Instituto Federal de Educaao,Cincia e Tecnologia do c e Par a

Biof sica Prof.MSc: Charles da Rocha Silva Carga Horria: 60 hs a Mtodos Biof e sicos de estudos das solues: co Espectrofotometria, cromatograa e Eletroforese 8 de Julho de 2009
Introduo ca Os sistemas biolgicos so formados o a por um nmero extremamente elevado u de componentes, um extrado de f gado pode ter mais de 500 enzimas, o plasma sagu neo possui mais de mil substncia, ena + tre ons como Na , K , HCO3 ; peguenas molculas como glicose, uria, cree e atina, colesterol, polissacriodes, l a pedes de fundacomplexos, polipptides etc. E e mental impotncia estudar a composio a ca qualitaviva e quantitativa desses sistemas biolgicos. o Os mtodos biof e sicos de estudo permitem separar e identicar esses componentes, alm de permitir estudo des e suas propriedades de estrutura e funao. c Voltaremos nossa ateno para os princica pais mtodo: Espectrofotometria, Croe matograa e Eletroforese. 1. Espectrofotometria Medir basicamente chacoalhar o obe jeto sob estudo, e ver o que acontece. Uma maneira boa de cutucar molculas, com e e radiaao eletromagntica (luz). A palavra c e espectrofotometria designa um mtodo de e anlise baseado em medidas de absoro de a ca radiaao eletromagnetica. A tcnica que c e e 1 aqui se descreve est restrita a uma pea quena regio de comprimento de onda da a radiaao eletromagntica, que corresponde c e a luz vis vel ou ultra-violeta: E a faixa entre aproximadamente 200 e 700 nm (1 nanometro = 109 m, 700 nm = 0,7 m.), a radiaao fora desta faixa no detectada c a e pelo no sistema visual. Podemos dizer ento que espectrofotomea tria consiste em utilizar a radiao eletroca magntica para estudar soluoes. Num e c procedimento bsico, um feixe de energia a atravessa a soluao, e a sua absoro nos c ca fornece informaoes sobre a qualidade e c quantidade dos componentes do sistema. Conceitos Fundamentais A energia de uma onda eletromagntica e e dada por: E = nh.f, (1) n representa o nmero de fton, esta u o equaao nos diz que a radiaao eletroc c magntica apresenta um comportamento de e part cula (corpuscular) esta equaao foi apc resenta pela primeira em 1900 por Max Planck (F sico alemo), h representa a cona stante de Planck e f a frequencia da onda. e Na Figura 6 mostrado o espectro eletroe magntico. e

A velocidade de uma onda eletromagntica c constante no vcuo e vale 3 x e e a 8 10 m/s, no entanto quanto a luz se propaga em um meio diferente, sua velocidade ree duzida aumentando assim seu comprimento de onda , j que a frequncia da onda no a e a muda com a mudana do meio. c c = .f. (2)

A faixa do v sivel varia entre 400 a 750 nm, nessa faixa , ns experimentamos uma o gama de sensaoes visuais denominadas de c cores. Abaixo de 400 nm temos o ultravioletra (UV) e acima de 700 temos o infravermelho. A todo momento somos banhados por ondas eletromagnticas de todo este espece tro. O sol, cujas radiaoes denem o meio c ambiente no qual ns, como uma espcie, o e evolu mos e nos adaptamos, a fonte pree dominante. A radiaao incidente pode sofrer reexo, c a refraao, espalhamento ou ser absorvida c pelo material. Disso resulta que somente uma parte da radiaao incidente transc e mitida atravs do material. O processo de e absorao ocorre ao n molecular. Assim, c vel como acontece num tomo, cada molcula a e caracteriza-se por possuir n veis de energia moleculares quantizados, os quais podem ser ocupados pelos eltrons das molculas. e e Por outro lado, a radiaao carrega enc ergia, sendo que o valor dessa energia depende do comprimento de onda da radiaao. c A absoro da radiao se d quando ca ca a a energia que ela transporta igual e ` diferena entre dois n a c veis de energia da molcula; nessa situaco, a energia e a da radiao transferida para a molcula e ca e e ocorre a chamada absorao de radiao. c ca Como molculas de substncias difere a entes tm diferentes n e veis moleculares de energia, ocorre que cada substncia aba sorve a radiao de maneira peculiar. Dito ca de outra forma, os comprimentos de onda que uma certa substncia absorvero so a a a caracter sticos da sua estrutura e outras 2

substncias absorvero outros comprimena a tos de onda. Se levantarmos dados referentes da intensidade de luz absorvida por uma substncia, em funao dos comprimena c tos de onda da radiaao, estaremos obtendo c uma curva chamada espectro de absorao c da substncia. O importante que cada a e substncia tem um espectro caracter a stico e, desse modo, se queremos identicar um material desconhecido, poderemos faz-lo a e partir de sua curva de absorao, comparada c com curvas de substncias conhecidas. a Uma vez conhecido o espectro de absorao de uma dada substncia pode-se c a tambm determinar em que quantidade essa e substncia se apresenta em uma soluo a ca analisada. Isso feito atravs da medida da e e intensidade de luz que atravessa a amostra Figura 1, como veremos a seguir.

Figura 1: Reexo, refrao, espalhamento e aba ca

soro fazem com que a luz que sai da amostra ca tenha uma intensidade menor do que a luz que incide.

Para se fazer experincias e medie das espectrofotomtricas utiliza-se luz e monocromtica (monos = um; cromos = a cor ). A luz monocromtica formada por a e uma unica frequncia. Um pergunta que e devemos fazer : Por que necessrio e e a usar luz monocromtica? a Existe duas razes para a utilizao de o ca luz monocromtica (luz MC): a qualitaa tiva e a quantitativa.

1.1 Razo Qualitativa a O unico modo de saber quais as cores (comprimentos de onda), que so absorvia dos, passa luz MC de vrios comprimene a tos de onda, uma de cada vez, atravs da e soluao teste Figura 2. c

Figura 3: Absoro da luz no monocromtica. ca a a

A luz espria 55% transmitida. u e

1.3.1 Espectrofotometria de Absorao c Consiste basicamente em fazer passar uma onda eletromagntica por uma soluo e e ca medir sua absoro. ca Instrumentao ca A experincia mostra o comportamento e da luz MC usada. Por exemplo para se medir a soluo teste, deve-se usar luz MC ca verde, que 90 % absorvida Figura 2, e proe porcionar grande sensibilidade a medida. a ` A luz amarela e a violeta no so adequadas a a para a realizaao da medida pois os seus c percentuais de transmisso muito elevado. a e 1.2 Razo Quantitativa a Quando se est medindo a luz absorvida, a a passagem de energia no absorvida ir a a prejudicar a leitura dando uma medida imprecisa. Esta luz no absorvida, cona hecida como luz espria, est representado u a na Figura 3. Podemos observar na Figura 3 que o componente MC da luz mista fortemente abe sorvida (90 % - Absoro, 10% - transca misso), falseando completamente o resula tado. E fundamental usar luz MC que seja a maior parte absorvida, para determinar a presena de uma substncia em soluo. c a ca 1.3 Tipos de Espectrofotometria 3 De maneira global, um espectrofotmetro o tem trs partes: e Fonte de radiao normalmente uma ca e lmpada incandescente. Existe tambm a e um controle de intensidade da radiaao, c mas fundamental um meio de controle e do comprimento da onda (por exemplo, ltros ou monocromatizadores como prismas ou grades de difraao (passagem de c uma onda por uma abertura com dimenses o comparveis ao comprimento de onda da a mesma)). No nosso aparelho, pode-se selecionar o comprimento de onda da luz incidente atravs de um controle manual. e Amostra deve estar contida em um recipiente apropriado do tipo tubos de ensaio ou cubetas. Como normalmente medidas comparativas so feitas (uma medida com a s solvente, outra com solvente e soluto), o as cubetas vm emparelhadas. As cubetas e so fabricadas o mais igual poss a vel. Assim, no resultado nal, somente o soluto faz uma contribuio ` absorao. ca a c Detetor um elemento sens e vel ` raa diaao e que pode nos dar uma medida c da intensidade da mesma; varia desde fotomolculas at o prprio olho. Na Figura 4 e e o

Figura

2:

Absoro ca

diferencial

de

luz

monocromtica a

temos uma ilustraao do funcionamento de imisc c veis, a fase mvel e a fase estacionria. o a um espectrofotmetro. o A grande variedade de combinaoes entre c fases mveis e estacionrias a torna uma o a tcnica extremamente verstil e de grande e a aplicaao. c O termo cromatograa foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilizao ca e atribu a um botnico russo ao descrever da a suas experincias na separaao dos compoe c Figura 4: Esquema do Espectrofotmetro. o nentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de ter de e petrleo (fase mvel) atravs de uma colo o e una de vidro preenchida com carbonato de 1.3.2 Espectrofotometria de Emisso a clcio (fase estacionria), ` qual se adia a a a c Neste tipo de espectrofotometria, o sis- cionou o extrato, levou ` separaao dos tema biolgico excitado, e emite luz. A componentes em faixas coloridas. o e Este provavelmente o motivo pelo qual e luz emitida pelos materiais nos fornece a e e impresso digital do material. Pode-se a tcnica conhecida como cromatograa a (chrom = cor e graphie = escrita), poreconhecer e dosar substncias: a dendo levar a errnea idia de que o pro` o e Fotometria de chama cesso seja dependente da cor. Apesar deste estudo e de outros anteriores, que Usada exclusivamente para ctions a tambm poderiam ser considerados precure (N a+ , Ca+2 eK + ) que quando so aquecia sores do uso dessa tcnica, a cromatograa e dos, atravs de um aquecedor apropriado, e foi praticamente ignorada at a dcada de e e emitem luz. Este mtodo bastante usado e e 30, quando foi redescoberta. A partir da , para determinar a presena de ctions no c a diversos trabalhos na rea possibilitaram a material estudado. seu aperfeioamento e, em conjunto com os c avanos tecnolgicos, levaram-na a um elec o Fluorimetria vado grau de sosticao, o qual resultou ca ca A excitaao feita com luz, geralmente no seu grande potencial de aplicao em c e muitas areas. UV (devido sua alta frequncia), e a luz e A cromatograa pode ser utilizada para a emitida palas substncias que se excitam a e ca ca medida, em um detector apropriado. Este identicao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para o mtodo de estudo no deteriora a amostra e a ca estudada. Por isso muito utilizado para a puricao de compostos, separando-se e a a a determinaao de vitaminas, neurotrans- as substncias indesejveis e para a sepc araao dos componentes de uma mistura. c missores e outras substncias uorescentes a (substncia que emitem luz quando exci- As diferentes formas de cromatograa poa dem ser classicadas considerando-se divertada). sos critrios, sendo alguns deles listados e abaixo: 2. Cromatograa A cromatograa um mtodo f e e sico Classicao pela forma fsica do sisca qu mico de separaao. Ela est fundamenc a tema cromatogrco. a tada na migraao diferencial dos compoc nentes de uma mistura, que ocorre devEm relaao ` forma f c a sica do sistema, ido a diferentes interaoes, entre duas fases a cromatograa pode ser subdividida em c 4

cromatograa em coluna e cromatograa planar. Enquanto a cromatograa planar resume-se ` cromatograa em papel (CP), a a cromatograa por centrifugaao (Chro` c matotron) e a cromatograa em camada ` delgada (CCD), so diversos os tipos de a cromatograa em coluna, os quais sero a mais bem compreendidos quando classicados por outro critrio. e

quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constitu por um l a da quido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. o Suportes modicados so considerados sepa aradamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao. ca Classicao pelo modo de separao ca ca

Classicao pela fase mvel empreca o Por este critrio, separaoes croe c gada matogrcas se devem a adsorao, partiao, a ` c c troca inica, excluso ou misturas desses o a Em se tratando da fase mvel, so trs mecanismos. o a e Para se ter uma viso a os tipos de cromatograa: a cromatograa mais ampla dos diferentes tipos de crogasosa, a cromatograa l quida e a cro- matograa, os mesmos esto dispostos no a matograa supercr tica (CSC), usando-se diagrama da Figura 5. Dentre os vrios a na ultima um vapor pressurizado, acima de tipos de cromatograa, especial nfase ser e a sua temperatura cr tica. A cromatograa dada ` cromatograa em camada delgada a l quida apresenta uma importante subdi- (CCD), a cromatograa l ` quida clssica e a viso: a cromatograa l a quida clssica de alta ecincia (CLAE) e a cromatograa a e ` (CLC), na qual a fase mvel arrastada tograa gasosa de alta resoluao (CGAR). o e c atravs da coluna apenas pela fora da e c gravidade, e a cromatograa l quida de alta ecincia (CLAE), na qual se utilizam e fases estacionrias de part a culas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de a alta presso para a ebuliao da fase mvel. a c o A CLAE foi inicialmente denominada cromatograa l quida de alta presso, mas sua a atual designao mostra-se mais adequada. ca No caso de fases mveis gasosas, separaoes o c Figura 5: Representao esquemtica dos diferca a podem ser obtidas por cromatograa gasosa entes tipos de cromatograa Espectrofotmetro. o (CG) e por cromatograa gasosa de alta resoluao (CGAR). A diferena entre os c c dois tipos est na coluna. Enquanto na a 3. Eletroforese CGAR so utilizadas colunas capilares, nas a A Eletroforese, ferramenta amplamente quais a fase estacionria um lme de- utilizada no meio cient a e co, uma tcnica e e positado na mesma, a CG utiliza colunas baseada na separaao de part c culas em de maior dimetro empacotadas com a fase um determinado gel de acordo com sua a estacionria. a massa e carga. A eletroforese pode ser utilizada para separaao de diversas molculas c e Classicao pela fase estacionria uti- orgnicas, como lipoprote ca a a nas, prote nas, lizada RNA e DNA. As molculas de interesse e bioqu mico apresentam cargas eltricas, e Quanto ` fase estacionria, distingue-se grande parte das pesquisas atuais em bioloa a a nas e entre fases estacionrias slidas, l a o quidas e gia estuda aspectos ligados `s prote 5

aos acidos nuclicos. Essas macromolculas e e tm uma caracter e stica bastante importante: apresentam vrias regies (grupaa o mentos) com cargas eltricas. e As prote nas apresentam tanto grupamentos com cargas positivas quanto grupamentos com cargas negativas, provenientes dos aminocidos que as constituem. As cara gas so resultado da ligao ou perda de a ca prtons. Os prtons (H+) so o o a ons com carga positiva. Alguns grupos so neutros a e ao receberem um prton, tornam-se posio tivos ( o caso do grupo -NH2, que, ligandoe se a prtons, convertido a -NH3+). Outo e ros grupos so neutros mas, ao perderem a um prton, tornam-se negativos ( o caso do o e grupo -COOH, que se converte em -COO-). Estas perdas e adioes dependem do pH do c meio em que a prote se encontra. na A somatria das cargas de todas as o regies carregadas de uma prote confere o na uma carga total a prote ` na. Como foi assinalado, essa carga total da prote pode na variar dependendo do pH do meio. J os cidos nuclicos (DNA e RNA) apa a e resentam uma situao mais simples do que ca as prote nas porque s apresentam as caro gas negativas dos grupos fosfato. Outra caracter stica interessante dos acidos nuclicos e que surge de sua estrutura polimrica repete itiva que a razo entre o nmero de e a u cargas negativas e o nmero de atomos u que compem o acido nuclico pratio e e camente constante, independentemente do tamanho ou da seqncia de nucleot ue deos da molcula. e As cargas eltricas migram quando e submetidas a uma diferena de potenc cial eltrico, uma propriedade das cargas e eltricas em soluo que quando uma e ca e diferena de potencial aplicada a soluao c e ` c ou seja, quando os plos de uma bateria so o a conectados a soluao - as cargas positivas ` c so atra a das pelo plo negativo e as cargas o negativas, pelo plo positivo, deslocando-se o em direo a eles. Os acidos nuclicos, como ca e so carregados negativamente, migram em a 6

direao ao plo positivo. c o Essa migrao das cargas quando ca so submetidas a uma diferena de poa c tencial chamada de eletroforese. A e eletroforese normalmente realizada com e suportes, apesar de corresponder a uma migraao de cargas em soluo, a eletroforese c ca no normalmente realizada em solues a e co puras. Isso porque as solues esto suco a jeitas a uma srie de inuncias f e e sicas do ambiente que lhes causam perturbaoes. c Dentre as inmeras fontes dessas peru turbaoes destacam-se as ondas mecnicas c a e at mesmo movimentos de convecao do e c l quido pelo aquecimento da soluao cauc sado pela aplicao da diferena de potenca c cial. As perturbaoes fazem com que a c eletroforese, nessas condioes, seja um proc cesso muito pouco reprodut vel, com as cargas de mesma natureza no migrando juna tas, mas sim, dispersas. Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais perturbaoes a eletroforese so minic ` a mizadas. Esses sistemas utilizam matrizes r gidas - conhecidas como suportes - com as quais a soluo interage e que diminuem as ca perturbaoes mecnicas e os movimentos c a de convecao no l c quido. Existem dois tipos bsicos de suportes: os suportes de a papel e os suportes de gel. Nos suportes de papel, a natureza hidrof lica da celulose faz com que se forme uma pel cula de l quido sobre o papel. Como a interaao entre a fase aquosa e a c celulose intensa, a soluao sofre pouca ine c uncia de fatores mecnicos. Exemplos de e a suportes desse tipo o papel de ltro e o e acetato de celulose. J nos suportes de gel, a soluo a ca ca retida dentro dos poros da trama do pol mero que compe o gel. Dessa forma, a o soluao tambm pode ser poupada de turc e bulncias e conveces. Exemplos de sue co portes desse tipo so os gis de agarose e a e poliacrilamida. Vimos que vrios fatores f a sicos, como

c c choques mecnicos e alteraoes na temper- em um lugar diferente da soluao no espao a c atura, podem afetar drasticamente a mi- entre o plo positivo e o plo negativo. o o graao de cargas em soluo. Esses fatores c ca Referncia Bibliogrca e a podem ser contornados pelo uso de suportes para a eletroforese. Porm, outros fatores e Heneine, Ibrahim Felippe, Biof sica podem inuenciar o movimento das cargas, bsica, Editora Atheneu, So Paulo 2005 a a principalmente a velocidade de migraao de c macromolculas, mesmo se utilizamos sue Ana Luiza G. Degani, Quezia B. Cass, portes. Trs fatores se destacam: a intensie Paulo C. Vieira; QU IMICA NOVA NA dade da diferena de potencial aplicada, a c ESCOLA Cromatograa N 7, MAIO carga total da macromolcula e o tamanho e 1998 (Referncvia pricipal) e da macromolcula. e David Halliday, Bobert Resnick, Jearl A principal motriz para o movimento das Walker. T tulo: Optica e F sica Moderna, cargas em soluao a diferena de potenc e c LCT,20074 cial. Conseqentemente, quanto maior a inu tensidade da voltagem aplicada, maior ser a a velocidade com que as cargas se dirigem ao plo de sinal oposto. o Por outro lado, se considerarmos a carga total da macromolcula, quanto maior for e essa carga, maior ser a atraao eleta c rosttica da molcula pelo plo de sinal a e o oposto. Dessa forma, quanto maior for a carga da macromolcula, maior ser a sua e a velocidade de migrao eletrofortica. ca e O tamanho da macromolcula tambm e e inui decisivamente na sua velocidade de migraao. Isso porque existe um compoc nente friccional entre a macromolcula, o e solvente, o suporte e os demais ons em soluao que faz com que quanto maior c a macromolcula, menor a sua velocidade e de migrao em direao ao plo de sinal ca c o oposto. A eletroforese pode ser usada para separar molculas com carga: Tendo em e vista todos os fatores inuentes sobre a Boa Sorte e que sejamos dedicados para alcanarmos nossos objetivos!!!!!!!!!! c migraao eletrofortica, consideremos uma c e soluao em que haja uma mistura de macroc molculas com tamanhos e/ou cargas difere entes. Ao aplicarmos uma diferena de c potencial a esta soluo, as molculas mica e graro com velocidades e/ou direoes difera c entes, dependendo de seus tamanhos e cargas. Ao nal de um dado intervalo de tempo, ao desligarmos a fonte da diferena c de potencial, cada tipo de molcula estar e a 7

Figura 6: Espectro eletromagntico. e