Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP ANEXO-Laboratorio N 1
OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS. El examen microscpico de microorganismos constituye una de las tcnicas caractersticas de la microbiologa y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (Ej. protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloracin de los preparados para aumentar el contraste con el fondo. Para obtener el mximo aprovechamiento de la observacin microscpica, debe poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composicin qumica de las diferentes partes de la anatoma bacteriana. Colorantes y mordientes. Los colorantes utilizados en Microbiologa son compuestos orgnicos que contienen grupos cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos1. La presencia de grupos cromforos en una molcula (grupos azo, nitro, etc.) no es suficiente para que sta acte como colorante, esto es que se fije a las estructuras a colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados auxocromos. Por ejemplo el 1,3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es un colorante. Sin embargo, si se reemplaza un H por un OH en el anillo bencnico, se obtiene el cido pcrico que tambin es coloreado pero al poseer un grupo disociable (auxocromo) acta como colorante. La distincin entre colorantes cidos y bsicos depende de la carga de la parte de la molcula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante cido y si es positiva se trata de un colorante bsico. Esta diferencia es importante debido a que, segn sean cidos o bsicos, los colorantes tendrn afinidad por diferentes zonas de la anatoma celular. Algunos colorantes utilizados comnmente en Microbiologa son fucsina bsica, cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.

1Salle, A. J. 1967. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc Graw-Hill. Book Company. N. Y. 1

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
En algunas coloraciones se utilizan sustancias capaces de formar complejos insolubles con los colorantes y que ayudan al proceso de coloracin: los mordientes. Ejemplos de mordientes comnmente usados son el Lugol, el cido tnico y algunas sales. Lgicamente, es de esperar que el colorante imparta su color a las estructuras celulares, sin embargo hay un fenmeno llamado metacromacia en el cual se observa un color diferente. Por ejemplo, pueden visualizarse corpsculos metacromticos rojos en ciertos preparados teidos con azul de metileno. Una explicacin que da cuenta de este fenmeno se muestra en la figura. El colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianinicas como los polifosfatos, se dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de absorcin2. Pueden observarse corpsculos metacromticos (grnulos de volutina) en varios gneros microbianos y en general, su presencia denota algn dficit nutricional en el medio de cultivo. PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA. PROCEDIMIENTO GENERAL. Los pasos fundamentales previos a una coloracin son: extendido, secado y fijado. a) Extendido: se coloca una pequea porcin de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el ansa en forma de valo. Para muestras provenientes de medios slidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobajetos. b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero. c) Fijado: la fijacin tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloracin as como tambin preservar la forma original de los microorganismos. El procedimiento ms comn es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta tcnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos ms suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetrxido de osmio, cido pcrico, etc. Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloracin, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaucin. Observacin en fresco y coloracin vital.

2Geneser, F. 1986. Histologa. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. 2

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una observacin en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diludos como por ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta tcnica podr observarse la morfologa y agrupacin de las bacterias as como tambin la movilidad. Observacin en fresco. Tcnica. 1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua y realizar una suspensin de la muestra en estudio. No extender. 2- Colocar un cubreobjetos. 3- Observar con poca luz. Coloracin vital. El procedimiento es similar al de la observacin en fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de solucin diluda de colorante en lugar del agua. Existen portaobjetos especiales para realizar estas observaciones en los cuales es posible colocar una mayor cantidad de lquido. Son los portaobjetos de Boettcher y de Ranvier. Coloracin simple. Esta coloracin permite la observacin de la morfologa y agrupacin de los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes ms utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de metileno. En general se utilizan en soluciones acuosas al 1 %. Tcnica. 1- Extender, secar y fijar por calor. 2- Aplicar solucin de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de la coloracin depende de la concentracin y del colorante utilizado. 3- Lavar con agua corriente. 4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin. Tincin negativa. Para esta coloracin, se utilizan sustancias que no penetran en la clula y por lo tanto se tie el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamao de las bacterias observadas por esta tcnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medicin de microorganismos. Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa. Con este mtodo pueden observarse morfologa y agrupacin as como tambin estraucturas extracelulares como la cpsula. Tcnica.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %. 2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma de valo. 3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersin. COLORACIONES ESPECFICAS. Coloracin de Gram. Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 18833 y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica. En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras que las Gram (-) se vern rojas. La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+) y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana4. La pared de las bacterias Gram (+) est constituda fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglicano (20-30 nm), que es un polmero de N- acetil glucosamina y cido N-acetil murmico. Las cadenas de peptidoglicano, se unen a travs de puentes formados por aminocidos, en arreglos que varan de una especie bacteriana a otra. En esta capa podemos tambin encontrar cidos teicoicos, formados por steres fosfato de glicerol o ribitol, y cidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los cidos teicoicos pero se hallan anclados a la membrana citoplasmtica. En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglicano es mucho ms delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composicin intervienen fosfolpidos, protenas y lipopolisacridos. En la figura puede observarse una representacin de las paredes celulares de organismos G(+) y G(-). Al tratar los preparados con cristal violeta y Lugol, se forman agregados entre el colorante y el mordiente5 que durante el proceso de decoloracin, no pueden ser extrados de las bacterias Gram (+) debido a la gruesa capa de peptidoglicano. En las bacterias Gram (-), la mezcla decolorante

3Bartholomew, J. and Mittwer, T. 1952. The Gram Stain. Bact. Rev. 16: 1-16. 4Poxton I. R. 1993. Procaryote envelope diversity. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 1 S-11 S. 5Beveridge, T. J. 1993. Currents trends and future prospects in prokariotic envelope research: a microscopist's view. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 143 S - 153 S. 4

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
puede atravesar fcilmente la capa de lpidos de la membrana externa y la delgadez de la capa de peptidoglicano presente, permite la extraccin de los agregados y, por consiguiente, del color violeta. Al ser tratadas con fucsina o safranina, las bacterias Gram (-) tomarn el color del contracolorante. En esta coloracin, el paso crtico es la decoloracin, ya que si se prolonga demasiado resultarn decoloradas an las bacterias Gram (+). Debe tenerse en cuenta asimismo, que como la integridad de las envolturas celulares resulta fundamental para lograr una buena diferenciacin, debe trabajarse en lo posible con cultivos jvenes. Es importante mencionar, que la clasificacin en Gram (+) y Gram (-) no puede aplicarse a todas las bacterias ya que hay algunas que no pueden colorearse con esta tcnica o para las cuales no tiene sentido esta clasificacin. Tcnica. 1- Extender, secar y fijar a la llama. 2- Cubrir durante 2 minutos con solucin de cristal violeta al 1%. 3- Escurrir y cubrir con solucin de Lugol* durante 30 segundos. 4- Escurrir y cubrir nuevamente con Lugol durante 30 segundos. 5- Decolorar con alcohol acetona y lavar con abundante agua. 6- Cubrir con solucin diluda de fucsina 0,1 % o safranina 0,5 % durante 2 minutos. 7- Dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin. *Lugol: Iodo, 1g; KI, 2g; agua, 300 ml. Bacilos cido alcohol resistentes. Coloracin de Ziehl - Neelsen.

La pared celular de los bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) est compuesta por una gran cantidad de lpidos tanto libres como covalentemente unidos: los cidos

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
miclicos y los micsidos6. La alta proporcin lipdica otorga a estas bacterias una gran hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para captar colorantes que hace necesaria la utilizacin de mtodos drsticos7. Se utiliza fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloracin con cido-alcohol y una contracoloracin con azul de metileno. La mezcla decolorante no podr extraer el colorante de los BAAR que permanecern rojas mientras que las dems bacterias se vern azules. Entre las bacterias cido-alcohol resistentes ms representativas se encuentran las pertenecientes al gnero Mycobacterium, al cual pertenecen los agentes etiolgicos de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae). Esta coloracin es de suma importancia diagnstica. Otro gnero de bacterias que se colorean mediante esta tcnica es Actinomyces. Tcnica. 1- Extender, secar y fijar a la llama. 2- Cubrir con solucin de fucsina fenicada (solucin acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %). 3- Pasar un hisopo de algodn embebido en alcohol por debajo del preparado hasta lograr la emisin de vapores. El preparado debe mantenerse caliente durante 5 minutos pero evitando que se produzca la ebullicin del colorante. Por consiguiente, no debe mantenerse el hisopo debajo del preparado sino colocarlo en los momentos en que cese la emisin de vapores. 4- Escurrir y lavar con agua. 5- Decolorar con cido ntrico diludo 1/3 y luego con alcohol. 6- Lavar, escurrir y cubrir con solucin de azul de metileno durante 2 minutos. 7- Lavar con agua, dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin. Coloracin de esporos. Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a travs de un proceso llamado esporulacin. Este proceso de diferenciacin, est codificado genticamente y permite a los microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean favorables para el desarrollo8. Los gneros de bacterias capaces de

6Poxton I. R. 1993. Procaryote envelope diversity. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 1 S-11 S. 7Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S.; Wood, W. B y Mc Carty, M. 1983. Tratado de Microbiologa. Editorial Salvat. Buenos Aires. 8Stanier, R. Y.; Ingraham, J. L.; Wheelis, M. L y Painter, P. R. 1991. Microbiologa. Editorial Revert. 6

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
esporular hasta ahora descriptos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina por lo cual la presencia de esporos en una bacteria es de gran utilidad taxonmica. Estructuralmente, los esporos bacterianos estn rodeados por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua. El crtex o corteza, est compuesto por un peptidoglicano que contiene menos enlaces cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta est formada por una protena del tipo de la queratina con gran cantidad de puentes disulfuro. Esta capa es fundamental para la resistencia del esporo a los agentes fsicos y qumicos. El exosporium es de naturaleza lipoproteica. Asimismo poseen en su composicin qumica, una alta concentracin de dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se encuentra en las clulas vegetativas, y que estara involucrada en la eliminacin de agua durante el proceso de esporulacin9. Las caractersticas antes apuntadas, dan cuenta de la resistencia de los esporos a los agentes fsicos y qumicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe aclarar que una vez coloreados son difciles de decolorar. En todas las tcnicas para colorear esporos se utilizan procedimientos drsticos. Describiremos las tcnicas de Dorner y de Moeller. Para la coloracin de esporos segn Dorner, se sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraer el colorante de todas las estructuras celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se vern los esporos rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La tcnica de Moeller utiliza cido crmico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear al esporo. La decoloracin se realiza con cido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul. Si bien es cierto que con otras coloraciones los esporos se vern incoloros, en algunos casos las bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporos y debe confirmarse su presencia mediante una coloracin especfica. Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporos es su posicin: terminal, subterminal o central, y si deforman o no a la bacteria ya que sern caractersticas que ayudarn en la clasificacin. Tcnica. a) Mtodo de Dorner. 1- Preparar una suspensin del cultivo a analizar en 1 ml de agua destilada. 2- Aadir 1 ml de fucsina fenicada (solucin acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la mezcla en un bao de agua hirviendo durante 10 minutos.

9Joklik, W. K.; Willet, H. P. y Amos, D. B. 1983. Zinsser Microbiologa. Editorial Mdica Panamericana. 7

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
3- Tomar una ansada del material y colocar en un portaobjetos. Aadir una ansada de una solucin acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de valo. 4- Dejar secar y observar con objetivo de inmersin.

b) Mtodo de Moeller. 1-Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol, encendiendo y dejando apagar. 2-Cubrir el preparado con solucin de cido crmico al 5% durante 5 minutos para sensibilizar. 3-Lavar y cubrir luego con solucin de fucsina fenicada en caliente durante 10 minutos ( calentar pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisin de vapores y volver a calentar ocasionalmente para mantener la temperatura). 4-Lavar con agua corriente. 5-Decolorar con cido sulfrico al 5 % o cido ntrico al 10 %. Puede terminarse la decoloracin con alcohol. 6-Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos. 7-Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin. Coloracin de flagelos. Los flagelos bacterianos son apndices celulares que estn asociados a funciones de locomocin. En cuanto a su estructura y composicin qumica, son similares en una gran variedad de bacterias. Estos apndices, estn unidos a la clula a travs de un cuerpo basal conectado a un gancho, que se contina con un filamento helicoidal. El cuerpo basal est constituido por un cilindro central y 2 4 anillos segn se trate de bacterias Gram (+) o Gram (-) respectivamente. Qumicamente, el cuerpo basal y el gancho estn compuestos por una variedad de polipptidos pero el filamento est formado por subunidades proteicas de flagelina que se disponen formando una helice alrededor de un centro hueco10.
M.; Heckels, J. E.; Winstanley, C.; Morgan, J. A. W. and Pickup, R. W. 1993. Flagella and pilli as antigenically variable structures on the bacterial surface. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 33 S-42 S.

010Saunders, J. R.; O'Sullivan, H.; Wakeman, J.; Sims, G.; Hart, C. A.; Virji,

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
La coloracin de flagelos se realiza fundamentalmente en los casos de bacterias mviles para las cuales la determinacin del nmero y posicin de estos apndices contribuya a su identificacin. En la figura se ilustran las diferentes disposiciones encontradas. Tcnica. 1-Colocar todo el material y las soluciones que se van a emplear en la estufa a 37C por lo menos 90 minutos antes de usarlos. 2-Hacer una suspensin del germen en estudio en agua estril termostatizada. 3-Hacer el extendido dejando correr una gota de la suspensin a lo largo de un portaobjetos limpio y desengrasado. Hacer por lo menos 3 preparados y dejarlos secar en la estufa. 4-Mezclar dentro del cuarto estufa: 5 ml de alumbre de potasio, 2 ml de solucin de cido tnico y 2 ml de cloruro mercrico*. 5-Agitar bien y agregar 1- 1.5 ml de Verde de Malaquita 5 %. Mezclar bien y mantener en estufa 2 minutos con agitaciones peridicas. 6-Filtrar de inmediato con papel de filtro plegado y dejar otros 2 minutos. 7-Agitar y colocar sobre los extendidos a razn de alrededor de 2,5 ml por portaobjetos. 8-Dejar actuar la mezcla colorante. Como el tiempo vara segn el germen, dejar actuar de 5 a 9 minutos. 9-Lavar con agua destilada termostatizada. Puede utilizarse azul de Loeffler** para colorear el resto de la bacteria. Escurrir, dejar secar y observar con objetivo de inmersin. * alumbre de potasio (.24 H2 O) 10,5 %; HgCl2 6 %; cido tnico 20 %. ** azul de metileno 0,3 g, etanol 30 ml, KOH 0,01 g y H2O 100 ml.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas UNLP

Coloracin de espirilos. Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general espirilos aunque debe hacerse una aclaracin: los espirilos son bacterias con morfologa helicoidal y un cuerpo bastante rgido, que se mueven mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la misma morfologa que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen flagelos internos 12 . Las espiroquetas estn formadas por un cilindro protoplasmtico constituido por el citoplasma, la regin nuclear, la membrana citoplasmtica y la pared celular. El cilindro protoplasmtico se halla rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa externa en cuya composicin intervienen protenas, lipoprotenas, polisacridos y fosfolpidos13. Alrededor del cilindro protoplasmtico se encuentran un nmero variable de flagelos periplsmicos que, segn la especie, puede variar entre 2 y ms de 100. La composicin qumica de los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos. A diferencia de otras bacterias mviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios de alta viscosidad a travs de un movimiento de sacacorchos. Entre los gneros de bacterias espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos nombrar Treponema (el Treponema palidum es el agente etiolgico de la sfilis), Borrelia y Leptospira. En general, estos microorganismos son demasiado delgados para poder ser visualizados mediante microscopa ptica y por lo tanto deben engrosarse. En la tcnica de FontanaTribondeau, se usa cido tnico como mordiente y luego se realiza una impregnacin argntica con nitrato de plata amoniacal (solucin de Fontana). Es importante que los lavados se realicen con agua destilada libre de cloruros ya que de otra manera precipitara cloruro de plata. En los casos en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse con lquido de Rouge (cido actico- formaldehdo-agua). Al aplicar esta tcnica de coloracin, se vern los microorganismos marrn oscuro sobre fondo amarillento. Tcnica. 1- Extender la muestra a examinar sobre un portaobjetos. 2- Deshemoglobinizar con lquido de Rouge (cido actico glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml). 3- Lavar con agua corriente. 4- Fijar vertiendo alcohol sobre el preparado, dejando escurrir y encendiendo el alcohol. Apagar inmediatamente. 5- Cubrir con la solucin de cido tnico (5 %) y calentar con hisopo encendido hasta emisin de vapores. Mantener la emisin de vapores durante 30 segundos cuidando que no hierva la solucin. 6-Lavar con abundante agua destilada. 7- Cubrir con solucin de Fontana* en fro, mover el preparado hasta que tome color castao claro. Calentar y mantener emisin de vapores durante 15 segundos. 8- Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin. *Preparacin de la solucin de Fontana: Colocar solucin de nitrato de plata al 5 % y agregar, gota a gota, una solucin de amonaco al 5 % hasta opalescencia. Seguir agregando amonaco hasta clarificacin de la solucin y finalmente agregar solucin de nitrato de plata hasta ligera opalescencia. La solucin debe prepararse en el momento de usarse.

212Tortora, G. J.; Funke, B. R. y Case, C. L. 1993. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia S.A. 313Basualdo, J. A.; Coto, C. E. y de Torres, R. A. 1996. Microbiologa Biomdica. Editorial Atlante Argentina
R. L. S.

10

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas UNLP

Coloracin de cpsulas. Tcnica de Novelli modificada. Algunas bacterias son capaces de formar por fuera de la pared celular, una envoltura polimrica llamada cpsula que las protege de la fagocitosis e interviene en fenmenos de adherencia a diversos sustratos. Pueden encontrarse cpsulas de variada composicin qumica: polmeros de glucosa y cido glucurnico ( Streptococcus pneumoniae), polmeros de cido Dglutmico (Bacillus anthracis) y polmeros mixtos de protenas y carbohidratos (Bacillus megaterium)14. Las cpsulas pueden observarse como un halo alrededor de las bacterias cuando se realizan tinciones negativas con nigrosina o tinta china pero pueden colorearse especficamente. La tcnica de Novelli, utiliza un colorante especfico para las cpsulas glucdicas que es el Azul Alcin. Para teir la bacteria se utiliza fucsina. Se vern bacterias teidas de rojo rodeadas de la zona capsular azul. Tcnica. 1- Hacer un extendido del material sobre un portaobjetos, secar y fijar a la llama. 2- Cubrir con solucin de Azul Alcin* durante 2,5 minutos. 3- Lavar y escurrir completamente el agua o, mejor an, dejar que se seque. 4- Cubrir con solucin de fucsina diluida (0,1 %) durante 1 minuto. 5- Lavar y secar. * Azul Alcin: dilucin 1/10 en agua de una solucin al 1 % en alcohol. Coloracin de la zona nuclear. Tcnica segn Robinow. En las clulas procariticas, que no poseen membrana nuclear, el cromosoma constituye la llamada zona nuclear o nucleoide. Al no existir un ncleo propiamente dicho, la basofilia del ARN es tan marcada como la del ADN pues se hallan en idntico estado de condensacin; por lo tanto es necesario eliminar el ARN con la ayuda de una ribonucleasa o aprovechando las diferencias de sensibilidad a la hidrlisis cida, debidas a las distintas estructuras de estos cidos nucleicos. Una hidrlisis controlada con cido clorhdrico 1 N a 60C da buenos resultados pero debe evitarse tratamientos muy enrgicos ya que de otra manera se hidrolizara tambin el ADN15. Es conveniente utilizar clulas en activa divisin para una mejor visualizacin. El extendido se realiza mediante una tcnica especial llamada impresin y la fijacin se lleva a cabo con vapores de cido smico o sumergiendo el preparado en metanol. El colorante utilizado es el Giemsa y la zona nuclear se ve rojo violceo. Tcnica. 1- Diseminar sobre la superficie de una caja de Petri con gar nutritivo, 0,1 ml de un cultivo en caldo de 2 a 8 horas de desarrollo. Este tiempo de incubacin depende de la bacteria. 2- Inmediatamente o incubando 3 4 horas en estufa a 37C, cortar con un bistur trozos de gar de aproximadamente 1 cm2 . 3- Invertir el trozo de gar sobre un portaobjetos bien limpio y hacer la impronta deslizndolo sobre el mismo. Dejar secar a temperatura ambiente.

414Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S.; Wood, W. B y Mc Carty, M. 1983. Tratado
Microbiologa. Editorial Salvat. Buenos Aires.

de

515Robinow, C. and Kellenberger, E. 1994. The bacterial nucleoid revisited. Microb. Rev. 58: 211-232. 11

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas UNLP

4- Fijar el preparado sumergindolo en metanol durante 10 minutos o bien sometindolo a la accin de vapores de cido smico durante 5 minutos. 5- Hidrolizar el ARN introduciendo el preparado en cido clorhdrico 1 N a 60C durante 8-10 minutos. Sumergir inmediatamente en agua destilada 4 5 veces para evitar que contine la hidrlisis. 6- Escurrir el agua y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa diluda 1/100 en buffer fosfato pH 7 . Dejar actuar 15 - 30 minutos (el tiempo depende de la bacteria). 7- Lavar con abundante agua corriente, secar entre dos papeles de filtro y observar con objetivo de inmersin. EL MICROSCOPIO OPTICO. El tamao de los organismos objeto de la Microbiologa, hace necesaria la utilizacin de instrumentos apropiados llamados microscopios. Los instrumentos comnmente empleados son los microscopios pticos compuestos que constan de un sistema mecnico y un sistema ptico16. El sistema mecnico est compuesto por diferentes tornillos de ajuste que sirven para enfocar la imagen y obtener una adecuada iluminacin. El sistema ptico est formado por tres series de lentes: condensador, objetivo y ocular. El condensador hace que la fuente de iluminacin proyecte sobre el objeto, un haz de luz adecuado; el objetivo forma una imagen aumentada del objeto que es captada por el ocular que, a su vez, presenta la imagen al ojo del observador. Existen dos caractersticas importantes de los sistemas pticos: el aumento y la resolucin. Se entiende por aumento, a la relacin entre el tamao de la imagen y el del objeto. Para obtener el aumento total, debe multiplicarse el aumento del objetivo por el del ocular. La resolucin es la distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se distingan separados y est relacionada con la capacidad del sistema ptico de visualizar detalles. La resolucin puede calcularse con la d= k. n.sen ecuacin: donde k es una constante que depende de la estructura del objeto y de la naturaleza de la luz que lo ilumina. Sus valores oscilan entre 0,5 y 0,8 pero suele tomarse un valor de 0,65, es la longitud de onda de la luz, n es el

616Geneser, F. 1986. Mtodos histolgicos. Captulo 2 en Histologa. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. 12

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas UNLP

ndice de refraccin del medio en contacto con el objetivo y es la mitad del ngulo del haz de luz captado por el objetivo. Obviamente para observar detalles deben lograrse pequeos valores de d. El producto n.sen , se denomina apertura numrica y queda claro que en el aire (n=1), no podr ser mayor que la unidad. Con el objeto de lograr mejores resoluciones pueden colocarse, entre el objetivo y el objeto, sustancias con ndices de refraccin mayores que el aire como por ejemplo aceite de cedro. La resolucin quedar determinada entonces no slo por el objetivo, sino tambin por el condensador y el diafragma que debe ajustarse de manera de cubrir con luz el campo visual. Es importante aclarar, que el ocular contribuye al aumento pero no a la resolucin ya que es incapaz de mejorar la imagen que le presenta el objetivo. La iluminacin es uno de los puntos claves de toda observacin microscpica y debe prestarse atencin a su correcto ajuste. El sistema de iluminacin que se utiliza actualmente es el de Khler y consta de una lmpara, una lente frente a la lmpara y un diafragma. Tambin el condensador es parte del sistema de ajuste de la iluminacin y posee una lente y un diafragma para regular el paso de luz. En realidad lo importante de este sistema es que, si se regula adecuadamente, se obtiene un campo de observacin homogneamente iluminado aunque sea pequea e irregular la fuente de luz.. Para regular la iluminacin17, primeramente debe enfocarse el diafragma de la lmpara sobre el plano del objeto. Para esto se enfoca un preparado cualquiera y luego se cierra casi totalmente el diafragma de la lmpara manteniendo totalmente abierto el diafragma del condensador. En estas condiciones, se regula la altura del condensador de manera de enfocar ntidamente la imagen de los bordes del diafragma de la lmpara. La posicin del condensador as fijada, no debe modificarse a partir de este momento. Para regular la apertura del diafragma del condensador debe abrirse totalmente el diafragma de la lmpara y cerrarse el del condensador. Posteriormente se quita el ocular y, observando por el tubo del microscopio, se regula la apertura del diafragma del condensador de manera que la lente del objetivo quede cubierta de luz en un 90 %. Finalmente, se coloca el ocular y se cierra el diafragma de la lmpara hasta que la imagen de sus bordes llegue justo hasta el borde del campo visual. Siguiendo los pasos mencionados, se lograr una correcta iluminacin para cada par objetivo-ocular utilizado y se conseguir un mximo aprovechamiento de la capacidad de resolucin de cada objetivo. Es una prctica muy comn, utilizar la altura del condensador y los diferentes diafragmas para regular la intensidad lumnica, sin tener en cuenta que una vez ubicados en la posicin correcta no deben moverse pues se modificara la apertura numrica y por consiguiente la resolucin. La intensidad de la luz se debe regular a travs de filtros o modificando la potencia de la lmpara. Enfoque de preparados. Para la observacin de preparados microbiolgicos se utilizan normalmente objetivos de inmersin. Los pasos a seguir para enfocar un preparado con este tipo de objetivos son los siguientes: 1) Colocar una gota de aceite de cedro (n=1,5) sobre el preparado. 2) Acercar el objetivo al preparado lo ms lo ms posible pero observando desde afuera, es decir sin observar por el ocular.

717Meynell, G. G.

y Meynell, E. 1969. Bacteriologa Experimental. Teora y Prctica. Ediciones Omega. Barcelona.

13

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas UNLP

3) Con el tornillo macromtrico y mirando por el ocular, alejar el objetivo del preparado lentamente hasta lograr un enfoque aproximado. 4) Realizar un ajuste fino con el tornillo micromtrico.

14