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Plant sclerophylly, nutritional stre and hability to resist to gall inducti synergism and biodiversity
G. Wilson Fernandes1, Marco Antonio A.

In the vein of discovering pattern within taxonomically and environmentally defined boundaries, we have explored the relationships between galling insects and their host plants for the past 15 yr. General patterns are evident within the range of our sampling. Galling species richness increases with decreasing elevation in Arizona (USA), Minas Gerais (Brazil) (Fernandes and Price 1988, 1991, Lara et- al. 2002), and Indonesia (Fernandes and Lara 1993). Within localities at the same elevation, galling species richness is higher in xeric (dry, arid) than in mesic (humid, moist) habitats. Furthermore, gall-inducing species richness is higher on plant populations in habitats under more stressful conditions such as dry and nutrient-deficient habitats (Fernandes and Price 1992, Gonalves-Alvim and Fernandes 2001). The pattern can be extended on a more global scale to latitudinal gradients, where galling species richness reaches a strong peak in regions dominated by selerophyUous vegetation, in the mid-latitudinal ranges 2445 N or S, or the environmental equivalents (Price et al. 1998). Galling insect larva e manipulate the plant tissue around them, changing the allocation of nutrients and secondary compounds. Nutrients are concentrated in the nutritive tissue in contact with the

larva, while secondary COnlp1l111 marily tannins, are transptu I I ternal tissues, which crearc II barrier around the gall. Thi 11" cal interaction between tlw ganism and the host planl I the success of the galling li 11," nutrient-stressed, harsh, 11111 phyllous environments (Fcruun 2000). Moreover, tough sdl I leaves tend to be long-liv xl, I ans they are less likely to ah I withou t the galls. N on II" I galling herbivores have evolv, " ty to create a green island 1111'11 and therefore can survivc on abscised host organs.

Habitat

and Galling Su

11I11.nt-stressed i environI(IW at lower rates and nm entrations of quantitaI luwcver, the population hlp nnd richness of many 111 l'l species are higher IIIW under harsher con11 jlo .itive correlation behlll'ss and the habitat's 1I!l1nutritional stress has I IlId .pendent of latitude li 11\l lifc zones of the Ser1"llillhonha Valley, and in 1IIIIion of Trs Marias 111 1997, Gonalves-Al'!lI! 001). More speci1I were found on plants I tlllIl1inated by cerrado 111111 plants in adjacent li, , (11TH Cip. Even in do 1I111I'l'slsof Minas Gerais 111li 'r in harsher habiI I 11.2002). Mortality hnl! uus were lower beuurnbcr of natural eneI' I/,Inllce to galling inh uuoran desert (USA) .111111' Minas Gerais Bra1I\l1 l'rice 1992).

Fernandes and Pric ( li' proposed a hypothesis 011IIi I causes of greater galling 11I in harsher habitats based 1111 patterns of greater galliru; I' ness in xeric habitats thuu 111 mesic habitats. In addition, cies richness was higher II " des than at higher altiuuh I ted to more water/nutri '111 I wer elevations). The availlhillt and nutrients in the s 11,1111 conditions are importam 1I affect the growth and 1'11111

, Ecologia Evolutiva de Herbvoros Tropicais/DBG, CP 486, ICB/Universidade Horizonte, MG, Brazil. E-mail: gwilson@icb.ufmg.br

Federal de Minas

11'1 1i

1111 plnnts are the main li IIlp istrian fields (ro11 11', cerrado (Brazil), I IIlId fynbos (South 11 Fl'I'nandes and Pri11111'1al. (1998) consi'ndh'lll of gall species 11t\lti prirnarily by seleh 111li lhe pattern of hiIlIlu I 111xeric habitats 111111 wns the most conI I ti 'Hcribed. 111 1111, . me adaptati1111 crvation inelude

evergreenness, long life span for plant tissue, and selerophylly. Consequently, sclerophyllous plants contain high carbon and low nitrogen, which result in structures such as thick cell walls and tough leaves. When in excess, aluminum, iron, and rnanganese are regarded as responsible for lower soil fertility. These elements increase soil acidity, and decrease the availability of critica I plant nutrients, such as phosphate and potassium, Because of their enormous effect on plant's nutrient uptake and physiology, their availability and dynamics influence the vegetation growth forrns and distribution. Otherwise, organic matter plays the role of a nutrient reservoir in the soil, and it can also reduce the negative effects of heavy metais on plants. As a trait related to soil poverty, high polyphenol contents are expected to appear at higher concentrations in selerophyllous plants (Salatino 1993). Phenolic compounds, such as tannins and lignins, result from alternative routes in the formation of proteins, when there is inadequate availability of phosphate and nitrogen compared with carbon fixed by photosynthesis. We argue that these traits may favor the galling habit. Selerophyllous plants are likely to be predictable in time and space, increasing the probability that gallers will colonize them and survive on their long-lived leaves. Nutrients are manipulated to be concentrated in gall tissue, therefore compensating for the low nutrient content of leaves. On the other hand, nutrients become toxic to gallers in plants of high nutrient status, and colonization would be restricted in these plants. In addition, plant pathogens are relatively inactive under drier and hotter regimes. Gallers are also apparently able to circumvent plant constitutive defenses as they generally attack young, undifferentiated tissues, there539

fore avoiding tissue hardness, lower nutritional and water contents, and higher content of secondary chemicals typical of older leaves. The galled tissue in which the gaUing larva feeds is also phenolfree. Hence, gaUers are able to circumvent the host plant defenses and manipulate their tissue to obtain a rich, nontoxic food source and protection against environmental harshness. Furthermore, because their sclerophyllous host plants contain high phenolic levels, gallers may occupy a niche relatively free of diseases and enemies which would eat the gall because of its concentrated nutrients (Fernandes and Price 1991, 1992). Plants under higher temperatures and nutrient deficiency in harsher habitats may not be able to respond fast enough with induced defenses, therefore favoring gall induction. For instance, plant hypersensitivity may be diminished at higher temperatures (Fernandes 1990, Fernandes et aI. 2000). A large proportion of galling species richness in several physiognomies of the cerrado was explained by variations in the concentration of magnesium, potassium, iron, and CEC. Nitrogen, magnesium, and potassium deficiencies may block protein synthesis and result in the accumulation of amino acids, as weU as reducing starch formation in plants (Rhoades 1979), perhaps providing a better food source to galling insects. Besides, plants that grow continuously have young tissues throughout the year, and this trait is characteristic of slow growing, low stature, and evergreen plants, like those of harsher environments. Therefore, the host plant meristem may be an important facto r in dynamics of insect-host plant relationships. Perhaps the slow growth, in addition to the higher temperatures may have acted synergistically to diminish the plants' probability of eliciting a hypersensitive response to galling.
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SIMPSIO

Sclerophylly may not 1111' nization by gaUing herbivuu insects attack soft, youn 1 11iI , l cally active tis sues (Rohf I ,I hence avoiding the plant di I , conferred by tissue tougluu quality. In fact, plant scl '11'1,1 represent protection a!{1I11I enemies after gaU devel 111111111 gh plants living in dry and WIII' may respond more slowly 11' on, their induced der 'li hypersensitivity, may 11\11I, and/or quick enough to 1i1l1",1 tissue taken over by thc 1111111 therefore increasing thc "li ,I gall development. Hel1c', 111 lective pressure causcd 11 I parasites, pathogens, anel 11111I11 on galling insects in habluu rophyllous plants are aburul " ces the pattern ofhigh ri 'li", insect species in this v' I IIIIi Given the present r 'NIIIt postulating that the g OH"IJ,I, species and their biodlv I 11 driven plant nutritional qll ,111 lity to resist to galling, Ir11 I and consequent effcct "fi dynamics and natural '111111' diated by habitat intrin 11 'I'
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DE GALHA) I N I' ESS AND HABIL/TY TO RES/ST TO GALL INDUCTlON: SYNERGISM AND B/ODIVERS/TY

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Diversidade de plantas e diversidade de galhado!es - ~ bu por padres na interaao animal ... no Rio Grande do Sul
Milton de Souza Mendona Jr,'. Ric~rdo Viel & Hosana Mana Fons

artrpodos galhadores VII 111 A idia de que as plantas ho~pedeiextremamente especfic H lI" ras influenciam a riqueza d~ guilda de 2005), esta hiptese leva 1'111 artrpodes galhadores tem diversas foro que cada espcie .d ' 11111 mas na literatura. Por exemplo, Lawton senta um nicho potencl[\11'111 I (1983) e depois Strong, Lawt?n, & Soudores. thwood (1984) exploram a hiptese .esNo entanto, os galhadl1l1 trutural, argumentando qu.e espe~lal.uma guilda, no uma aSHI'IIII,1 mente insetos herbvoros serIam mais rigrupo taxonmico de 11111 III cos em plantas mais complexas estr~tuter distintas relaes evolu ralmente, e assim rvores hospedar~am gicas com as plantas de d 11111 I fauna mais rica que arbustos e herbacesim diferentes grupOS 111 1111 as. Price & Fernandes (1988, 1991) pla~tas podem influen 111I abordam esta questo diretamente a? galhadores de formas di I111 utilizarem a amostragem estrutural, (diReyes et al. (2003) ar!!11I1I I ferenciando herbceas, arbut~s e arvocorrelao entre riquczn 111 I1 res) em seus trabalhos sobre nqueza logalhadores mais comph I cal de galhadores. " mitido pela hiptese du I 1111 A "hiptese da riqueza de plantas tas: a presena de cert , I1111 simplesmente argumenta que quanto tas ocasiona diferenl 'H I 1\ maior o nmero de espcies ~e pla~ta riqueza de galhadorcs 1'111 presentes em dado local!v.egetaao,maior com outros. Isto foi d 1I1I I " ser o nmero de especles de galhadotrlia, onde MyrtacctI ' 1'111 res que deveremos encontrar (Fernancalyptus em particular \11 I des & Price 1988, Wright & Samways em espcies (Blanch (' \ 1996). Algumas fontes encontram este Blanche 2000). Outro I " padro na natureza (Wright & Samways ditos superhosts (Vcllllllllll 1996 Wright & Samways 1998, Blan2003), espcies de Iltllllll che 2001, Cuevas-Reyes et al, 2004, nmero de espcies 1111111110 I Dalbem & Mendona, no prelo), encausa, sua distribu iuu li" I quanto outros trabalhos no (Fernandes tm uma influncia d' I & Price 1988; Blanche 2000; Cuevasversidade da fauna d' 1'1111 Reyes et al. 2003). Considerando que
Gentica/UFPel. E-mail: milton.mendonca@ig.com.br

ta, matas de restinga e um mosaico campo/mata; no segundo, mata paludosa e mata de restinga; e no terceiro mata ombrftla em diferentes estgios de recuperao. Trilhas fixas cortando diferentes tipos de vegetao foram escolhidas e percorridas por amostra dores durante 1h30min, repetidas vezes ao longo de pelo menos um ano (5 amostragens trimestrais em ltapu e 4 em ltapeva, 8 amostragens bisazonais no Morro Santana). Todas as galhas encontradas eram registradas, fotografadas e as hospedeiras identificadas. De um total de 282 morfotipos de galha amostrados, 40 famlias de plantas foram identificadas hospedando galhas nas trs reas do Rio Grande do Sul. importante ressaltar que nem todas as plantas amostradas com galhas foram identificadas at agora. Uma primeira anlise qualitativa mostra que as famlias de plantas encontradas como detendo maior nmero de espcies de galhadores so comuns a outros trabalhos da regio Neotropical. Em nossas amostragens, Asteraceae, Myrtaceae, Sapindaceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Flacourtiaceae, Lauraceae, Nyctaginaceae e Myrsinaceae, por ordem, so as famlias mais bem representadas. Gagn (1994) lista para a regio Neotropical Fabaceae e Asteraceae como as famlias mais ricas em Cecidomyiidae (Diptera) galhadores, sendo Myrtaceae apenas a quinta famlia. Solanaceae, registrada como a stima famlia em Cecidomyiidae galhadores por Gagn (1994), em nosso trabalho foi rara, sendo a 26" em riqueza de galhadores. Fabaceae provavelmente foi pouco representada por nossas amostragens no contemplarem matas altas, presentes apenas no norte do RS; alm disso, aqui todos os txons galhadores foram considerados, no apenas Cecidomyiidae.
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Comparaes da cornposrao de morfotipos de galhadores entre as reas amostradas e entre as vegetaes revelam valores significativos para ambos os fatores (anlise de similaridade - ANOSIM - testes multivariados de permutao), ou seja, as trs reas tem faunas diferenciadas entre si, mas os tipos vegetacionais tambm so diferenciados (a grande maioria dos morfotipos de mata paludosa no so os mesmos encontrados em restinga, etc.). Se utilizarmos as famlias de plantas ao invs de morfotipos para tecer as mesmas comparaes, vemos que as concluses acima no se alteram, ou seja, tanto rea geogrfica quanto vegetao diferem quanto s famlias de plantas que abrigam galhas, mesmo com uma perda estatstica considervel n! comparao. Por exemplo, matas paludosas tem uma proporo de Asteraceae muito elevada (14 dos 40 morfotipos) e quase nenhuma Myrtaceae, ao passo que as demais vegetaes tem sempre Myrtaceae como a famlia mais rica. Nas restingas e vegetao em recuperao as Asteraceae so as segundas em riqueza de galhadores (basicamente devido s vassouras, espcies resistentes a condies xricas e tpicas de sucesses em fase inicial), prximas a Myrtaceae. Entretanto, nas matas ombrftlas as compostas so apenas as stimas, com Sapindaceae e Fabaceae abaixo das dominantes Myrtaceae. Isto fcil de interpretar uma vez que as matas ombrfilas do RS, especialmente do noroeste do Estado e regio metropolitana, so conhecidas como "matas de mirtceas". Ao analisar as espcies de planta preciso ter cuidado pois um nmero considervel delas no foi identificado at este nvel por falta de material reprodutivo. Assim, gneros como Mikania (Asteraceae) e Eugenia (Myrtaceae) apresentam muitas galhas associadas, mas
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no temos identificao (' I" no entanto levanta uma '1(11 11, riqueza de galhas csl 11 I poucos grupos dentr li I I" seja, gneros ricos em '~I'II I ticular espcies abundnuu I neros poderiam represcnlru 101 onde a especiao de tllll I grediu mais, justament ' 1'111 de bioqumico-fisiolgi ' I 1111 prximas e facilidade til' I tre galhadores destes I IXIIII As espcies de plantn I com os maiores nm 1'0 d de galhas foram Guapiru "1'/ taginaceae) e Myrciaria 1"/1 11 taceae), com 7 difer '1111 cada. Isto confirmaria 111111 I cionada acima acerca ti ' ItI tas hospedeiras terem 11111 mero de espcies de 1-\111" perhosts). No entanto, I' 11 cies esto dentro de '"11 I estando realmente cliHlllIl1 I tras em termos da auuu I que abrigam: a curva di di 1 galhas por espcie d ' pllllll senta uma clara dornin 11I I es mencionadas sobr li ti I divaricata e Sebastiauu I' tm 5 galhas cada, Calou ria sylvestris tm 4 cadu . I' cies tm 3 galhas ea 111 ria mais adequado fI ti 11 I 1111 de importncia de ti" 111' cies, gneros e famflln I saltar algumas poucn I1'I' as demais em impon 111 I 1 A pesquisa sobre I 111 galhadores artrpodc 11111' cipiente no Brasil, 1'('ti "10I descrever seja em Il'IIIII' ou dos padres ccollll'h botnico capital no I 111. " ses padres e neccssru 111' cessos que os geram, ('111 vamente. Sem levUI'111I1

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Importncia da autenticidade da matria-prima vegetal na qualidade de fitoterpicos


Clarice Azevedo M
mundial de plantas medicinais estimado em mais de 60 bilhes de dlares americanos anuais pela OMS (Organizao Mundial da Sade), levando a entidade a publicar diretrizes para boas prticas de agricultura e coleta, na tentativa de dar sustentabilidade para a atividade e diminuir a extino de plantas nativas de vrios pases (BAGOZZI, 2004; WHO, 2003). A dificuldade de obteno de algumas espcies em larga escala tem causado a sua substituio por outras parecidas, que so aceitas no mercado mundial, muitas vezes por falta de identificao (BAGOZZI, 2004; DREW & MYERS, 1997). Plantas medicinais "in natura" so uma importante fonte de recursos teraputicos utilizados pelas populaes de pases pobres ou em desenvolvimento, na forma de chs ou preparaes galnicas simples (WHO, 1998; 1999). As comunidades tnicas que preservam sua cultura de utilizao de plantas medicinais e que esto prximas de florestas e/ ou de recursos da biodiversidade representam uma grande fonte para bioprospeco com interesse econmico pelas grandes indstrias farmacuticas que buscam substncias bioativas (BALICK & COX, 1999; BLUMENTHAL et ai., 1998; CHAPELA, 1996). Muitas destas informaes possibilitam a produo de medicamentos de grande valor no mercado, muitas vezes de consumo auI

o cultivo

mentado por atuao da 111 111 NES, 2003), o que resulln , extensiva de plantas naivn I LA, 1996). O interesse por planl I li' tem crescido muito nos llll' que demonstrado pel ) 11,11 mento do volume de v IId I produtos a base de plan I " Estados Unidos e Amri ' I I 11 NES et aI., 2005). Est 11f" gerado uma grande dcnuunl dos tcnicos para avaliru I segurana e eficcia, rc 1111' expressiva quantidad di I11 pecializada, principalmouu I comercializadas na E 11I"1' ' Unidos (BARNES et a/, 'I 2004; BLUMENTH!\I., 'li CLOCHA & FI,(' I NEWALL et al., 2002; /'1111 VIEW, 2002; WHO, (111' WICHTL, 2001; BL MI 2000; BLUMENTIIAI WHO, 1999; PDR, 111" monografias farrnacop 11" I de qualidade (F. BRA,' I MARTINDALE, 200 AMERICAN HERHAI II POEIA, 1997-2002; MIII BAL PHARMACO fI( li I FARMACOPIA 1'1" 2002; THE lAPAN 1\10/ I POEIA, 1996-20QO; 11111 outras) .

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548

SIMPSI040.

BIOPROSPEC!!OSUSTENTAVfI

7tRIA-PRIMA

VEGETAL NA QUALIDADE

DE FITOTERAplCOS

549

SIMPSI040

Coleta e identificao de plantas para estudos de bioprospeco


bloprospeco

As floras e listagens

Estadual das Fontes do Ip 11111 localiza-se o Instituto, '1\1 desde a publicao do prillll I o Brasil possui uma das mais ricas to de monografias feito '\lI I I floras do planeta e certamente abriga alta estudo da famlia Astera ' '111 percentagem das mais de 250.000 esmonografia produzida '111 'I pcies de plantas (Brifitas, Pteridfitas, transcorrerem 20 anos. A I'I!'I Gimnospermas e Angiospermas) j desgmica da Ilha do Card HII, I1 critas pela cincia. pio de Canania, litoral sul lI! A diversidade vegetal brasileira aincujo primeiro volume saiu 1'111 I da est muito aqum de ser plenamente do que o ltimo publicad( I, 11 I conhecida, mesmo se considerarmos 11 em 2005, ainda n (\11111 apenas o levan,tamento de suas espcies. rie, j toma cerca de I I 1111' O prprio Estado de So Paulo, trilhado considerando-se o temi (lll! I' por Botnicos desde o sculo XIX e consem incluir-se o perodo tllI \I tando com tradicionais centros de estucampo. O estudo da "li 1\1Iti dos de Botnica, ainda nos surpreende [uria, tambm no litoral 111 com vrias novas espcies, como podelevou, desde o inci ti11 mos apreciar nos volumes da Flora Fa1989, at a publical ti I 11 nerogmica do Estado de So Paulo. 2001, cerca de 12 an s, Ali Floras ou mesmo as aparentemente gmica do Estado de - 111 I'" simples listagens florsticas, demandam que envolve vrias institu I num pas de alta biodiversidade como o ado em 1993, tem puhl 1111 nosso, anos de trabalho de campo e lamente 4 volumes, o 111111 1 boratrio, em instituies onde a pesquisa 2005, os quais no in '1111 111 no atividade exclusiva, mas juntamespcies do Estado ' I\ I se a ela a docncia e o atendimento ao 13 anos. pblico. Esses trabalhos til' 11 Estudar em detalhe a flora de algucluem o estudo de "11\111' ma regio significa, na maioria das vede espcies de plantas. I 111 zes, baixa produtividade em termos de financiados pela prprln ln artigos cientficos por vrios anos na caralmente os oram 111 I \I reira de seus autores. prpria exigncia r '\II 11' Para um clculo de quanto tempo leva res de maior pro lutlv tI",1 o estudo de uma flora, podemos tomar de publicaes, tm li ' 1\1 como exemplo os trabalhos desenvolvidesenvolvimento, me 11111 I dos pelo Instituto de Botnica, todos em munidade Botnica, 1111111 I' reas de Floresta Atlntica: A do Parque
florsticas
, Ins Cordeiro (Instituto de Botnica da Secretaria do Meio Ambiente/SP). E-mail: iS3ndllllil

, ',tlllI ti recursos ora1111' 11I1Ii~sofrendo pres1 e 'I d' f mente, mesmo 11111111\1 amplas reas mar Idll ob o ponto de visIt I' islcm sequer lista,li11' I f1 ra de cada uma I '"11 vao do Estado I1 1111/ .squisadores tm P 1,,,1111 linhas de pesquisa 1111111 a Bioprospecd -lus ,1111111pcrinca como x 1111111 atuando nesta 1111 I 1111111 discorrer de um I 1111 11111u biopropeco d lI,tllIlI ulc ao desenvolI 11i'd' ensaios relati'1"1 p mitem testar a 1111111 getais. Assim v 111111 ipida possvei I' I 111111 espcies vede 111111. antitumorais "IIS, I '1111111 possveis com~ hlllll'lI~ para o trataI 1/11 simer". 1I1"lId,'de desenvolvi1 111'1 .-se, entretanI 111111 os extratos -r-sc llllililil"N suficientes e '1111111 Dando-se vcl. I '11t1pU'de Farmalli 11 " )umicos pas, I IIllIis intensiva1 1111, claro que IN, 'I I IIlpl" existiu, mas I 1111111111 incipiente, 11111111 Botnico 111 ' 11111 um nmero "111' 1 1111 ,' ispcies em d

Grandes pr oje t os d e Bioprospeco . . encontram-se em desen vo I' E t d d vimento no s a o e So Paulo, a grande maioria ?eles com patrocnio da FAPESP ~so instituiu um sub-programa d~~~r~~~ rograma BIOTA - o Bioprospecta. r Ao ~ontarem suas equipes, esses g upos . d tiveram de recorrer a nuc eos tra'I di ., IClonaIS e Botnica Tax onomica, que h' Ja con .eclam suficientemente a flora de determinadas reas e poderiam dar sup~~t~ nas fas;:s. de obteno e identifica .. as especres, ou seja, que haviam utilizado muito do tempo d e suas carrei. ras no conhecimento da biodiversidade.
A

A metodologia e laboratrio

no campo

bi O trabalho de campo em projetos de iopropeco e, a principio, muito seme' ., . Ih ante ~o. desenvovido em levantamentos florsticos e fitossociolg ICOS,ou seja . _, sao n~cessarios botnicos taxonomista~ expenentes, ou no caso de reas j demarc~d~s para estudos fitossociolgicos com indivduos plaqueados, pessoal trei~ nado para coletar material necessrio ?ara os extratos e testemunh Identificaes. o para as So incrveis os problemas com que nosdelParamos nas primeiras expedies d e co eta! A .comear do armazenamento do matenal vegetal para obt - d tratos _ E . . ~nao os exdi _ m. minha pnmeira grande expe iao, animados com os grandes re sul tados q ue po derf enamos obter, talvez atuma nova droga para o combate ao cncer, coletamos mais de 100 ,. de minha especies, Eu parte, preparando o material . . t d t estemunho da maneira tradicional que o os os botnicos conhecem e sas' ' m pren, que apos foram secas em estufas Os ramos e folhas a serem utilizados para os extratos, entretanto, foram perigosamente arma zena d os em sacos plsti-

cos comuns, alis, pretos, detalhe primoroso, que apressaram ainda mais o aquecimento e apodrecimento das folhas e ramos que chegaram ao laboratrio para anlise e que tiveram de ser descartados. Outro problema: O cruzamento das informaes: A identificao de colees pelo nome e nmero de coletar metodologia usual para os botnicos, mas no para os Bioqumicos e afins. Convencer os colegas de que impossvel identificar o p das folhas dos extratos obtidos e que o material a ser processado deveria ter a mesma identificao, foi um verdadeiro calvrio, que alis de uma forma ou outra prolongase at hoje. Em vrias expedies procuramos colocar rtulos com o nome e nmero do coleto r nos sacos, agora de rfia, para identificar os extratos. claro que muitas vezes estes acabaram sendo perdidos e muitos materiais tiveram de ser descartados.
Identificao Identificao testemunho dos extratos x das colees

da, bem como um bom n '(\1 , I te e por vezes o auxJi li' 111 " I pecialistas em famlias 1111 processo de identificao di li' tempo varivel, muitas v hora vrias colees poli 111 minadas, porm, depcn I 11I1, culdades inerentes a umu 11111111 nero, um dia no o sul I I 111 determinao de um (ill ," Sem mencionar os probl \1'111 , cos que por vezes deparu " I sejam eles nomenclaturnl 1111 I circunscrio de um I I 1111 Alm da identifica 11I, I, I responsvel pela manut 'li 10 lees, o que significu IJII passaro a fazer parte du !li' , do ser devidamente mllll\ I' I
Considerando os resultados obtido

De maneira geral as folhas e ramos so submetidos secagem ao ar livre ou em estufas em baixa temperatura, no mais de 40C, sendo posteriormente modos para a obteno dos extratos. Da os procedimentos variam conforme a atividade a ser testada. Quando uma determinada atividade encontrada em um extrato, passa-se fase seguinte de fracionamento do mesmo que culminar com a purificao da substncia responsvel pela atividade e anlise da composio de sua molcula. A identificao botnica parte, na maneira usual, do nvel de famlia e gnero, para os quais de maneira geral existem chaves disponveis. Para a identificao em nvel especfico necessria uma bibliografia bem mais especializa552
SIMPSI040.

Atualmente, dep i ti, metodolgicos iniciais, 11 I ,11 seguimos estabelec 'I' "I 111 bsicas para as col 111 d, I o, mas claro qu I IItI , , mos com materiais I ' 11111111 pessimamente herb I'i~111" sar disso, ainda ne ' I 111111 tados no Herbrio, ai '111 I to despreparo em pl'llIl til! cos de coleta. J depois das pl' 111 I as com projetos d H (' I I" cessria distncia I "111111 I sar os ganhos dei '~ 111,11" asmo inicial em d N '( II 1111 , cos teis para a hUIIIIIIII" tra-se bastante redlll d, ter considerado d ,di , I agulhas so sempre dll, encontradas num p 1111111 sejam numerosas. Minha principal 1" , quanto participa II 111
BIOPROSPEC OSUSTEN1AVI/

\ Raciocinando sobre este problema, cheguei concluso de que mesmo aos nossos crebros mais iluminados falta o conhecimento sobre o desenvolvimento da cincia e os custos necessrios para mant-Ia. Apenas assim, poderia entender o porqu de ser mais fcil para uma agncia de fomento autorizar a compra de um aparelho sofisticado para anlise de molculas, que atende apenas a um grupo seleto de pesquisadores, mas negar a construo de um prdio para um herbrio, que atende a toda uma comunidade cientfica. Por ltimo, no gostaria de deixar uma mensagem negativa, conclamando os botnicos a recusarem-se a participar de projetos aplicados, mas definitivamente, influenciar uma atitude mais agressiva dos mesmos, no sentido de serem mais participativos e opinantes no momento da formulao desses projetos junto aos rgo financiadores, uma vez que os mesmos no podem ser realizados sem a nossa colaborao. E principalmente aprender a cobrar o preo justo pela colaborao da identificao em projetos aplicados.

SlMPSI040

o valor
I
I I

do conhecimento botnic na repartio de benefcios da bioprospeco

'I

,I ,

qll ' pode ser utilizada

di 'osmticos, na prote-

,111biorremediao etc., 11111dimenso ainda maiI ,dI! plantas na economia


I

11

Um dos maiores desafios na formulao de contratos de bioprospeco tem sido identificar os detentores de direitos sobre os resultados potenciais derivados do uso comercial de produtos de valor que venham a ser obtidos a partir de organismos vivos oriundos de ecossistemas naturais. Regra geral, decises sobre tais direitos tm sido incorporadas nos termos dos contratos, com base na contribuio proporcional, de qualquer natureza, que tenha sido essencial na gerao do produto final a ser colocado no mercado. Esta tem sido, por exemplo, a poltica adotada pela Glaxo Wellcome (ten Kate & Laird, 1999). Para esses autores, pode ser considerado justo um acordo que assim parea para todos os envolvidos na negociao. O desafio j se coloca antes mesmo de serem iniciados os detalhes da negociao, com a identificao das partes do contrato. Dentre os candidatos esto os proprietrios rurais, os cientistas e os chamados detentores do conhecimento tradicional, conhecimento este geralmente difuso e ancestral, mas que tem sido fortemente defendido em todas as esferas de discusso (e.g. Mathias & Novion, 2006). De acordo com Bystr m et aI. (1999), a maior parte da populao mundial (2/3 a 3/4) corresponde a nodetentores de direitos sobre os recursos genticos da biodiversidade. Para esse

autor, o maior grupo do di 11111 dos proprietrios rurais, I 1"1 povos indgenas, e o m '11111 responde aos cientistas di 11, pblicas ou privadas, qlll, I' menor nmero, formam I1 I' de fazer a conexo enl rl' I1 " ores e, por isso, mer "111 ,I negociao da repartiu d I Os cientistas, de mQ(1I 1 I I remunerados ou inclufdo 111 quando atuam diretam '1111I sas laboratoriais e no d " I 11, I produtos, mas muitas Vl'~ tos cientficos estratgi 'U I a bioprospeco tm sidll 11111 que sejam devidarncnt ' 11' , nessa situao que g I' dlllllll tra o conhecimento bOI 1111, Dentro do ampl II'IJII I mos que tm sido alvo 1111,1,I as plantas merecem I li" I Embora apenas CCI''li di mundial tenham si 10 111111 I gao farmacolgicu, 1I I dos medicamentos' 1II" cado so oriundos du 11111111 celos, 2006), alim '11111111110 'I da ordem de 32 bilh")' di ,I 2001). Nos Esta I II"tol produtos farmacutk-u ) almente tm princfplu 1111 de plantas (Sant s, 1(11111' lembrar que a indu 11 I I no a nica que rll~," 10 I

di '1111 fundamental imporI I1 utilizao em projetos 11 cI plantas, o conheci, "rlll I m sido, regra geral, 11" 111111 nem como presmtc, , I' muito menos em con," I1de benefcios. 11 "'1111'aqui a mobiliza""111111' botnica para uma " 11 VIII r do conhecimen"" 'Jll'Ospeo e a discusI I nruinhos para viabilizar IlIflUllldo transparentes e , 11 lroca da informa'"11111) sem, contudo, obs,I 1IIII'I1lotecnolgico do 11111111 preciso recoIa, "11 Irabalhos dependen11111 1110sobre plantas que ""'1111mtais ou estratgiI' d,'!li prospeco. Aqui I" , 1'lIlrc outros, a iden-

mento botnico, quando existe, faz-se pela transferncia de recursos para equipar laboratrios, custeio das expedies de coleta e obteno de amostras, por exemplo. Os defensores desse procedi-, mento argumentam que essas instituies so, geralmente, pblicas e o salrio dos pesquisadores pago pelo contribuinte, no cabendo remunerao direta ao detentor do conhecimento. No meu entender, a no remunerao direta dos pesquisad,ores envolvidos na obteno de produtos e processos inovadores, passveis de proteo propriedade intelectual, uma questo a ser tratada com prioridade nas ICTs, como estmulo produo tecnolgica e promoo da interao entre os setores pblico e privado. ' As clusulas contratuais entre os pesquisadores e as instituies a que pertencem, por si ss, muitas vezes.inviabilizarn a remunerao do pesquisador, sendo a instituio detentora dos eventuais direitos resultantes de qualquer produto ou processo que venha a ser desenvolvido com base no conhecimento dos pesquisadores. Outras vezes, o assunto no tratado nos contratos e a interpretao vaga. No caso dos- pesquisadores cientficos do Estado de So Paulo, a prestao de servios, devidamente remunerada, permitida por lei, desde que no configure acumulao. Porm, tem sido sistematicamente desestimulada. Existem, a meu ver, dois caminhos possveis e adequados para a remunerao do conhecimento botnico utilizado do desenvolvimento tecnolgico: um deles, o de facilitao das pesquisas de bioprospeco, na forma de prestao de servios, tais como localizao de populaes de plantas no campo e identificao de amostras, entre outros. O desafio, nesse primeiro caminho, seria atribuir valor para os diferentes ti-

I" I I'N (taxonomia), a 10I 'fI"'1 ," s no campo (fil'lli 1/1propriamente dita, 111111/11111 populaes das I 111 li explorao sus1111 1,11,11potencial de do1111 11 rticultura, silvi1111 11111111) conhecimento 1"1," dus plantas com fiI (1'1 botnica). n , 11111' indstrias e as ns 11'Il e tecnologia 11V/I mais comum ente 111' 11irao do conhe111 I "1111 projetos de bio11I111" uplo levantamenu 11111112000). Nessas ( ""III'IIfl do conheci-

, Floresta Estadual deAssis, Institutolorestal F deSoPaulo, Postal Caixa 104,19802-970, Assis, !I 111,11 I I'

NICO NA REPARnO

DE BENEFIClOS DA BIOPROSPECO

555

pos de trabalho segundo critrios tais como a demanda de tempo e esforo, o grau de dificuldade .de obteno da informao, a raridade do conhecimento envolvido ou, at mesmo, segundo a importncia estratgica da informao ou conhecimento para um eventual projeto de bioprospeco. A vantagem dessa alternativa para os interessados na informao por parte da indstria que os botnicos seriam excludos de contratos de repartio de benefcios e de eventuais direitos de propriedade intelectual obtidos. Para os botnicos sem vnculo empregatcio viria a ser o surgimento de um novo nicho no mercado de trabalho, com remunerao imediata e certa. Para aqueles vinculados a instituies, a remunerao adicional seria um forte motivador para a aplicao de seus conhecimentos em benefcio do desenvolvimento tecnolgico do pas. O segundo caminho, que pode ser visto como um obstculo a mais para as negociaes de contratos de bioprospeco, seria incluir os botnicos e suas instituies, quando couber, entre os detentores de direitos quando da repartio de benefcios derivados do uso comercial de produtos da biodiversidade, tais como o recebimento de roya/ties sobre as vendas de produtos protegidos por direitos patentrios. Para os botnicos e suas instituies, seria um investimento de risco, pois a probabilidade de uma pesquisa de bioprospeco de plantas resultar em um sucesso de mercado geralmente baixa e a remunerao pelo conhecimento utilizado tem grandes chances de ser nula. Porm, ainda que baixa, a probabilidade de um produto derivado de plantas resultar em milhares de dlares em roya/ties existe e a deciso de investir nesse risco ou no deveria ser do detentor do conhecimento. Buscando compreender como tem sido remunerado o conhecimento bot556

nico em projetos de biopru 1'1I plantas no Brasil, tenho 11('111111' 1 formaes nebulosas, par "'I 11 mais, negociaes obscuru I 1 velmente, botnicos orgulho \I 1 monstrar seus conhecirn '11111 eles, contribuir para o dcs '11'111 I por exemplo, de novos frrn 1111 I do avanos para toda a hlllllllllll Essa idlica viso pode I I rada suficiente por alguns, I li11I pode, eventualmente, c 11 li I da mente recompensado I 11 quando souber que vicias 111111 1 pelo medicamento de cujo 1111 cipou, ainda que s ele pr ]lI 11 I sa contribuio. Todavia, ']11 ,I detentor do conhecimento 11111 o clara de abrir mo d \ I 11 direitos. aceitvel e COIlIIIIIIII postura desde que o gcstu 11iI I l consciente e no apenas ti I I I ingenuidade ou de faliu d 1 transferncia de inforrn I 11 tando no pesquisador 11di sensao de ter tido USOI'"III" , nhecimento, adquirido dll1l1l1l de trabalho meticuloso, di I' herbrios, laboratrios c, '1"1 variavelmente, em exaust \'11 de campo. Para finalizar, vai' que a Lei de Inova 'li I 1I sancionada, no dia 02 d, ti 2005, com o objetiv , '\11111 permitir a constituio di 111111 pcio a parcerias estrut 1 universidades, instituto 11,1I empresas no processo di' 111' prev, ainda, a possibilklml tilhamento de infra11111111 mentos e recursos hUIlIIIIII' privados, para o dcs nvnl lill lgico e a gerao d 1111 tos inovadores e estulu I1I que o pesquisador p(1I11 10I volver pesquisas aplicurlu

1111,N contexto deste artiIt IlIqll' o mecanismo da Lei 1111vrvidor pblico o pagalI/I in 'tituies, de adieiI 111111 illcorporvel remu11111111 e a participao 'Illc 111 dircitos de proprieda. , I I', uinda, a licena no]111111 11constituio de em11,,'1)lgica. O momento ']lIlIpt'ildo para que as re1\lulI1debatidas em prol" I("ls, com potencial reli IIlvll11cnto tecnolgico a II nento botnico acumuI 1111 brasileiros. los

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SIMPSI041

Uso da cromatografia gasosa bidimensional Abrangente no Es.~ . , de leos Essenciaise Fixos

A cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) uma tcnica relativamente nova, cuja aplicao tem se mostrado extremamente til em vrias reas do conhecimento, especialmente para a separao de amostras complexas. A GCxGC caracterizada pela utilizao seqencial de duas colunas cromatogrficas, uma coluna convencional e a outra curta (do tipo de coluna usada parafast-GC), de forma que todo o efluente da primeira coluna ou uma parte representativa do mesmo conduzido para a segunda coluna atravs de um modulador. O sistema de modulao entre as duas colunas causa uma compresso da banda cromatogrfica que elui da primeira coluna, e esta banda direcionada para a coluna curta, de forma que a separao na segunda coluna extremamente rpida. Desta forma, a sensibilidade significativamente incrementada (relao sinal! rudo aproximadamente 10 vezes maior) e a resoluo, bem como a capacidade de picos aumentam de forma expressiva, se comparadas cromatografia gasosa monodimensional (lD-GC). A estruturao de compostos quimicamente relacionados nos cromatogramas obtidos (chamado "efeito telhado") tambm auxilia na identificao de compostos em amostras complexas. Muitos leos volteis apresentam uma grande gama de compostos de vri-

as classes qumicas, o qu 11 I tras de grande potencial 1'11I Exemplos deste poten 'illllll,,1 tos na literatura cientfic I, I I'li do leo de hortel-pim 11111 I perita), que apresentou II1 I GCxGC-FID, enquanto '111 MSD haviam sido dele '1IId" compostos. O leo de IIII,I, foi recentemente analisud I apresentando 96 com 1'0 li mente identificados, ao 1111 lD-GC, apenas 34 cOIIII' identificados. Aumento dil e da resoluo da anll 111 j foi observado nos l o 11,I no leo da rvore de ch I 111 11 laleuca alternifolia), C(llllll I componentes do leo di' 11111 lise enantiomrica de ,h'lI importante no estudo di 1I,I tieas, na deteeo de adio de material sinl 1111II detalhes sobre a origem 1111111 A fragrncia de leo v(lllIhI zes definida por c 1111'1i I presentes em nvel d ' /111 o de melhor sensibilkhul para estes compostos 1111111' nece uma anlise de 1111111 para as fragrncias d ' \ O estudo de leos VI' I tos de cidos graxos 1111111 alvo de estudo atrav S di I li por exemplo os leos di ,,11

I 11111/1 vantagens obtI I li I IIbl analtica so: 11111 de cidos pre11/0 I I 111Il' raes; maior '111 I 1"1111 lI'i s compostos, v 1I II I'Pllrtlo dos com11110 11i'I'.ntcs da matriz. I 11t,(' uma pode1I11I11I1l'1I, pode arnque Ilillidlsa respeito de 11 1'01110 por exemplo 11 IIIIIIIN' fragrncias de IlId'lll potencial das mes/111111\111 . desconhecido.

DALLUGE, /.; BEENS, /. &BRlNKMAN, U, A Th. /. Chromatography A 1000,69,2003. DEBONNEVILLE, C, & CHAlNTREAU, A r. ChromatographyA 1027,109,2004. SHELLlE, R. A &MARRJOTT, P./.Analyst, 128879

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111111

' .

I",li,

I"'

Prafa., Ora. -Instituto

de Qumica, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, RS,Brasil. I IllfllI

I/D!MENSIONAL

ABRANGENTE

NO ESTUOO DE LEOS ESSENCIAIS E FIXOS

SIMPSI042

Reconhecimento de clulas transformadas por lectinas veget


Magdolna Maria Voz

reconhecimento e mapcam 111 Lectinas constituem um grupo espeplexa diversidade de scq 1111 cial de protenas ou glic0r.rotenas que tm ficas e configurao dos 111" a caracterstica de possUlrem pelo menos os de glicoprotenas e I, 11 um stio, em suas molculas, cap~z de reexpressos na membrana l' 1111, conhecer e ligar resduos especlficos de ticular, e ainda, em orgllllllll carboidratos, sem modific-Ios. ,. presentes em flidos Xliii A descoberta, em seme~tes. tOXIC~S Quando em contat , 1\ I I I de Ricinus communis, da pnmelra lectilectina-carboidrato esp 'l' 110 ' na por Stillmark, em 1887-1888, d~imediato por meio de ligu I" rante a realizao dos trabalhos expenlentes, tipo interaes hidllllo I na men t aiis de sua tese de doutorado, as de van der Waals, .l'lIll Universidade de Dorpat, Estoma, ensede reconhecimento e IiK1\ 'ou ao longo dos anos, o isolament~ de e o resduo de carboid.1"l111l I" lec~inas por distintos autores a p~rhr de mesma apresenta afini .11111 diferentes tecidos e fludos veg~tals, be~ interaes hidrofbicas I' I I como de outras fontes naturaiS que na.o fora deste domnio tallllll 111 de plantas. A verificao de que a ag~utlligao da lec~ina a.os 11 I nao celular por efeito das, l~ctma: A conseqncia da 1111 '1'11 multivalentes, possua caractenstlcas d. com os oligossacard 'o li, eletividade e seletividade, e q~e essa aticelular o reconhecilllllll idade era inibida por carboidratcs e~especficas, deflagran(\1I 1111 ;lecficos, fez com que Boyd e Shapleleventos como a aglllllllll h em 1954, sugerissem para estas a~ludiferenciao e at me 1111 ~i;inas o nome "lectina", termo de:1V~lular. Em vegetais di' 111 do do verbo Legere, em lat~m, que sigmdas lectinas, no me '1111111 fica escolher, eleger, seleciOnar. Recencontra predadores, b '111 I II temente, protenas monovale.ntes, com cipao destas m~16 '11111 I nico stio de reconhecimento ' de de polinizao, simblu um U . lud s carboidratos, tambm foram me ~l. ~ ganismos, transpor! ' di nesta d e fi . - Por outro lado, a inibitmao. , dos, entre outros. o seletiva da aglutin~o, por aucaSendo a estrutur I di' res especficos, evidenciando, de acordo pecfica e definida P(l111 I com Morgan e Walkens, em 1959; ~ prelar, a interao Ic '111111 1,1i sena de carboidratos na superf~cle cepropicia o uso d SSII 1'1 lular, foi a base no uso de [cctinas no
A

. . utodeBiocinciaseDepartamentod 1l10(\IIII,,1 Programa de ps-Graduao em Botanlca,lnstlt ande do Sul (UFRGS), E-mail: hampe@o.lillllllo I Bsicas da Sade, Universidade Federal do RIOGr

ilonax (ADL) , 111101,'h mogeneiza11,11111111, cromatopor 1111 rnluna de estro11 I' Illililllda. A lectina 111 I I utou, em eletro1"11111 rllumida a 11 % 1111101 '~ no reduI~\
IIlIldll

toras, uma nica banda protica. A sua massa molecular estimada, por este mtodo, foi de 33 000 e, de 32 051 352 determinada por espectrometria de massa. SDS-PAGE, realizada em condies redutoras, mostrou duas bandas proticas, com massas moleculares respectivas de 18915 218 e 13 135 153. Em altas concentraes redutoras, uma terceira banda protica, com massa molecular de 6500 100, foi detectada nos eletroferogramas. Quitotriose e GIcNAc inibiram a atividade hemaglutinante da lectina, mas no N -acetillactosamina. A ADL biotinizada, quando marcada com streptoavidina -FITC demonstrou especificidade para clulas transformadas das linhagens de adenocarcinoma de clon caucasiano de grau II humano (HT29), e tambm de carcinoma mamrio ductal humano (T47d), dentre dez linhagens analisadas. Clulas de glioma C6, que expressam unidades multiantenrias e de unidades repetitivas de N-acetil-Iactosamina no foram marcadas por esta lectina, o que est de acordo com a no atividade de ADL por este sacardeo. conhecido o fato de que inmeras clulas transformadas expressam, em sua membrana plasmtica, N-acetillactosamina ligado ao resduo de manose e portanto so sucetveis de marcao pela lectina de Datura stramonium, e de Phaseolus vulgaris. Embora presente GlcNAc na molcula da N-acetil-lactosamina a configurao deste resduo ocorre de forma distinta em seus complexos, o que traduzido pelas distintas especificidade das diferentes lectinas, em relao aos oligossacardeos, mesmo tendo o mesmo inibidor monossacardico. Lectina obtida a partir do ltex de Euphorbia milii (EML) foi purificada por precipitao salina, seguida de cromatografia de afinidade em matriz de ACA44 e, finalmente, em coluna de GaINAc561

jfoRMADAS POR LECTINAS VEGETAIS

agarose. A massa molecular foi estimada de 60.000 por gel filtrao. A estrutura homodimrica foi mostrada por SDS-PAGE, por condies redutoras. A EML tem como inibido r da atividade lectnica GalNAc e seus glicoconjugados, alm de D-galactose. GIcNAc no inibiu a atividade da lectina. EML quando complexada com biotina e conjugada com streptoavidinaFITe, ligou-se diretamente membrana plasmtica das clulas de linhagens T 47 d, HT29, alm das TA3H tumorais. O fato de que, das dez linhagens celulares analisadas, apenas glicanos de duas linhagens foram reconhecidas pela ADL e trs pela EML, mostra, primeiro, a grande heterogeneidade dos glicanos expressos na superfcie de clulas tumorais e, segundo, a grande especificidade das lectinas com

respeito as estruturas oligo 'SUIIII por elas reconhecidas. Mais ahul ' nas EML marcou clulas da 1111 TA3H o que indica que oligoss 11 ' com GalNAc terminal estariam sas nestas clulas, permitind 111'1 marcao seletiva das mesmas, I lectina. O uso de lectinas vegetais, I 111 qumica, abre uma vasta fr 111 balhos sobre trasnsforma S qll rem na expresso de glicocon 11 glicoclix de clulas transfouu tambm para caracterizao I1I tumorais em diferentes estiH II tsicos, com a vantagem de H 'i II rio quantidades mnimas d( II culas marcadoras, e quantidmh da de clulas tumorais em 111111' I ciduais.

ropriedades biolgicas es vegetais: atividades a e fungicida


Clia Regina Carlini'
gastrite e cncer gstrico, apresenta estrutura (AB)6. Assim como as ureases vegetais, as microbianas tambm so nquel-dependentes. Acredita-se que todas as ureases apresentem estruturas e mecanismos de ao similares (Mobley et aI., 1995). At o momento, apenas 3 ureases bacterianas tiveram estrutura 3D resolvidas por difrao de raios X: Klebsiella aerogenes (1 FWJ), Bacillus pasteurii (4BPU) e Helicobacter pylori (lE9Z). Apesar da abundncia de ureases nas plantas, pouco se sabe sobre sua funo nos vegetais. Postula-se que estas enzimas estejam envolvidas na biodisponibilidade do nitrognio e em processos de defesa da planta. Na leguminosa Canavalia ensiformis (feijo de porco), identificamos a existncia de uma famlia de genes de urease, que respondem ao fito-

Cana valia ensiformis I He/icobacter pylori


I A
2381 840

~I -----=53=9~1 B
~%

(f%

Bacillus paste;:.:l::..cll-=.:':.- _--~~~ [JQQJ ~ LI _ _ --'---__ ....:5;::::6.::..9-l1


A60% B51%

61%

Figura 2. Comparao da estrutura quartenria de ureases de diferentes fontes.

I ~ I I'n ro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS,CEP IW,,1r s.br/laprotox. E-mail: ccarlini@ufrgs.br

hormnio cido abscico, (Pires-Alves et al., 2003). A canatoxina (CNTX; Carlini & Guimares, 1981), um dmero de cadeias de 95 kDa ligadas no covalentemente, uma das isoformas de urease presente nessa semente, sendo que a urease clssica, mais abundante e mais ativa, um hexmero de cadeias de 90.7 kDa. A baixa atividade ureoltica da CNTX parece estar relacionada com a presena de 1 tomo de Ni e um de Zn em seu centro ativo, contrastando com os dois tomos de Ni presentes na urease clssica (Follmer et al., 2002). Estudos mostraram que a urease possui algumas das propriedades biolgicas da CNTX, como induo de exocitose eicosanide-dependente (via das lipoxigenases) em vrios tipos celulares e em plaquetas (Carlini et al., 1985; Barja-Fidalgo et al., 1991a; 1991b), alm de ligao a gangliosdeos e atividade txica contra insetos e fungos. Esses efeitos no dependem da atividade ureoltica das protenas, implicando que outros "domnios" proticos das molculas esto envolvidos (Follmer et al., 2001; 2004a; 2004b). Algumas dessas propriedades biolgicas tambm ocorrem em ureases bacterianas, podendo ter repercusso na interao planta-bactria, como no caso da urease de Bacillus pasteurii (Olivera-Severo et al., 2006a), e na teraputica de doenas causadas por bactrias produtoras de urease, como nas lceras gstricas por infeco com Helieobaeter pylori (Olivera-Severo et al., 2006b). Em estudos comparando duas ureases (C. ensiformis e a de soja) e uma bacteriana (B. pasteuriii, verificamos que todas as isoenzimas induziam agregao plaquetria, apesar de diferenas nas doses efetivas, sendo que somente as ureases vegetais apresentaram propriedade inseticida (Follmer et al., 2004a).

Protenas canatoxiun 1111 esto presentes em vrillN pllllll muJam-se na semente 1111111111 rindo um papel de dccsn, 111111 edades inseticidas (Carllu I I .1 Ferreira-daSilva et al., (111111 cidas (Oliveira et al., 1111111 I Ritt, 2005). A CNTX ' 1'1 """ geri da por inseto bl'Uqilld

I rllI bnctria H. pylori apre111 polente atividade fun11111 ' I contra vrios funI '" IIccker-Ritt, 2005). " 10 I 11 .xpresso heterloga 111 li 'Pldeo inseticida ja111I h'I'i" e leveduras, bem 111 em soja, esto em an-

Referncias

bibliogrficas

Callosobruehs
(Hemiptera,

maculatus
ex: Nezara

11" '/111

eus peruvianus, Rhodnius 111"/'


no afeta outros in to (I I ex: Manduea sexta, 11111/,'/11 talis; Orthoptera, ex: "11 ". rieana; Diptera: ex: DroslI/1/1I1 gaster) (Carlini et al., I lI) aski et al., 2005). A CNTX ativada plllli I,!ti por catepsinas acdicas 1111 li 11 rio dos insetos susccpt VI I I cua para insetos com d I' I em tripsinas. A urcasr 111111 C.ensiformis, e tamb 11l1111l especfica de soja ( /11'I/11 ,,, tais quando ingeridas 11\ 11 /' I peruvianus, atuand semelhantes CN'I' , li I 0.05% p/p, sendo -I" 111 li. dependente da ativid 1111 111 protenas (Follmer l 111. '111' Peptdeos (10- I 5 k I) I) 111 podem ser produzido 11 I1 to da CNTX com !li' 11111 I latus (Ferre ira - DtI S 111'11 I Carlini et al., 2000), I' 'I "ti nantes (jaburetox), 0111 d, cDNAs parciais d IMIlIt 11111 de C.ensiformis, mUNIIIIIIII" vidade inseticida (Mulhuu l Observamos ainda lIllI , dll minao da sem 'nl '. 1111 1 peptdeos entorn I) 111 I urease, sugerindo lIllI I cesso fisiolgico d 'd,'1i 1111 martini et aI., 200 1I1 (isoladas de feij -di' 11111
DE

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INSfTlC/DA

E FUNGIC/DA

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vegetais: muito alm -~"ulas decodificadoras digos


Benildo Sousa Cavada 1
1.,111111', glico)protenas ( 111 I menos um stio de 1",1 I I 1\ carboidratos, terem I t li I mais de um sculo, ti. I tS molculas dentro .uule c encontram per.,11110 C peculao. Atu1111111, existe um consen1111 11/urividade biolgica r rulumente, ligada a esta li 111\1 ) reversvel a glico1I11t1 esta tica, as lecl 11.111fi glicoconjugados Ih 111'lix das clulas po11111 desencadear 1111', uma 111. bi lgicos (ou ativiI, rlepcndendo da espeI tlun utilizada em relati. 'S glicoconjugados. I. til 111011rado, entre out hllHIt I iolgicas para di111111mitogenicidade, 111 li I de interteron gama !tUI .apacidade pro- e I 1"111('1' cicatrizante, atiI Iltll' .lndc bactericida ou IIII dude antifngica, til I 11 'na, etc. A desco"tlv dudes (aplicaes) IIh 11 ponto de, atualmen1111 1'1'm consideradas i 1111 IlH e indispensveis h II I I I' avano, tem sido 1II q\l ' timidamente, a
I

possibilidade de lectinas apresentarem tambm atividades biolgicas ligadas a outros stios de ligao no relacionados com o stio de ligao a carboidratos. J foi demonstrada, em algumas lectinas, a existncia de outros stios de ligao como stios hidrofbicos e cavidades hidrofbicas. Alguns estudos tm procurado demonstrar a capacidade destes novos stios reconhecerem, por exemplo, hormnios vegetais, metablitos secundrios ou aminocidos livres. Mais de 250 aminocidos livres tm sido identificados em plantas e muitos deles so compostos intermedirios no anabolismo e catabolismo de aminocidos proticos, enquanto que outros desempenham papis de defesa dentro da planta. Dentre os mecanismos de defesa conhecidos que estes aminocidos no proticos participam, destacam-se aqueles que envolvem o bloqueio da sntese e absoro de aminocidos proticos ou a capacidade de se incorporarem erroneamente (s vezes de forma letal) nas protenas sintetizadas nos organismos que se alimentam das plantas que contm estes aminocidos. Esses aminocidos no proticos so particularmente abundantes em espcies das famlias Leguminosae e Liliaceae e os exemplos melhores caracterizados destes compostos so a L-canavanina e a L-canalina, presente em sementes de vrios legumes. Por exemplo, uma macia acumulao de L-

, " I III!'

deral do Cear - www.biomol-Iab.ufc.br.

E-mail: bscavadaeufc.br

566

SIMPSIO

42. PROTErNAS DF li/li

\A

canavanina, um anlogo estrutural da Larginina, ocorre em sementes destas espcies e, alm de oferecerem proteo contra predadores, servem tambm de reserva de nitrognio, que pode ser mobilizado rapidamente durante a germinao da semente. O cido aminobutrico (Abu) um aminocido no protico que protege as plantas nas quais ele ocorre contra o ataque de patgenos; quando introduzido em Arabidopis o Abu confere resistncia a certos patgenos. Apesar de vrios estudos mostrando o envolvimento de lectinas com estratgias de defesa de certas plantas terem sido reportados, os mecanismos permanecem ainda obscuros. Reportamos aqui, de forma indita, a estrutura cristalogrfica da lectina de sementes de Canavalia gladiata (CGL) onde descrevemos.um novo stio de ligao a molculas de natureza no glicdica e que est relacionada s funes desempenhadas pelo cido aminobutrico (Abu). O cristal da CGL submetido ao experimento de difrao est mostrado na Figura 1. A estrutura da CGL nativa e complexada com o acar alfametil-manosdeo (a-MM) se mostrou um excelente modelo e fonte de informaes para o entendimento da estrutura de lectinas de leguminosas, alm de revelar uma nova interface inter dmeros nessas protenas. Ambas as estruturas

foram refinadas a r 'suill 111 (CGL) e 2,31 A (a-MM/t I I tivamente. Os modelo 111 I I tereoqumica e grf 'o d I dran consistentes c 111I 111'1 metricamente bem d '11Ihl, lectinas j purificado 111 espcies da sub- trib I) I" I 10 as de Canavalia ensikmu! /

C.maritima, Dioclea /.(/'11111///' nensis e Cratylia flori/II/I/d" 11


estruturas tridirnensiou I I cristalografia de rai l I apresentam respectivnuu-ru 84,82 e 81% de slIII,"I,1 seqncias de arnin li' "11 'I' paradas com a s q 11111 I modelo da CGL 1'01di 11 " substituio molccuhu I 111 regio em torno do I' \ ItllIlI alta densidade elctr 11I 1111 para o modelo, Ap H 11111111' tiva entre metablitu mnios e aminocido 11 I 11 contrados normalrn '1111 111

Canavalia gladiaia,

1'111,,111

Figura l . Cristal de lectina de sementes de Canava/ia gladiata

do -minobutric (AIi"1 se encaixava perf it 11111111 dade eletrnica. PIlI I 11li I tidade deste compu 111111 espectrometria de 11111 foi feita, de forma qlll I I encontrado na I 'I 1111 '111 1 no processo de cri 1111 , O Abu est IOi'1I1 ,101 dos monmero lIU' 11'1111 cannicos, O mapn di ti, I a 20 se encontra 1111 1 1 est acessvel ao /101 111 v Asp 139 atravs ti ' 111111 I gnio e com a L U I '/I ,~ raes hidrofbi '11, 11 molculas de Ab I' 11 I cos 15,28. A pl'l' 111 I terface dos m011 1111' I contatos entre '1111 I dmeros canni 'o , ti 111
"'MOLtCULAS

tinas so consumidas no final da germinao, j que pela posio desta molcula na protena (lectina), supe-se que o Abu s seria liberado quando as interaes entre os dmeros cannicos fossem desfeitas. A concentrao do Abu aumenta nas plntulas e promove a produo de etileno. Uma vez que as lectinas so consumidas no final do processo de germinao, parece razovel estabelecer uma correlao entre as substncias que se ligam as lectinas, tais como o Abu, e o desenvolvimento de respostas das plantas contra condies de estresse e o ataque de patgenos. Alguns outros aminocidos no proticos, tais como o cido ~-aminobutrico (BABA) e o cido yaminobutrico (GABA), ismeros do Abu, foram reportados como indutores fisiolgicos em muitos processos relacionados a resistncia induzida por respostas e estresse. Estes aminocidos no proticos desencadeiam a resistncia nas plantas atravs de mecanismos diferentes da resistncia sistmica adquirida dependente de cido saliclico e da resitncia sistmica induzida dependente de etileno. O aumento na concentrao do Abu nas plntulas corresponde ao aumento na induo da resposta hipersensitiva nas mesmas, j que as concentraes dos indutores deste tipo de resposta se encontram em alta concentrao nesta fase da ontogenia da planta. Apoiando estes dados, tem-se que a concentrao da lectina decresce de forma drstica no final a germinao, e, portanto, baixa na plntula. A figura 3 mostra a relao entre as concentraes das lectinas e do Abu com a de compostos relacionados resposta hipersensitiva. Na verdade, os aminocidos no proticos parecem se relacionar a esse tipo de resistncia, o que configuraria uma via dependente de lectina.
DECODIFICADORAS DE GLlCOCDIGOS

569

'tfIfh~..r. 'O'" t. ,j.J

Figura 3. Grfico esquemtico mostra a relao entre as concentraes das lectinas e do abu com a ocorrncia de compostos relacionados resposta hipersensitiva. C.) representa a concentrao do Abu; C-) representa a concentrao da lectina; e C ) concentrao de compostos relacionados a respostas contra patgenos e condies de estresse.

Comumente o stio de ligao a carboidratos das lectinas tem sido o foco de ateno das investigaes que envolvem esta famlia de protenas, mas h evidncias de novos stios biolgicos, o que leva ao surgimento de vrias questes sobre as reais funes fisiolgicas destas protenas, que foram, primeiramente, consideradas protenas de armazenamento e depois consideradas protenas de defesa, mas sem que se chegasse a uma concluso dos mecanismos por trs desta funo.

Finalmente, enfio 111111' te, necessrio r ')11 d I o atual de lectinas, 111 "11 dos aqui apresentado IIdl fazem mais do que liflli 11 carboidratos e decifrar .,11 I do tambm protcnu 1/11 tambm com metab ,1111 hormnios e amin I dI> perspectiva, com ccrt '/lI ,I uma verdadeira rev 11111 I laes das possveis I'UI\111 I dentro dos organismc 111111 tradas, Alm disto, t) I "I reportados reforam ti i I 11 I ao endgena das I' ,( 1111I relao tempo- e CSpll~1Iti de acordo com as ncc 1111 I nismo. Fica claro, Illllillllll novas perspectivas ('111'111 hl rao reversvel com 111111 I 111 bicas) para a atuao ('111'" tinas no inviabiliza 1111I. tante consistentes de 111111 municao via stio' tI(, I I dratos, Esses resultado , I" , tambm abrem a p I' 1"111 veis elucidaes de rn '(11111 " dos grandes desafi 'dllllll ,I a explicao de c 111(1 1 1 apresentam forte cal' h\1 11111 seguem estabilizar 111(111 I 1111 cas que lhe so es n' 111I funes vitais.

iento glucdico de Ia

Agaricus bisporus.
sicos y tecnolgicos
Fernando Jos lrazoqui"
1'1111 'na que recono1111 III'i! Y conforma111.11111 La lectina de IS. I 111.)ha ido descripta ti '1111' participara en di1111111' como los de 'S, 1II1111 'm una potente 11"rnriva hacia clulas Ih I humanos. El hon"I"ltlu c mo champig'/1/\ cultivado enla zona 11111111) utilizado fue 1'"11do, De un homo111 111Irucrificante del 1 I I 1"11 .acin de Ia lecIIi IlIlul I,afinidad, y uti1111111 1rornatogrfica es11, 1"los humanos enI di poliacrilamda, se 111 11111 incremento un 1"1111'U mayor a 140 , ,,11!t'ni10 muestra una li' .lud cuando se 10 I' I d(, ' ta molcula '"1 IIn tctrrnero de " 111111, .ular (determili 1111111' .ular), constituiI 1111 idcs idnticas de ti 11 11 istructura conI 11uulnn por difracciI I 1I1'lIftl se estudiaron I '1'"1' I 10. De Ias mis11111 IIIIHbsica de ABL I" 1I H~''Icctroenfoque I I 1'l'Isl.tlizada (Figura 2). Analizando diferentes condiciones de agentes precipitantes se encontr una situacin ptima de cristalizacin en pre-

35.960 25.491

18.533

5.736

Figura I

pH 6.2

pH 5.9 pH 5,5 pH 5.3 pH 5.2

Figura 2

I'

II1I '"/Algentina.

E-mail:irazoqui@dqbJcq.unc.edu.ar

570

SIMPSIO

42. PROTEfNAS

DE DEFEIA I

sencia de formato de sodio 4 M, Tris- HCL 0,02M, pH 8,0 y 30 mg/rnl de ABL (Figura 3). EI grupo espacial de Ia ABL correspondi a C222, obtenindose una coleccin de datos estadsticos de resoluciones entre 1,5 y 2,2 A. Por otra parte se consigui Ia co-cristalizacin de ABL en presencia de ligandos glucdicos, obtenindose cristales isomorfos. Cada rnonmero presenta dos regiones de plegarnientos b, constituidas por un total dei 10 regiones (A-J) de hebras plegadas en hojas b, y unidas por un motivo hlice-rulohlice. ABL posee cuatro sitios de unin ai disacrido Galb3GalNAc y dos sitios que reconocen GlcNAc (Figura 4). EI sitio de reconocimiento ai disacrido corresponde a una depresin ubicada entre Ias hebras BC, DE y FG en un costado y el motivo hlice-rulo-hlice en eI otro. Como Ias 'interacciones ms importantes, se destacan los aminos cidos Ser48 y Asn73 mediante mltiples puentes hidrgenos. Interacciones simples muestran Gly49 y Ala29, y mediadas por molculas de agua participan His 72 y Argl07. Importante contacto hidrofbico es observado con Tyr28, y en menor grado con Tyr74 y Tyr98. La serina dei antgeno T (Galb3GalNAca-Ser) no participa en el reconocimiento. GalNAc interacciona con ABL a travs dei sitio que reconoce al disacrido, mientras que GlcNAc es reconocido por otro sitio. EI sitio de unin a GlcNAc esta delimitado por Ia ltima hebra de Ia primera hoja b (hebra G) y Ia primer hebra de Ia segunda hoja b (hebra H), y Ia segunda de Ias dos hlices deI motivo hlice-rulo-hlice, Las principales interacciones de ABL con GlcNAc son a travs de Thr82 y Asp79, y en menor relevancia con Argl 03, Tyrl14 e Ile80. Ambos sitios pueden diferenciar el hidroxilo epimrico dei C4 de Ia N -acetilhexosamina. La demostracin de que estos sitios son activos fue llevada a cabo mediante ensayos de ELISA donde se utilizaron li572

2 tH: GalNAcPl.:JGIc.'1Acfll-3:\fnnJ,l14Glcp_Cer

4-~:

GaI~1.3GaINAc~I-4GIcNAcpl.3~lanfll.4Glcp.Cer I-4GI(NAc~I3;\Ii.in~ I..4Glql-Ccr

s.~: GlI:lpl.JGah~ACO:I.4(9)NA.~

s. A,!: GlcAjlt-3GalfU-3GaINAcoI4G21NAcIi14CkN
,- GA 1: Galfll-3GaINAcIU-4Galpl.~Glcp-Ctr IO-~: Gnlpl4GkNAt'IlI-4Galj}I.4GI(~Cer

Aclll.3;11~,nlll~(;r~Cer

11I11i' tron constantes l O; 221 Y 205 x IIVIIIII te, Las cuales m hlllllblc mayor afini111111'mo IgA2 (con

"N

'de Nvglicanos),

Figura 4

IIIINAca4 GalNAcb4 01111- er) y N5b li NA 'b3 Manb4Glcb 111 ronstantes de 2,2; 1I li' P ictivamente, sin I 1111' n con GAl 'i 111111/1lcb-Cer). De 1 11I 1111' estructuras que I (,,,11i alNAca como 1II1I1t11l cambia su anI ,li (c mo en N5b y

GaINAc, dejando evidencia dei mayor reconocimiento por el disacrido que eI monosacrido en Ia interaccin con IgAl (Figura 6). Tambin pudo apreciarse que Gal y sus derivados poseen inferior capacidad inhibitoria de dicha interaccin que GaINAc, revelando una mayor significancia de GalNAc que Gal, en concordancia con Ia observacin cristalogrfica. Por otra parte, cuando estos ensayos de com-

100

A
80

80

I ,ti ti" interaccin

disZ

.0

111, rva el mismo feI li 111111111N6 se adide "'llIlIIlIc (A6), 10 que 11'" 1111 into, Adicional111I1 si esta interacli' 11111 isencia de car111' I ,"dll '11 Ia interacci1111M utilizando como O ,,"11111ndo terminales 111111111' I 11que carbo,1,1 111isacrido como d NI' alb3GalNAc 1IIIIIiI' s inhibidores I1 NAc o pNPa-

o::
5:l 2'i
<Ii

20

o
100

0.001 0.01

...
Z

B
80

"'I U "'I c,

'0

40

20

o
0.001

O.OJ

l /I
0.1 10

100 1000

0.1

10

100

1000

INHIBITOR (mll)

I'" (;

Figura 6

NA DE AGARICUS

BISPORUS. ASPEGOS

BAslCOS YTECNOLOG/COS.

573

petencia se realizaron utilizando ligandos con GlcNAc terminal, como los presentes en N -glicanos de ovalbmina, se demostr que GlcNAc y sus derivados como el pNPaGlcNAc fueron los mayores inhibidiores. Dando claras evidencias que el sitio de unin a GlcNAc, observado por cristalografa, tiene actividad funcional. Es bien conocida Ia presencia de glicoconjugados como O-glicanos dei tipo GlcNAc en ncleo, que cumplen diversas funciones celulares. ABL mostr capacidad de interaccin con glicoconjugados presentes en ncleos celulares tanto por fluorescencia como por westem blot. Ensayos de western blot utilizando matriz nuclear purificada y enfrentadas a ABL muestran multiples bandas de interaccin, de Ias cuales algunas son inhibidas ante Ia previa incubacin con GlcNAc. Lo que indicara algn grado de reconocimiento a estas glicoprotenas nucleares muy relacionadas en Ia regulacin de Ia transcripcin. Esta propiedad podra estar relacionada con su efecto antiproliferativo en clulas de epitelio tumoral humano. Con el propsito de intentar imitar Ia

actividad antitumoral d ' rollaron anticuerpo anil dli" zando esta lectina como 1'1" I Anticuerpos anti-ABL 1'111'11111 en conejo y cuantficados 1"11 I I I teriormente se purific I I, I nejo anti-ABL utilizando 1"' I pharosa. Luego esta Ira . , 1111 I cida a una columna de 111 para purificar por afinkhnl I IgG de conejo anti-All., I I' IgG fue analizada CII 11' 'I inhibir Ia interaccin di' 111 glicoforina marcada, plllll I, n de Ia existencia de 111111 I' el sitio de unin a carhuh til o, Posteriormente esta ri' 111 I I' ABL especfica fue c 11.1111"" cinilada e inmunizadn 11 I .1 hembras de 6-8 sem illll ,I ra 7). Los anticucrpo 11111 ratones fueron analiztuh I tes antgenos tum rull' I, ron ser inhibidos 1I11lih relacionados a Galb (llll sayados. Estos anliMllI'ltl o tulos aceptables cum 11" I estudiaron lneas d' 111111

IIT29 Y MCF7 (Figura 'anticuerpos mostraIp.1I de inhibir Ia prolifeI 1111 hucas tumorales. Esta ac11 11111 11 Ia observada para ABL li" mnyor que los controles. 11111" i n de estudiar si ABL I 11'111' n el mecanismo de
111111

li ti

I'Id ld "

defe?sa del Agaricus bisporus, estamos analizando el efecto de esta lectina en el c?~portamiento de C. elegans. ABL punfIc~da por cromatografa de afinidad (wild type) fue incubada con larvas en estado 3 dei gusano, previo aI agregado de un medio de cultivo lquido que contenga E. coli como alimento. ~uego se analiz su desarrollo y sobrevida en este medio, respecto a Ias muestras control. Tambin, una nuestra recombinante de ABL fue expresada e?,E. ~oli utilizado un vector de expresron tnducible por IPTG. A e t b t . . s as ac erras tnducidas se le adicionaron larv~s de C. elegans, e igualmente se anahzaron desarrollo y sobrevida dei gusano. Ensayos preliminares muestran un efecto toxico por parte de ABL que nos permitira suponer algn rol en Ia defensa dei hongo hacia gusano terrestres.

Figura 7
574 _.........;"'--

~._o

SIMPSI042.PROTEINfI\/l11

I!laIINA DE AGARICUS BISPORUS. ASPECTOS BAslCOS YTECNOLGICOS.

575