecimiento especfico para Pseudomonas es de 0,7/da. Los resultados obtenidos se pueden analizar en la tabla No1. Es probable, que las condiciones del sitio de experimentacin ejerzan influencia sobre dicha tasa, adems de las condiciones del medio de cultivo, que difiere en mucho de las condiciones en las cuales normalmente estos microorganismos se reproducen. La cepa con mayor tasa de crecimiento especfica fue Micrococcus antarticus y la de menos Sphingomonas sp. Las tasas bajas se explican por su metabolismo lento, propio de microorganismos psicrfilos. Control UFCs. Uno de los aspectos de importancia en trabajos de biorremediacin es el control de UFCs, el mismo que debe mantenerse sobre los 10 6 para garantizar una buena tasa de degradacin, si pensamos en su potencial aplicacin en trabajos a gran escala, donde el tiempo de tratamiento define los costos del proceso. Durante nuestro trabajo su comportamiento fue un poco irregular, logrando en la mayora de las celdas un crecimiento moderado.

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Los valores variaron entre 0,08x106 de Micrococcus antarticus y 3,7x106 de Rhodococcus sp. El grfico No.2 ilustra el comportamiento de ste parmetro durante las pruebas en cada una de las celdas experimentales. Disminucin de la concentracin de hidrocarburos. De cada celda experimental se tomaron 0,5 kg de muestra y se enviaron a un laboratorio certificado para el anlisis correspondiente de TPHs y HAPs, conforme a metodologas estandarizadas EPA 815D (DGFID) y EPA 8270D respectivamente. La variacin de la concentracin de TPHs fue ms pronunciada en la unidad experimental de Pseudomona putida, con 3133ppm de 5000ppm; la unidad experimental de menor disminucin fue la de Aspergillum niger, con 770ppm de 5000 ppm; en tanto que la unidad experimental de Rhodococcus present la mayor disminucin de HAPs, con 772ppm de 850 ppm y la celda de menor disminucin fue Bacillus sp con apenas 49ppm de 850ppm. Mayores detalles se presentan en las tablas No.2 y 3. Tasa de biodegradacin de hidrocarburos Tasa de degradacin de TPHs La tasa se calcul mediante la frmula (1); la tasa ms elevada se obtuvo en la unidad experimental U3 de Pseudomona putida, y la ms baja en la unidad U8 de Micrococcus antarticus. Para su clculo se emplearon los anlisis realizados por un laboratorio independiente en el transcurso de 120 das (un total de cinco anlisis). La tabla No.4 ilustra los valores obtenidos en cada unidad experimental. Tasas de degradacin de HAPs De igual forma se estableci la relacin lnCo/C, para HAPs; resultando la de mayor valor la unidad U2 de Rhodococcus sp, y la de menor valor la unidad U4 de Bacillus sp. Detalles de cada unidad experimental se observan en la tabla No.5 y grfica correspondiente. Tiempo de vida media. El tiempo de vida media lo calculamos mediante la ecuacin (3). Los tiempos de vida media de los hidrocarburos presentes en las muestras experimentales, son largos como era de esperarse, siendo para TPHs el valor ms alto de 821,4 das para la celda U6 de Aspergillum niger y el ms bajo de la unidad 106,6 das de Pseudomona sp Los tiempos de vida media para HAPs son ms largos, estos resultados concuerdan con los obtenidos en trabajos experimentales y de campo, ejecutados en condiciones de campo en el Distrito Amaznico, donde la degradacin de compuestos aromticos requiere mayor tiempo. 5 La celda con mayor tiempo de vida media para HAPs es U5 de Clostridium perfrigens con 1916,6 das, en tanto que las de menor son U2 de Rhodococccus sp y U6 de Aspergillum niger, con 40,58 das respectivamente. La grfica No.5 ilustra la variacin comparativa de los tiempos de vida media para TPHs y HAPs en cada una de las unidades experimentales. Eficiencia. Con los resultados obtenidos en lnCo/C, fue factible estimar la eficiencia de las cepas empleadas en el tratamiento de HAPs y TPHs. Para TPHs la cepa de mayor eficiencia result Pseudomona putida con 62% y la de menor Aspergillum niger, con el 15,40%. Para HAPs, la eficiencia cambin de cepa, Rhodococcus alcanz un 90,80% de eficiencia; en tanto que la cepa Bacillus sp, obtuvo la menos eficiencia con el 5,76%. Ver detalles en la tabla y grfico No.6. Control de otros parmetros de proceso. Temperatura. Para todos es conocida la importancia de la temperatura en la velocidad de las reacciones bioqumicas; en este caso se crearon las condiciones de cuarto fro (4C), para garantizar la estabilidad de una temperatura adecuada para el trabajo de las cepas antrticas. pH. En cuanto al pH, fue necesario cada 15 das realizar una medicin de este parmetro, para controlar cambios bruscos y consecuentemente problemas en el proceso de biorremediacin. Las variaciones de este parmetro se pueden apreciar en la grfica No.7. Los datos considerados en la grfica corresponden a las fechas de muestreo de TPHs y HAPs.

Pinos Adriana, Gualoto Miguel. Remediacin de suelos y sedimentos contaminados por el derrame de la lnea de flujo del pozo Shushuqui 13, mediante la tcnica de Landfarming, Campo Libertador, Sucumbos. Universidad Tcnica del Norte. Programa PRAS. 2010. pp-152-160.

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Conductividad. La resistencia del medio es importante para el flujo de los iones y el transcurso de los procesos de xidoreduccin, que ocurren en el suelo, y para la disponibilidad de ciertos nutrientes para los microorganismos. Las variaciones de sus valores se ilustran en la tabla No.8. Humedad Siendo la humedad un factor limitante en condiciones antrticas, se decidi trabajar a una temperatura de 4C, bajo la cual el agua estuviera disponible para el metabolismo microbiano. Las variaciones de la humedad pueden verse en la tabla No. 9. La humectacin se efectu con una solucin al 0,01% de humato7plus (sales de cidos hmicos con siete micro elementos; Cu, Mn, Mo, Co, Zn, B, Fe). 4. Discusin. Tasa de crecimiento especfica Las tasas de crecimiento especfico de las cepas investigadas son bajas. Consideramos que puede ser una consecuencia propia de su metabolismo o quiz estn influenciadas por las condiciones del medio y el cambio de las condiciones ambientales. Consideramos ampliar la base investigativa para definir estos aspectos. Control de UFCs. El nmero de microorganismos degradadores de hidrocarburos en suelos vrgenes polares a menudo est bajo los lmites de deteccin, mientras que 105 degradadores de hidrocarburos g-1 se han detectado en los suelos contaminados en las aguas superficiales y capas subsuperficiales (Aislabie et al 2001;.. Rike et al 2002). Tomando en consideracin dicha fuente, estimamos que nuestros resultados, confirman dicha abundancia, pese que en alguna de las unidades experimentales su valor es igual a 106; seguramente debido a las condiciones especiales que se han creado en las celdas experimentales. Tasa de biodegradacin de TPHs y HAPs Si bien el gnero Pseudomona tiende a degradar hidrocarburos alifticos con mayor eficiencia (tal como lo demuestran sus tasas de degradacin), tambin puede degradar una gama reducida de sustratos aromticos, entre los cuales se incluye PCB, pireno (Eriksson et al. 2002). Rhodococcus segn (Whyte et al. 1999b), produce biosurfactantes asociados a la superficie celular con actividad a bajas temperaturas, que se adhieren directamente a los alcanos slidos a baja temperatura, permitiendo su degradacin. Nuestros resultados confirman una baja tasa de degradacin de TPHs para Rhodococcus, en tanto que los resultados obtenidos para HAPs confirman mltiples referencias de trabajos experimentales y prcticos de biodegradacin de aromticos con Rhodococcus en el Ecuador y el mundo (Gualoto, Cabrera- 2008, Gualoto-2007) Sphingomonas aislado en la Antrtida degrada numerosos componentes de la fraccin aromtica del crudo, jet fuel y diesel (Baraniecki et al. 2002), tambin utiliza muchos compuestos aromticos para el crecimiento, incluyendo, m-xileno naftaleno y sus derivados de metilo, fluoreno y fenantreno6. En nuestro trabajo este gnero presenta una baja capacidad de degradacin para TPHs (863ppm de 5000pmm) y una considerable capacidad para compuestos aromticos con 738ppm de 850 ppm. Las referencias bibliogrficas existentes en cuanto a las tasas de biodegradacin son escazas, en consecuencia, consideramos que nuestros resultados pueden y deben ser confirmados con investigaciones ms precisas en cuanto a las metodologas de anlisis. De nuestra experiencia de trabajo en el Ecuador, consideramos que la elevada tasa de degradacin de HAPs, de Aspergillus niger, no es una novedad, por cuanto la hemos empleado en la biorremediacin de sedimentos de tanques de almacenamiento de combustibles, conjuntamente con el gnero Penicillum; para las primeras etapas del proceso empleando como cosustratos aceites esenciales de ctricos, cuya estructura molecular es similar al de los compuestos aromticos de los sedimentos. De esto evidencian los resultados obtenidos en nuestra investigacin donde Penicillum chrysogenum, presenta una elevada tasa de degradacin de HAPs (753 de 850ppm), en tanto que Aspergillus niger 756 de 850ppm. Tiempos de vida media. Los tiempos de vida media de los compuestos aromticos son comnmente largos debido a que muchos de sus componentes son recalcitrantes, esa ha sido la dinmica observada a lo largo de varios trabajos en

Fillers Dennis, Snape Ian. Bioremediation of petroleum hidrocarbons in cold regions. Cambrige University Press.2008. pp 100-110.

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Biorremediacin en el Ecuador, los resultados obtenidos en la investigacin Antrtica, confirman esa tendencia. Segn (Balks et al. 2002) el tiempo necesario para establecer una importante degradacin de hidrocarburos en suelos de la comunidad polar despus de un derrame es desconocido. Control de parmetros La temperatura es un factor de importancia para la biorremediacin, la dependencia de la velocidad sigue un valor de Q10. Este valor es la relacin entre la velocidad de primer orden constante a una temperatura especfica para la constante de velocidad a una temperatura de 10 C ms baja (Kurola 2006). Para nuestro caso, considerando las condiciones especiales de las pruebas, estas transcurrieron a la temperatura de 4C de un cuarto fro, que permiti al personal operativo e investigadores desarrollar su trabajo en forma segura. Si bien en suelos templados, la degradacin bacteriana de hidrocarburos tiene un ptimo alrededor de pH 7,0 a 7,8. Los suelos polares, sin embargo, puede ser altamente alcalino (Aislabie et al 1998;.. Whyte et al, 1999a). Nuestro trabajo se desarrollo con valores de pH que variaron entre 5,8 y 7,8, aunque el pH inicial del suelo experimental vario entre 8,0 y 8,2. Los resultados obtenidos muestran que los valores de pH, fueron adecuados para que se evidencie la capacidad degradadora de hidrocarburos de los microorganismos investigados en mayor o menor intensidad. Segn algunas fuentes (Baraniecki et al.2002), Sphingomonas crecen de manera ptima en un medio bien tamponado con pH entre 6,0 y 7,8, a pesar de estar aislado del suelo Base Scott con pH> 9; para nuestro caso el suelo de aislamiento tubo un pH de 8,3 y su crecimiento se di bajo pH entre 7,3 y 7,8. En cuanto a la humedad de las unidades experimentales, consideramos que la temperatura elegida para la realizacin de las pruebas fue adecuada para garantizar el acceso de los microorganismos al agua, algo que bajo condiciones ambientales de la Antrtida no se produce, al menos en la cantidad a la que tuvieron acceso los microorganismos investigados. Las fuentes consultadas, nada dicen sobre la importancia de la conductividad del medio para el transcurso de la biorremediacin. De nuestra experiencia en trabajos de biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos y descontaminacin de suelos agrcolas, colegimos que valores de conductividad elctrica superiores a 1,7 mS/cm, reducen drsticamente la movilidad de iones en la solucin del suelo, interrumpiendo y alterando los potenciales de membranas de las bacterias y clulas vegetales. Consideramos que los valores observados de conductividad fueron adecuados entre 0,58 y 1,35mS/cm. 5. Conclusiones.En nuestro trabajo experimental hemos recurrido a la medicin de la concentracin de TPHs y HAPs, por medios analticos estandarizados aprobados para el sector hidrocarburfero en el Ecuador, tal como se estila para trabajos de biorremediacin a gran escala, las valoraciones de las prdidas de hidrocarburos mediadas por esta metodologa son confiables y constituyen parte de la documentacin de la biorremediacin de hidrocarburos obligada para trabajos de este tipo. Sin embargo consideramos que metodologas adicionales de medicin pueden reconfirmar los datos obtenidos, tales como el uso de indicadores como la abundancia de bacterias, la generacin de gas, la respiracin O2/CO2(Ferguson et al, 2003a;.. Ferguson et al, 2003b;. Walworth et al, 1997a; Walworth et al, 1997b), cambios en la relacin ARN / ADN o el aumento de productos intermedios de degradacin (Eriksson et al 2001;. Eriksson et al 2003;.. Whyte et al 1998). Se puede ampliar la gama de parmetros, incluyendo la mineralizacin, con compuestos marcados isotpicamente, CO2 y TPH, y las vas catablicas en fase slida utilizando micro-extraccin de cromatografa de gases - espectrometra de masas y la reaccin en cadena de la polimerasa. Todas estas tecnologas por ahora no son reales para nosotros, pero en un futuro debern formar parte de nuestro arsenal. Los resultados obtenidos, muestran el potencial de las cepas empleadas para la biodegradacin de hidrocarburos y las posibilidades de su empleo en la remediacin de zonas andinas contaminadas con hidrocarburos, donde las cepas comnmente empleadas han mostrado incapacidad. La eficiencia mostrada de microorganismos como Rhodococcus, Penicillum y Aspergillum, para degrada HAPs, confirman resultados anlogos, obtenidos en trabajos en nuestro territorio y en otras partes del mundo, a nivel de laboratorio y a nivel de campo.

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La prueba confirmatoria de esta capacidad deber efectuarse in situ en las inmediaciones de la Estacin Cientfica Pedro Vicente Maldonado, donde como es natural habrn que hacerse modificaciones sustanciales en cuanto a la disponibilidad de agua y el control de parmetros de proceso. 6. 1. 2. Referencias bibliogrficas. Asim K.Bej; Jackie Aislabie. The Ecology biodiversity and bioremediation potential of microorganisms in Extremely cold environments. CRS Press.2100. pp 231-250. Balks, M. R., Holmes, D. J., and Aislabie, J. 2002. The fate and effects of hydrocarbons in Antarctic soil: preliminary results of an experimental fuel spill. In Transactions of the 17th World Congress of Soil science, Kheoruenromne, I. (ed), Bangkok, Thailand International Union of Soil Sciences, 3201 to 3209. Baraniecki, C. A., Aislabie, J., and Foght, J. M. 2002. Characterisation of Sphingomonas sp. Ant 17, an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium isolated from Antarctic soil. Microbial Ecol. 43: 4454. Eriksson, M., Dalhammar, G., and Mohn, W. W. 2002. Bacterial growth and biofilm production on pyrene. FEMS Microbiol. Ecol. 40: 217. Ferguson, S. H., Franzmann, P. D., Revill, A. T., Snape, I., and Rayner, J. L. 2003a. The effects of nitrogen and water on mineralisation of diesel-contaminated terrestrial Antarctic sediments. Cold Reg. Sci. Technol. 37: 197212. Ferguson, S. H., Franzmann, P. D., Snape, I., et al. 2003b. Effects of temperature on mineralisation of petroleum in contaminated Antarctic terrestrial sediments. Chemosphere 52(6): 97587. Fillers Dennis, Snape Ian. Bioremediation of petroleum hidrocarbons in cold regions. Cambrige University Press.2008. pp 100-110. Gualoto Miguel. Cabrera Richard. Tratamiento de lodos residuales industriales con tamices moleculares y cepas microbianas autctonas. Congreso AEISA, Cuenca 2011. Gualoto Miguel. Tratamiento biolgico de lodos residuales aceitosos en plataforma cubierta. Congreso AEISA. 2008, Quito-UDLA. Levin Morris, Gealt Michael. Biotratamiento de residuos txicos y peligrosos. Mc Graw Hill.1997. pp. 129-140. Pinos Adriana, Gualoto Miguel. Remediacin de suelos y sedimentos contaminados por el derrame de la lnea de flujo del pozo Shushuqui 13, mediante la tcnica de Landfarming, Campo Libertador, Sucumbos. Universidad Tcnica del Norte. Programa PRAS. 2010. pp-152-160. Rike, A. G., Brresen, M., and Instances, A. 2002. Response of cold-adapted microbial populations in a permafrost profile to hydrocarbon contaminants. Polar Rec.37(202): 23948. Rittman Bruce, McCarty Perry. Biotecnologa del medio ambiente. Mc Graw Hill 2001. pp.159-175. Walworth, J. L., Woolard, C. R., and Harris, K. C. 1997b. Bioremediation of petroleum-contaminated soil using fish bonemeal in cold climates. AgroBorealis 29: 314. Walworth, J. L., Woolard, C. R., Braddock, J. F., and Reynolds, C. M. 1997a. Enhancement and inhibition of soil petroleum biodegradation through the use of fertilizer nitrogen: An approach to determining optimum levels. J. Soil Contam. 6(5): 46580. Whyte, L. G., Goalen, B., Labbe, D., Greer, C. W., and Nahir, M.. Bioremediation treatability assessment of hydrocarbon-contaminated soils from Eureka, Nunavut. 2001. Cold Reg. Sci. Technol. 32(23): 12132. Whyte, L. G., Slagman, S. J., Pietrantonio, F., et al. 1999b. Physiological adaptations involved in alkane assimilation at low temperatures by Rhodococcus sp. Strain Q15. Appl. and Environ. Microbiol. 65: 29618.

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17.

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7. Cuadros tablas y grficos Tabla No1. Tasa de crecimiento especfica. CEPAS Pseudomonas sp Rhodococcus sp Pseudomona putida Bacillus sp Clostridium perfrigens Aspergillum niger Penicillum Chrysogenum Micrococcus antarticus Sphingomonas sp Testigo 48 horas 32 21 25 15 9 41 63 6 12 120 Horas 160 92 112 63 42 85 154 41 43 lnN1 3,40 3,04 3,21 2,70 2,19 3,71 4,14 1,79 2,48 lnN2 5,07 4,52 4,71 4,13 3,73 4,44 5,03 3,71 3,76 1,09 K 0,023 0,020 0,0208 0,019 0,021 0,010 0,012 0,026 0,017 0,00

3 3 1,09 Fuente: Dr. Miguel Gualoto

Grafico No.1 Tasa de crecimiento especfica microbiana comparativa

Tasa de crecimiento comparativo

0,03

0,025

K= lnN1-lnN2/ t2-t1

0,02

0,015

Series1

0,01

0,005

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fuente: Dr. Miguel Gualoto

10
Grfico No.2 Variacin de UFCs en las celdas experimentales durante las pruebas de biodegradacin. 16,00 14,00 12,00 10,00 lnN 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 1 2 3 4 5 Fuente: Dr. Miguel Gualoto U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 UT

Tabla No.2 Variacin de la concentracin de TPHs Variacin de TPHs ppm Microorganismo Pseudomonas sp Rhodococcus sp Pseudomona putida Bacillus sp Clostridium perfrigens Aspergillum niger Penicillum Chrysogenum Micrococcus antarticus Sphingomonas sp Testigo Celda U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 UT I 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 II 4629 4896 4021 4729 4502 4679 4003 4867 4902 Muestra III 3731 4662 3657 4119 4194 4510 3729 4622 4762 4910 IV 2978 4132 2133 3027 3645 4467 2765 4139 4473 4890 V 2120 3700 1867 2630 3112 4230 2079 4002 4137 4870

5000 5000 Fuente: Dr. Miguel Gualoto

11
Tabla No.3 Variacin de la concentracin de HAPs HAPs ppm Microorganismo Pseudomonas sp Rhodococcus sp Pseudomona putida Bacillus sp Clostridium perfrigens Aspergillum niger Penicillum Chrysogenum Micrococcus antarticus Sphingomonas sp Testigo Celda I U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 UT 850 850 850 850 850 850 850 850 850 II 837 652 812 845 827 721 691 800 770 Muestra III 819 387 779 832 814 413 396 784 625 847 IV 798 105 721 812 802 156 138 726 251 844 V 720 78 720 801 798 94 97 710 112 840

850 850 Fuente: Dr. Miguel Gualoto

U1 lnCo/C 0 0,07 0,29 0,51 0,85

U2 lnCo/C 0 0,02 0,06 0,19 0,30

Tabla No. 4 Variacin de ln Co/C TPHs U3 U4 U5 U6 U7 lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C 0 0,21 0,31 0,85 0,98 0 0,05 0,19 0,50 0 0,10 0,17 0,31 0 0,06 0,10 0,11 0 0,22 0,29 0,59 0,87

U8 lnCo/C 0 0,02 0,07 0,18 0,22

U9 lnCo/C 0 0,019 0,048 0,11 0,18

0,64 0,47 0,16 Fuente: Dr. Miguel Gualoto

Grafico No. 3 Variacin de lnCo/C de TPHs en el tiempo 1,2 1 0,8 lnCo/c 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 Fuente: Dr. Miguel Gualoto U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9

12

U1 lnCo/C 0 0,015 0,037 0,063 0,160

U2 lnCo/C 0 0,26 0,78 2,09 2,38

U3 lnCo/C

Tabla No.5 Variacin de ln Co/C HAPs U4 U5 U6 U7 lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C 0 0 0,005 0,021 0,045 0 0,027 0,043 0,058 0 0,16 0,72 1,69 0 0,20 0,76 1,81 2,17

U8 lnCo/C 0 0,06 0,08 0,15 0,17

U9 lnCo/C 0 0,09 0,30 1,21 2,02

0,045 0,087 0,164 0,165

0,059 0,073 2,20 Fuente: Dr. Miguel Gualoto

Grfico No.4 Variacin de lnCo/C de HAPs, en funcin del tiempo 2,5 U1 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 Fuente: Dr. Miguel Gualoto U2 U3 lnCo/C U4 U5 U6 U7 U8 U9

Grfico No.5 Tiempo de vida media comparativo para HAPs y TPHs 2500 2000 Tiempo/das 1500 TPHs 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Fuente: Dr. Miguel Gualoto HAPs

13
Tabla No.6 Eficiencia comparativa para degradar TPHs y HAPs. Microorganismo Pseudomonas sp Rhodococcus sp Pseudomona putida Bacillus sp Clostridium perfrigens Aspergillum niger Penicillum Chrysogenum Micrococcus antarticus Sphingomonas sp Testigo TPHs/% 57,60 26,00 62,60 47,40 37,76 15,40 58,42 19,96 2,60 0 Fuente: Dr. Miguel Gualoto HAPs/% 15,29 90,80 15,29 5,76 6,11 88,94 88,58 16,47 86,82 0

Grfico No. 6 Rendimiento comparativo de las cepas en la degradacin de TPHs y HAPs

Rendimiento comparativo TPHs y HSPs

100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 % Rendimiento TPHs Rendimiento HAPs

Fuente: Dr. Miguel Gualoto

14
Grfico No.7 variacin del pH en las celdas experimentales 9 8 U1 7 6 5 pH 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 Fuente: Dr. Miguel Gualoto U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 UT

Tabla No8. Variacin de la conductividad en las unidades experimentales Microorganismo Pseudomonas sp Rhodococcus sp Pseudomona putida Bacillus sp Clostridium perfrigens Aspergillum niger Penicillum Chrysogenum Micrococcus antarticus Sphingomonas sp Testigo U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 UT Celda I 0,67 0,52 1,06 0,64 0,52 0,49 0,21 0,43 0,32 II 0,72 0,64 1,11 0,72 0,66 0,53 0,44 0,77 0,47 Conductividad mS/cm III 0,83 0,73 1,23 0,87 0,78 0,62 0,76 0,54 0,85 0,55 IV 0,97 0,81 1,29 0,91 0,82 0,77 0,98 0,69 0,91 0,56 V 1,12 0,98 1,35 0,76 0,88 0,92 1,13 0,93 1,02 0,58

0,56 0,57 Fuente: Dr. Miguel Gualoto

15
Tabla No.9 Variacin de la humedad en las unidades experimentales Microorganismo Pseudomonas sp Rhodococcus sp Pseudomona putida Bacillus sp Clostridium perfrigens Aspergillum niger Penicillum Chrysogenum Micrococcus antarticus Sphingomonas sp Testigo U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 UT Celda I 60 60 60 60 60 60 60 60 60 II 56 61 54 55 63 42 61 52 59 Humedad % III 62 53 56 63 41 47 49 53 61 62 IV 48 57 62 57 53 61 43 51 63 59 V 51 54 57 53 44 47 45 51 52 58

60 61 Fuente: Dr. Miguel Gualoto Microorganismos empleados en la remediacin

Fuente: Dr. Miguel Gualoto