Pruebas de identificacin bacteriana.

Prueba del indol.

1. Introduccin: El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. 2. Principio: La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del pdimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. 3. Medios y reactivos: -Caldo triptofano -Peptona o digerido pancretico de casena 2 g -Cloruro de sodio 0,5 g -Agua destilada 100 ml -Reactivo de Kovacs -Alcohol amlico o isoamlico 150 ml p-dimetilaminobenzaldehdo 10 g HCl conc. 50 ml 4. Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. 5. Interpretacin: El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

Rojo de metilo Voges Proskawer

1. Principio: Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa.

Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. 2. Medios y reactivos -Caldo RM/VP -Peptona 7 g -Glucosa 5 g -Fosfato dipotsico 5 g -Agua destilada 1 L -pH = 6,9 0,1 -Indicador de pH rojo de metilo: Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95 Agua destilada 200 ml -Revelador VP alfa-naftol (solucin al 5% en etanol 95) Solucin de KOH al 40% en agua destilada 3. Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismos en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfanaftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. 4. Interpretacin: La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

Utilizacin de citrato
1. Introduccin: La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. 2. Principio: La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6 3. Medios y reactivos: Medio de Simmons -Fosfato dicido de amonio 1 g -Fosfato dipotsico 1 g -Cloruro de sodio 5 g -Citrato de sodio 2 g -Sulfato de magnesio 0,2 g -Agar 15 g -Azul de bromotimol 0,08 g -Agua destilada c.s.p. 1 L -pH = 6,9 4. Procedimiento: Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. 5. Interpretacin: El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul.

Test del KIA

1. Introduccin: En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de Kligler") y proporciona varios datos fisiolgicos importantes para determinar si un

microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o cido sulfhdrico. Es un medio que requiere un procedimiento de inoculacin especial. 2. Principio: Se utiliza este medio en lengeta para la diferenciacin de los bacilos entricos gram-negativos segn la fermentacin de dos azucares (glucosa y lactosa) y la produccin del sulfuro de hidrogeno. 3. Medios y reactivos: Medio KIA -Extracto de carne 3 g/l -Extracto de levadura 3 g/l -Peptonas 15 g/l -Lactosa 10 g/l -Glucosa 1 g/l -Tiosulfato sdico 0,3 g/l -Sulfato ferroso (Fe2+) 0,2 g/l -Rojo de fenol 0,024 g/l -ClNa 5 g/l -Agar 12 g/l -pH 7,4 4. Procedimiento: Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA con el asa de siembra. La siembra se har de la siguiente manera: sembrar la superficie por estra y sembrar la parte interna del medio por picadura. Incubar 18-24 h a 37C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio. 5. Interpretacin: La acidificacin del medio a causa del proceso de fermentacin se pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que solo fermentan la glucosa que se encuentra a una concentracin 10 veces inferior a la lactosa, si bien producen viraje a amarillo, este solo se produce en la parte vertical, mientras que la superficie inclinada restablece el color rojo por oxidacin del cido. El color amarillo obtenido en la acidificacin del medio, producida por la fermentacin de la lactosa, es persistente. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar sulfuro ferroso, presentan un precipitado negro. La produccin de gas se observa por la formacin de burbujas e incluso por la rotura del medio.

Test de la reduccin de nitratos

1. Introduccin: Su finalidad es la de determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre. 2. Principio: En esta prueba se detecta una respiracin anaerobia: la que utiliza nitrato como aceptor final de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen los nitritos a productos gaseosos ( N2 y N2O). Las enzimas responsables de ambas reducciones se denominan nitrato y nitrito reductasa, respectivamente. 3. Medios y reactivos: Caldo Nitratado -Extracto de carne 3,0 g -Peptona 5,0 g -Nitrato de potasio 1,0 g -Agua desionizada 1000,0 mL -pH 7.0 Reactivo de Griess -Solucin A cido sulfanlico 8,0 g cido actico 5N 1000,0 mL -Solucin B -Naftilamina 5,0 g cido actico 5N 1000,0 mL 4. Procedimiento: Caldo Nitratado: Disuelva y esterilice en autoclave por 15 minutos a 121C (15 libras de pre-sin). El medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos despus de su incubacin se aaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretacin final.

5. Interpretacin: La aparicin de una colo-racin rosada o roja indica que los nitratos han sido reducidos a nitritos.

Prueba del manitol

1. Principio: Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo. 2. Medios y reactivos: -Extracto de carne 3 g/l -Peptona 5 g/l -Sc. Azul de Br Timol (16%) 1 ml -Hidrato de carbono 5 g/l -pH final: 7 4. Interpretacin: El resultado sera positivo si aparece el color amarillo.

Prueba de movibilidad
1. Principio: Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles. 2. Medios y reactivos: Medio semisolido con 3,5 g/l de agar. 3. Interpretacin Las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron.