CIDOS NUCLEICOS Los cidos nucleicos son macromolculas, polmeros formados por la repeticin de monmeros llamados nucletidos, unidos

mediante enlaces fosfodister. Se forman, as, largas cadenas o polinucletidos, lo que hace que algunas de estas molculas lleguen a alcanzar tamaos gigantes (de millones de nucletidos de largo). El descubrimiento de los cidos nucleicos se debe a Friedrich Miescher, quien en el ao 1869 aisl de los ncleos de las clulas una sustancia cida a la que llam nuclena, nombre que posteriormente se cambi a cido nucleico. Posteriormente, en 1953, James Watson y Francis Crick se encargaron de descrubrir el diseo del ADN,empleando la tcnica de difraccin de los rayos x. Tipos de cidos nucleicos (DIFERENCIAS) Existen dos tipos de cidos nucleicos: ADN (cido desoxirribonucleico) y ARN (cido ribonucleico), que se diferencian: Por el glcido (pentosa) que contienen: la desoxirribosa en el ADN y la ribosa en el ARN; Por las bases nitrogenadas que contienen: adenina, guanina, citosina y timina, en el ADN; adenina, guanina, citosina y uracilo, en el ARN; En los organismos eucariotas, la estructura del ADN es de doble cadena, mientras que la estructura del ARN es monocatenaria, aunque puede presentarse en forma extendida, como el ARNm, o en forma plegada, como el ARNt y el ARNr. En la masa molecular: la del ADN es generalmente mayor que la del ARN.

Nuclesidos y nucletidos Las unidades que forman los cidos nucleicos son los nucletidos. Cada nucletido es una molcula compuesta por la unin de tres unidades: un monosacrido de cinco carbonos (una pentosa, ribosa en el ARN y desoxirribosa en el ADN), una base nitrogenada purnica (adenina, guanina) o pirimidnica (citosina, timina o uracilo) y uno o varios grupos fosfato (cido fosfrico). Tanto la base nitrogenada como los grupos fosfato estn unidos a la pentosa. La unin formada por la pentosa y la base nitrogenada se denomina nuclesido. Cuando lleva unido una unidad de fosfato al carbono 5' de la ribosa o desoxirribosa y dicho fosfato sirve de enlace entre nucletidos, unindose al carbono 3' del siguiente nucletido; se denomina nucletido-monofosfato (como el AMP) cuando hay un solo grupo fosfato, nucletidodifosfato (como el ADP) si lleva dos y nucletido-trifosfato (como el ATP) si lleva tres. Los cidos nucleicos son grandes molculas formadas por la repeticin de un monomero llamado nucleotido, lo cidos nucleicos almacenan la informacin gentica de los organismos vivos y son las responsables de la transmisin hereditaria Listado de las bases nitrogenadas Las bases nitrogenadas conocidas son: Adenina, presente en ADN y ARN Guanina, presente en ADN y ARN Citosina, presente en ADN y ARN Timina, presente exclusivamente en el ADN Uracilo, presente exclusivamente en el ARN

Estructura qumica de la adenina.

 Estructura qumica de la guanina.

Estructura qumica de la citosina.

Estructura qumica de la timina.

Estructura qumica del uracilo.

Estructura qumica de la ribosa.

Estructura qumica del cido fosfrico. Caractersticas del ADN El ADN es bicatenario, est constituido por dos cadenas polinucleotdicas unidas entre s en toda su longitud. Esta doble cadena puede disponerse en forma lineal (ADN del ncleo de las clulas eucariticas) o en forma circular (ADN de las clulas procariticas, as como de las mitocondrias y cloroplastos eucariticos). La molcula de ADN porta la informacin necesaria para el desarrollo de las caractersticas biolgicas de un individuo y contiene los mensajes e instrucciones para que las clulas realicen sus funciones. Dependiendo de la composicin del ADN (refirindose a composicin como la secuencia particular de bases), puede desnaturalizarse o romperse los puentes de hidrgenos entre bases pasando a ADN de cadena simple o ADNsc abreviadamente. Excepcionalmente, el ADN de algunos virus es monocatenario, Estructuras ADN -Primaria:Una cadena de desoxirribonucletidos (monocatenario) es decir, est formado por un solo polinucletido, sin cadena complementaria.. No es funcional, aunque algunos virus la presentan. -Secundaria:Doble hlice, estructura bicatenaria, dos cadenas de nucletidos complementarias, antiparalelas, unidas entre s por medio de las bases nitrogenadas por medio de puentes de hidrgeno. Est enrollada helicoidalmente en torno a un eje imaginario. Hay tres tipos: -Doble hlice Acon giro dextrgiro pero las vueltas se encuentran en un plano inclinado. (ADN no codificante) -Doble hlice B Giro dextrgiro, vueltas perpendiculares (ADN funcional) -Doble hlice Z Giro levgiro, vueltas perpendiculares (No funcional) se encuentra presente en los parvovirus. Caractersticas del ARN El ARN difiere del ADN en que la pentosa de los nucletidos constituyentes es ribosa en lugar de desoxirribosa, y en que, en lugar de las cuatro bases A, G, C, T, aparece A, G, C, U (es decir, uracilo en lugar de timina). Las cadenas de ARN son ms cortas que las de ADN, aunque dicha caracterstica es debido a consideraciones de carcter biolgico, ya que no existe limitacin qumica para formar cadenas de ARN tan largas como de ADN, al ser el enlace fosfodister qumicamente idntico. El ARN est constituido casi siempre por una nica cadena (es monocatenario), aunque en ciertas situaciones, como en los ARNt y ARNr puede formar estructuras plegadas complejas. Mientras que el ADN contiene la informacin, el ARN expresa dicha informacin, pasando de una secuencia lineal de nucletidos, a una secuencia lineal de aminocidos en una protena. Para expresar dicha informacin, se necesitan varias etapas y, en consecuencia existen varios tipos de ARN: El ARN mensajero se sintetiza en el ncleo de la clula, y su secuencia de bases es complementaria de un fragmento de una de las cadenas de ADN. Acta como intermediario en el traslado de la informacin gentica desde el ncleo hasta el citoplasma. Poco despus de su sntesis sale del ncleo a travs de los poros nucleares asocindose a los ribosomas donde acta como matriz o molde que ordena los aminocidos en la cadena proteica. Su vida es muy corta: una vez cumplida su misin, se destruye. El ARN de transferencia existe en forma de molculas relativamente pequeas. La nica hebra de la que consta la molcula puede llegar a presentar zonas de estructura secundaria gracias a los enlaces por puente de hidrgeno que se forman entre bases complementarias, lo que da lugar a que se formen una serie de brazos, bucles o asas. Su funcin es la de captar aminocidos en el citoplasma unindose a ellos y transportndolos hasta los ribosomas, colocndolos en el lugar adecuado que indica la secuencia de nucletidos del ARN mensajero para llegar a la sntesis de una cadena polipeptdica determinada y por lo tanto, a la sntesis de una protena El ARN ribosmico es el ms abundante (80 por ciento del total del ARN), se encuentra en los ribosomas y forma parte de ellos, aunque tambin existen protenas ribosmicas. El ARN ribosmico recin sintetizado es empaquetado inmediatamente con protenas ribosmicas, dando lugar a las subunidades del ribosoma.

cidos nucleicos artificiales Existen, aparte de los naturales, algunos cidos nucleicos no presentes en la naturaleza, sintetizados en el laboratorio. cido nucleico peptdico, donde el esqueleto de fosfato-(desoxi)ribosa ha sido sustituido por 2-(N-aminoetil)glicina, unida por un enlace peptdico clsico. Las bases pricas y pirimidnicas se unen al esqueleto por el carbono

carbonlico. Al carecer de un esqueleto cargado (el ion fosfato lleva una carga negativa a pH fisiolgico en el ADN/ARN), se une con ms fuerza a una cadena complementaria de ADN monocatenario, al no existir repulsin electrosttica. La fuerza de interaccin crece cuando se forma un ANP bicatenario. Este cido nucleico, al no ser reconocido por algunos enzimas debido a su diferente estructura, resiste la accin de nucleasas y proteasas. Morfolino y cido nucleico bloqueado (LNA, en ingls). El morfolino es un derivado de un cido nucleico natural, con la diferencia de que usa un anillo de morfolina en vez del azcar, conservando el enlace fosfodister y la base nitrogenada de los cidos nucleicos naturales. Se usan con fines de investigacin, generalmente en forma de oligmeros de 25 nucletidos. Se usan para hacer gentica inversa, ya que son capaces de unirse complementariamente a pre-ARNm, con lo que se evita su posterior recorte y procesamiento. Tambin tienen un uso farmacutico, y pueden actuar contra bacterias y virus o para tratar enfermedades genticas al impedir la traduccin de un determinado ARNm. cido nucleico gliclico. Es un cido nucleico artificial donde se sustituye la ribosa por glicerol, conservando la base y el enlace fosfodister. No existe en la naturaleza. Puede unirse complementariamente al ADN y al ARN, y sorprendentemente, lo hace de forma ms estable. Es la forma qumicamente ms simple de un cido nucleico y se especula con que haya sido el precursor ancestral de los actuales cidos nucleicos. cido nucleico tresico. Se diferencia de los cidos nucleicos naturales en el azcar del esqueleto, que en este caso es una treosa. Se han sintetizado cadenas hbridas ATN-ADN usando ADN polimerasas. Se une complementariamente al ARN, y podra haber sido su precursor.

CIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN) El cido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN (y tambin DNA, del ingls deoxyribonucleic acid), es un tipo de cido nucleico, una macromolcula que forma parte de todas las clulas. Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria. Estructura El ADN es una molcula bicatenaria, es decir, est formada por dos cadenas dispuestas de forma antiparalela y con las bases nitrogenadas enfrentadas. En su estructura tridimensional, se distinguen distintos niveles: 1. Estructura primaria: o Secuencia de nucletidos encadenados. Es en estas cadenas donde se encuentra la informacin gentica, y dado que el esqueleto es el mismo para todos, la diferencia de la informacin radica en la distinta secuencia de bases nitrogenadas. Esta secuencia presenta un cdigo, que determina una informacin u otra, segn el orden de las bases. 2. Estructura secundaria: o Es una estructura en doble hlice. Permite explicar el almacenamiento de la informacin gentica y el mecanismo de duplicacin del ADN. Fue postulada por Watson y Crick, basndose en la difraccin de rayos X que haban realizado Franklin y Wilkins, y en la equivalencia de bases de Chargaff, segn la cual la suma de adeninas ms guaninas es igual a la suma de timinas ms citosinas. o Es una cadena doble, dextrgira o levgira, segn el tipo de ADN. Ambas cadenas son complementarias, pues la adenina y la guanina de una cadena se unen, respectivamente, a la timina y la citosina de la otra. Ambas cadenas son antiparalelas, pues el extremo 3 de una se enfrenta al extremo 5 de la homloga. o Existen tres modelos de ADN. El ADN de tipo B es el ms abundante y es el que tiene la estructura descrita por Watson y Crick. 3. Estructura terciaria: o Se refiere a cmo se almacena el ADN en un espacio reducido, para formar los cromosomas. Vara segn se trate de organismos procariotas o eucariotas: 2. En procariotas el ADN se pliega como una sper-hlice, generalmente en forma circular y asociada a una pequea cantidad de protenas. Lo mismo ocurre en orgnulos celulares como las mitocondrias y en los cloroplastos. 3. En eucariotas, dado que la cantidad de ADN de cada cromosoma es muy grande, el empaquetamiento ha de ser ms complejo y compacto; para ello se necesita la presencia de protenas, como las histonas y otras protenas de naturaleza no histnica (en los espermatozoides estas protenas son las protaminas).

Estructuras en doble hlice

De izquierda a derecha, las estructuras de ADN A, B y Z. El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos slo se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformacin que adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidad y direccin de superenrollamiento que presenta, la presencia de modificaciones qumicas en las bases y las condiciones de la solucin, 35 tales como la concentracin de iones de metales y poliaminas. De las tres conformaciones, la forma "B" es la ms comn en las condiciones existentes en las clulas. Las dos dobles hlices alternativas del ADN difieren en su geometra y dimensiones. La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, ms amplia que la "B", con una hendidura menor superficial y ms amplia, y una hendidura mayor ms estrecha y profunda. La forma "A" ocurre en condiciones no fisiolgicas en formas deshidratadas de ADN, mientras que en la clula puede producirse en apareamientos hbridos de hebras ADN-ARN, adems de en complejos enzima-ADN. Los segmentos de ADN en los que las bases han sido modificadas por metilacin pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la forma "Z". En este caso, las hebras giran alrededor del eje de la hlice en una espiral que gira a mano izquierda, lo opuesto a la forma "B" ms frecuente. Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por protenas especficas que se unen a ADN-Z y posiblemente estn implicadas en la regulacin de la transcripcin. Estructuras en cudruplex
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Estructura de un ADN en cudruplex formada por repeticiones en los telmeros. La 41 conformacin de la estructura de soporte del ADN difiere significativamente de la tpica estructura en hlice. En los extremos de los cromosomas lineales existen regiones especializadas de ADN denominadas telmeros. La funcin principal de estas regiones es permitir a la clula replicar los extremos cromosmicos utilizando la enzima telomerasa, 42 puesto que las enzimas que replican el resto del ADN no pueden copiar los extremos 3' de los cromosomas. Estas terminaciones cromosmicas especializadas tambin protegen los extremos del ADN, y evitan que los sistemas de 43 reparacin del ADN en la clula los procesen como ADN daado que debe ser corregido. En las clulas humanas, los telmeros son largas zonas de ADN de hebra sencilla que contienen algunos miles de repeticiones de una nica secuencia TTAGGG Estas secuencias ricas en guanina pueden estabilizar los extremos cromosmicos mediante la formacin de estructuras de juegos apilados de unidades de cuatro bases, en lugar de los pares de bases encontrados normalmente en otras estructuras de ADN. En este caso, cuatro bases guanina forman unidades con superficie plana que se apilan una sobre otra, para formar una estructura cudruple-G estable. Estas estructuras se estabilizan formando puentes de hidrgeno entre los extremos de las bases y la quelatacin de un metal inico en el centro de cada unidad de cuatro bases. Tambin se pueden formar otras estructuras, con el juego central de cuatro bases procedente, o bien de una hebra sencilla plegada alrededor de las bases, o bien de varias hebras paralelas diferentes, de forma que cada una contribuye con una base a la estructura central.

Adems de estas estructuras apiladas, los telmeros tambin forman largas estructuras en lazo, denominadas lazos telomricos o lazos-T (T-loops en ingls). En este caso, las hebras simples de ADN se enroscan sobre s mismas en un amplio crculo estabilizado por protenas que se unen a telmeros. En el extremo del lazo T, el ADN telomrico de hebra sencilla se sujeta a una regin de ADN de doble hebra porque la hebra de ADN telomrico altera la doble hlice y se aparea a una de las dos hebras. Esta estructura de triple hebra se denomina lazo de desplazamiento o lazo D (D-loop). Hendiduras mayor y menor

Animacin de la estructura de una seccin de ADN. Las bases se encuentran horizontalmente entre las dos hebras en espiral.

Doble hlice: a) Dextrgira, b) Levgira. La doble hlice es una espiral dextrgira, esto es, cada una de las cadenas de nucletidos gira a derechas; esto puede verificarse si nos fijamos, yendo de abajo a arriba, en la direccin que siguen los segmentos de las hebras que quedan en primer plano. Si las dos hebras giran a derechas se dice que la doble hlice es dextrgira, y si giran a izquierdas, levgira (esta forma puede aparecer en hlices alternativas debido a cambios conformacionales en el ADN). Pero en la conformacin ms comn que adopta el ADN, la doble hlice es dextrgira, girando cada par de bases respecto al anterior unos 36. Cuando las dos hebras de ADN se enrollan una sobre la otra (sea a derechas o a izquierdas), se forman huecos o hendiduras entre una hebra y la otra, dejando expuestos los laterales de las bases nitrogenadas del interior (ver la animacin). En la conformacin ms comn que adopta el ADN aparecen, como consecuencia de los ngulos formados entre los azcares de ambas cadenas de cada par de bases nitrogenadas, dos tipos de hendiduras alrededor de la superficie de la doble hlice: una de ellas, la hendidura o surco mayor, que mide 22 (2,2 nm) de ancho, y la otra, la hendidura o surco menor, que mide 12 (1,2 nm) de ancho.Cada vuelta de hlice, que es cuando sta ha realizado un giro de 360 o lo que es lo mismo, de principio de hendidura mayor a final de hendidura menor, medir por tanto 34 , y en cada una de esas vueltas hay unos 10,5 pb.

Hendiduras mayor y menor de la doble hlice.

La anchura de la hendidura mayor implica que los extremos de las bases son ms accesibles en sta, de forma que la cantidad de grupos qumicos expuestos tambin es mayor lo cual facilita la diferenciacin entre los pares de bases A-T, T-A, C-G, G-C. Como consecuencia de ello, tambin se ver facilitado el reconocimiento de secuencias de ADN por parte de diferentes protenas sin la necesidad de abrir la doble hlice. As, protenas como los factores de transcripcin que pueden unirse a secuencias especficas, frecuentemente contactan con los laterales de las bases expuestos en la hendidura mayor. Por el contrario, los grupos qumicos que quedan expuestos en la hendidura menor son similares, de forma que el reconocimiento de los pares de bases es ms difcil; por ello se dice que la hendidura mayor contiene ms informacin que la hendidura menor. Sentido y antisentido Una secuencia de ADN se denomina "sentido" (en ingls, sense) si su secuencia es la misma que la secuencia de un ARN mensajero que se traduce en una protena. La secuencia de la hebra de ADN complementaria se denomina "antisentido" (antisense). En ambas hebras de ADN de la doble hlice pueden existir tanto secuencias sentido, que codifican ARNm, como antisentido, que no lo codifican. Es decir, las secuencias que codifican ARNm no estn todas presentes en una sola de las hebras, sino repartidas entre las dos hebras. Tanto en procariotas como en eucariotas se producen ARNs con secuencias antisentido, pero la funcin de esos ARNs no est completamente clara. Se ha propuesto que los ARNs antisentido estn implicados en la regulacin de la expresin gnica mediante apareamiento ARN-ARN: los ARNs antisentido se aparearan con los ARNm complementarios, bloqueando de esta forma su traduccin. En unas pocas secuencias de ADN en procariotas y eucariotas (este hecho es ms frecuente en plsmidos y virus), la distincin entre hebras sentido y antisentido es ms difusa, debido a que presentan genes superpuestos. En estos casos, algunas secuencias de ADN tienen una funcin doble, codificando una protena cuando se lee a lo largo de una hebra, y una segunda protena cuando se lee en la direccin contraria a lo largo de la otra hebra. En bacterias, esta superposicin puede estar involucrada en la regulacin de la transcripcin del gen, mientras que en virus los genes superpuestos aumentan la cantidad de informacin que puede codificarse en sus diminutos genomas.

Superenrollamiento

Estructura de molculas de ADN lineales con los extremos fijos y superenrolladas. Por claridad, se ha omitido la estructura en hlice del ADN. El ADN puede retorcerse como una cuerda en un proceso que se denomina superenrollamiento del ADN (supercoiling, en ingls). Cuando el ADN est en un estado "relajado", una hebra normalmente gira alrededor del eje de la doble hlice una vez cada 10,4 pares de bases, pero si el ADN est retorcido las hebras pueden estar unidas ms estrechamente o ms relajadamente. Si el ADN est retorcido en la direccin de la hlice, se dice que el superenrollamiento es positivo, y las bases se mantienen juntas de forma ms estrecha. Si el ADN se retuerce en la direccin opuesta, el superenrollamiento se llama negativo, y las bases se alejan. En la naturaleza, la mayor parte del ADN tiene un ligero superenrollamiento negativo que es producido por enzimas denominadas topoisomerasas. Estas enzimas tambin son necesarias para liberar las fuerzas de torsin introducidas en las hebras de ADN durante procesos como la transcripcin y la replicacin.

Modificaciones qumicas

citosina

5-metil-citosina

timina

Estructura de la citosina con y sin el grupo metilo. Tras la desaminacin, la 5-metil-citosina tiene la misma estructura que la timina. Modificaciones de bases La expresin de los genes est influenciada por la forma en la que el ADN est empaquetado en cromosomas, en una estructura denominada cromatina. Las modificaciones de bases pueden estar implicadas en el empaquetamiento del ADN: las regiones que presentan una expresin gnica baja o nula normalmente contienen niveles altos de metilacin de las bases citosina. Por ejemplo, la metilacin de citosina produce 5-metil-citosina, que es importante para la inactivacin del cromosoma X. El nivel medio de metilacin vara entre organismos: el gusano Caenorhabditis elegans carece de metilacin de citosina, mientras que los vertebrados presentan un nivel alto - hasta 1% de su ADN contiene 5-metil-citosina. A pesar de la importancia de la 5-metil-citosina, sta puede desaminarse para generar una base timina. Las citosinas metiladas son por tanto particularmente sensibles a mutaciones. Otras modificaciones de bases incluyen la metilacin de adenina en bacterias y la glicosilacin de uracilo para producir la "base-J" en kinetoplastos. Dao del ADN

Benzopireno, el mayor mutgeno del tabaco, unido al ADN. El ADN puede resultar daado por muchos tipos de mutgenos, que cambian la secuencia del ADN: agentes alquilantes, adems de radiacin electromagntica de alta energa, como luz ultravioleta y rayos X. El tipo de dao producido en el ADN depende del tipo de mutgeno. Por ejemplo, la luz UV puede daar al ADN produciendo dmeros de timina, que se forman por ligamiento cruzado entre bases pirimidnicas. Por otro lado, oxidantes tales como radicales libres o el perxido de hidrgeno producen mltiples daos, incluyendo modificaciones de bases, sobre todo guanina, y roturas de doble hebra (double-strand breaks). En una clula humana cualquiera, alrededor de 500 bases sufren dao oxidativo cada da. De estas lesiones oxidativas, las ms peligrosas son las roturas de doble hebra, ya que son difciles de reparar y pueden producir mutaciones puntuales, inserciones y deleciones de la secuencia de ADN, as como translocaciones cromosmicas. Muchos mutgenos se posicionan entre dos pares de bases adyacentes, por lo que se denominan agentes intercalantes. La mayora de los agentes intercalantes son molculas aromticas y planas, como el bromuro de etidio, la daunomicina, la doxorubicina y la talidomida. Para que un agente intercalante pueda integrarse entre dos pares de bases, stas deben separarse, distorsionando las hebras de ADN y abriendo la doble hlice. Esto inhibe la transcripcin y la replicacin del ADN, causando toxicidad y mutaciones. Por ello, los agentes intercalantes del ADN son a menudo carcingenos: el benzopireno, 71 72 73 las acridinas, la aflatoxina y el bromuro de etidio son ejemplos bien conocidos. Sin embargo, debido a su capacidad para inhibir la replicacin y la transcripcin del ADN, estas toxinas tambin se utilizan en quimioterapia para inhibir el rpido 74 crecimiento de las clulas cancerosas. El dao en el ADN inicia una respuesta que activa diferentes mecanismos de reparacin que reconocen lesiones especficas en el ADN, que son reparadas en el momento para recuperar la secuencia original del ADN. Asimismo, el dao en el ADN

provoca una parada en el ciclo celular, que conlleva la alteracin de numerosos procesos fisiolgicos, que a su vez implica sntesis, transporte y degradacin de protenas (vase tambin Checkpoint de daos en el ADN). Alternativamente, si el dao genmico es demasiado grande para que pueda ser reparado, los mecanismos de control inducirn la activacin de una serie de rutas celulares que culminarn en la muerte celular. Funciones biolgicas Las funciones biolgicas del ADN incluyen el almacenamiento de informacin (genes y genoma), la codificacin de protenas (transcripcin y traduccin) y su autoduplicacin (replicacin del ADN) para asegurar la transmisin de la informacin a las clulas hijas durante la divisin celular. Genes y genoma El ADN se puede considerar como un almacn cuyo contenido es la informacin (mensaje) necesaria para construir y sostener el organismo en el que reside, la cual se transmite de generacin en generacin. El conjunto de informacin que cumple esta funcin en un organismo dado se denomina genoma, y el ADN que lo constituye, ADN genmico. El ADN genmico (que se organiza en molculas de cromatina que a su vez se ensamblan en cromosomas) se encuentra en el ncleo celular de los eucariotas, adems de pequeas cantidades en las mitocondrias y cloroplastos. En procariotas, el 75 ADN se encuentra en un cuerpo de forma irregular denominado nucleoide. [editar] El ADN codificante

(naranja).

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ARN polimerasa T7 (azul) produciendo un ARNm (verde) a partir de un molde de ADN

La informacin gentica de un genoma est contenida en los genes, y al conjunto de toda la informacin que corresponde a un organismo se le denomina su genotipo. Un gen es una unidad de herencia y es una regin de ADN que influye en una caracterstica particular de un organismo (como el color de los ojos, por ejemplo). Los genes contienen un "marco de lectura abierto" (open reading frame) que puede transcribirse, adems de secuencias reguladoras, tales como promotores y enhancers, que controlan la transcripcin del marco de lectura abierto. Desde este punto de vista, las obreras de este mecanismo son las protenas. Estas pueden ser estructurales, como las protenas de los msculos, cartlagos, pelo, etc., o funcionales, como la hemoglobina o las innumerables enzimas del organismo. La funcin principal de la herencia es la especificacin de las protenas, siendo el ADN una especie de plano o receta para producirlas. La mayor parte de las veces la modificacin del ADN provocar una disfuncin proteica que dar lugar a la aparicin de alguna enfermedad. Pero en determinadas ocasiones, las modificaciones podrn provocar cambios beneficiosos que darn lugar a individuos mejor adaptados a su entorno. Las aproximadamente treinta mil protenas diferentes en el cuerpo humano estn constituidas por veinte aminocidos diferentes, y una molcula de ADN debe especificar la secuencia en que se unen dichos aminocidos. En el proceso de elaborar una protena, el ADN de un gen se lee y se transcribe a ARN. Este ARN sirve como mensajero entre el ADN y la maquinaria que elaborar las protenas y por eso recibe el nombre de ARN mensajero o ARNm. El ARN mensajero sirve de molde a la maquinaria que elabora las protenas, para que ensamble los aminocidos en el orden preciso para armar la protena. El dogma central de la biologa molecular estableca que el flujo de actividad y de informacin era: ADN ARN protena. No obstante, en la actualidad ha quedado demostrado que este "dogma" debe ser ampliado, pues se han encontrado otros flujos de informacin: en algunos organismos (virus de ARN) la informacin fluye de ARN a ADN; este proceso se conoce como "transcripcin inversa o reversa", tambin llamada "retrotranscripcin". Adems, se sabe que existen secuencias de ADN que se transcriben a ARN y son funcionales como tales, sin llegar a traducirse nunca a protena: son los ARN no 33 34 codificantes, como es el caso de los ARN interferentes.

El ADN no codificante ("ADN basura") El ADN del genoma de un organismo puede dividirse conceptualmente en dos: el que codifica las protenas (los genes) y el que no codifica. En muchas especies, slo una pequea fraccin del genoma codifica protenas. Por ejemplo, slo alrededor del 1,5% del genoma humano consiste en exones que codifican protenas (20.000 a 25.000 genes), mientras que ms del 77 90% consiste en ADN no codificante. El ADN no codificante (tambin denominado ADN basura o junk DNA) corresponde a secuencias del genoma que no generan una protena (procedentes de transposiciones, duplicaciones, translocaciones y recombinaciones de virus, etc.), incluyendo los intrones. Hasta hace poco tiempo se pensaba que el ADN no codificante no tena utilidad alguna, pero estudios recientes indican que eso es inexacto. Entre otras funciones, se postula que el llamado "ADN basura" regula la 78 expresin diferencial de los genes. Por ejemplo, algunas secuencias tienen afinidad hacia protenas especiales que tienen la capacidad de unirse al ADN (como los homeodominios, los complejos receptores de hormonas esteroides, etc.), con un papel importante en el control de los mecanismos de trascripcin y replicacin. Estas secuencias se llaman frecuentemente "secuencias reguladoras", y los investigadores suponen que slo se ha identificado una pequea fraccin de las que realmente existen. La presencia de tanto ADN no codificante en genomas eucariticos y las diferencias en tamao del genoma entre especies representan un misterio que es conocido como el "enigma del valor de C". Recientemente, un grupo de investigadores de la Universidad de Yale ha descubierto una secuencia de ADN no codificante que sera la responsable de que los seres humanos hayan desarrollado la capacidad de agarrar y/o manipular objetos o herramientas. Por otro lado, algunas secuencias de ADN desempean un papel estructural en los cromosomas: los telmeros y centrmeros contienen pocos o ningn gen codificante de protenas, pero son importantes para estabilizar la estructura de los cromosomas. Algunos genes no codifican protenas, pero s se transcriben en ARN: ARN ribosmico, ARN de transferencia y ARN de interferencia (ARNi, que son ARN que bloquean la expresin de genes especficos). La estructura de intrones y exones de algunos genes (como los de inmunoglobulinas y protocadherinas) son importantes por permitir los cortes y empalmes alternativos del pre-ARN mensajero que hacen posible la sntesis de diferentes protenas a partir de un mismo gen (sin esta capacidad no existira el sistema inmune, por ejemplo). Algunas secuencias de ADN no codificante 34 representan pseudogenes que tienen valor evolutivo, ya que permiten la creacin de nuevos genes con nuevas funciones. Otros ADN no codificantes proceden de la duplicacin de pequeas regiones del ADN; esto tiene mucha utilidad, ya que el rastreo de estas secuencias repetitivas permite estudios de filogenia. CIDO RIBONUCLEICO (ARN) El cido ribonucleico (ARN o RNA, de RiboNucleic Acid, su nombre en ingls) es un cido nuclico formado por una cadena de ribonucletidos. Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas, y es el nico material gentico de ciertos virus (virus ARN). El ARN celular es lineal y de hebra sencilla, pero en el genoma de algunos virus es de doble hebra. En los organismos celulares desempea diversas funciones. Es la molcula que dirige las etapas intermedias de la sntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale del ARN para transferir esta informacin vital durante la sntesis de protenas (produccin de las protenas que necesita la clula para sus actividades y su desarrollo). Varios tipos de ARN regulan la expresin gnica, mientras que otros tienen actividad cataltica. El ARN es, pues, mucho ms verstil que el ADN Estructura qumica

Comparativa entre ARN y ADN.

Como el ADN, el ARN est formado por una cadena de monmeros repetitivos llamados nucletidos. Los nucletidos se unen uno tras otro mediante enlaces fosfodister cargados negativamente. Cada nucletido est formado por una molcula de monosacrido de cinco carbonos (pentosa) llamada ribosa (desoxirribosa en el ADN), un grupo fosfato, y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: adenina, guanina, uracilo (timina en el ADN) y citosina. Comparacin entre el ARN y el ADN ARN Pentosa Purinas Ribosa ADN Desoxirribosa

Adenina y Guanina Adenina y Guanina

Pirimidinas Citosina y Uracilo Citosina y Timina Los carbonos de la ribosa se numeran de 1' a 5' en sentido horario. La base nitrogenada se une al carbono 1'; el grupo fosfato se une al carbono 5' y al carbono 3' de la ribosa del siguiente nucletido. El fosfato tiene una carga negativa a pH fisiolgico lo que confiere al ARN carcter polianinico. Las bases pricas (adenina y guanina) pueden formar puentes de 12 hidrgeno con las pirimidnicas (uracilo y citosina) segn el esquema C=G y A=U. Adems, son posibles otras 13 12 interacciones, como el apilamiento de bases o tetrabucles con apareamientos G=A. Muchos ARN contienen adems de los nucletidos habituales, nucletidos modificados, que se originan por transformacin de los nucletidos tpicos; son carcatersticos de los ARN de transferencia (ARNt) y el ARN ribosmico (ARNr); tambin se 14 encuentran nucletidos metilados en el ARN mensajero eucaritico. Estructura secundaria

Apareamiento de bases complementarias en un ARN de hebra nica. A diferencia del ADN, las molculas de ARN son de cadena simple y no suelen formar dobles hlices extensas. No obstante, s se pliega como resultado de la presencia de regiones cortas con apareamiento intramolecular de bases, es decir, pares de bases formados por secuencias complementarias ms o menos distantes dentro de la misma hebra. El ARNt posee 14 aproximadamente el 60% de bases apareadas en cuatro brazos con estructura de doble hlice.

Una importante caracterstica estructural del ARN que lo distingue del ADN es la presencia de un grupo hidroxil en posicin 2' de la ribosa, que causa que las dobles hlices de ARN adopten una conformacin A, en vez de la conformacin B que es 15 la ms comn en el ADN. Esta hlice A tiene un surco mayor muy profundo y estrecho y un surco menor amplio y 16 superficial. Una segunda consecuencia de la presencia de dicho hidroxilo es que los enlaces fosfodister del ARN de las regiones en que no se forma doble hlice son ms susceptibles de hidrlisis qumica que los del ADN; los enlaces 17 fosfodister del ARN se hidrolizan rpidamente en disolucin alcalina, mientras que los enlaces del ADN son estables. La vida media de las molculas de ARN es mucho ms corta que las del ADN, de unos minutos en algunos ARN bacterianos o 14 de unos das en los ARNt humanos. Estructura terciaria

Estructura terciaria de un ARNt La estructura terciaria del ARN es el resultado del apilamiento de bases y de los enlaces por puente de hidrgeno entre diferentes partes de la molcula. Los ARNt son un buen ejemplo; en disolucin, estn plegados en forma de "L" compacta estabilizada por apareamientos de Watson y Crick convencionales (A=U, C=G) y por interacciones de bases entre dos o ms nucletidos, como tripletes de bases; las bases pueden donar tomos de hidrgeno para unirse al esqueleto fosfodister; el OH del carbono 2' de la ribosa es tambin un importante dador y aceptor de hidrgenos. Biosntesis La biosntesis de ARN est catalizada normalmente por la enzima ARN polimerasa que usa una hebra de ADN como molde, proceso conocido con el nombre de transcripcin. Por tanto, todos los ARN celulares provienen de copias de genes presentes en el ADN. La transcripcin comienza con el reconocimiento por parte de la enzima de un promotor, una secuencia caracterstica de nucletidos en el ADN situada antes del segmento que va a transcribirse; la doble hlice del ADN es abierta por la actividad helicasa de la propia enzima. A continuacin, la ARN polimerasa progresa a lo largo de la hebra de ADN en sentido 3' 5', sintetizando una molcula complementaria de ARN; este proceso se conoce como elongacin, y el crecimiento de la molcula de ARN se produce en sentido 5' 3'. La secuencia de nucletidos del ADN determina tambin dnde acaba la sntesis del ARN, gracias a que posee secuencias caractersticas que la ARN polimerasa reconoce como seales de 18 terminacin. Tras la transcripcin, la mayora de los ARN son modificados por enzimas. Por ejemplo, al pre-ARN mensajero eucariota recin transcrito se le aade un nucletido de guanina modificado (7-Metilguanosina) en el extremo 5' por medio de un puente de trifosfato formando un enlace 5' 5' nico, tambin conocido como "capucha" o "caperuza", y una larga secuencia de nucletidos de adenina en el extremo 3' (cola poli-A); posteriormente se le eliminan los intrones (segmentos no codificantes) en un proceso conocido como splicing. En virus, hay tambin varias ARN polimerasas ARN-dependientes que usan ARN como molde para la sntesis de nuevas 19 molculas de ARN. Por ejemplo, varios virus ARN, como los poliovirus, usan este tipo de enzimas para replicar su genoma.
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Tipos de ARN El ARN mensajero (ARNm) es el tipo de ARN que lleva la informacin del ADN a los ribosomas, el lugar de la sntesis de 21 protenas. La secuencia de nucletidos del ARNm determina la secuencia de aminocidos de la protena. Por ello, el ARNm es denominado ARN codificante. No obstante, muchos ARN no codifican protenas, y reciben el nombre de ARN no codificantes; se originan a partir de genes propios (genes ARN), o son los intrones rechazados durante el proceso de splicing. Son ARN no codificantes el ARN de

transferencia (ARNt) y el ARN ribosmico (ARNr), que son elementos fundamentales en el proceso de traduccin, y diversos 22 tipos de ARN reguladores. Ciertos ARN no codificantes, denominados ribozimas, son capaces de catalizar reacciones qumicas como cortar y unir otras 23 24 molculas de ARN, o formar enlaces peptdicos entre aminocidos en el ribosoma durante la sntesis de protenas. ARN implicados en la sntesis de protenas

Ribosoma 50S mostrando el ARNr (amarillo), las protenas (azul) y el centro activo, la adenina 2486 (rojo). ARN mensajero. El ARN mensajero (ARNm o RNAm) lleva la informacin sobre la secuencia de aminocidos de la protena desde el ADN, lugar en que est inscrita, hasta el ribosoma, lugar en que se sintetizan las protenas de la clula. Es, por tanto, una molcula intermediaria entre el ADN y la protena y el apelativo de "mensajero" es del todo descriptivo. En eucariotas, el ARNm se sintetiza en el nucleoplasma del ncleo celular y de all accede al citosol, donde se hallan los ribosomas, a travs de los poros de la envoltura nuclear. ARN de transferencia. Los ARN de transferencia (ARNt o tRNA) son cortos polmeros de unos 80 nucletidos que transfiere un aminocido especfico al polipptido en crecimiento; se unen a lugares especficos del ribosoma durante la traduccin. Tienen un sitio especfico para la fijacin del aminocido (extremo 3') y un anticodn formado 22 por un triplete de nucletidos que se une al codn complementario del ARNm mediante puentes de hidrgeno. ARN ribosmico. El ARN ribosmico (ARNr o RNAr) se halla combinado con protenas para formar los ribosomas, donde representa unas 2/3 partes de los mismos. En procariotas, la subunidad mayor del ribosoma contiene dos molculas de ARNr y la subunidad menor, una. En los eucariotas, la subunidad mayor contiene tres molculas de ARNr y la menor, una. En ambos casos, sobre el armazn constituido por los ARNr se asocian protenas especficas. El ARNr es muy abundante y representa el 80% del ARN hallado en el citoplasma de las clulas 25 eucariotas. Los ARN ribosmicos son el componente cataltico de los ribosomas; se encargan de crear los enlaces peptdicos entre los aminocidos del polipptido en formacin durante la sntesis de protenas; actan, pues, como ribozimas.

ARN reguladores Muchos tipos de ARN regulan la expresin gnica gracias a que son complementarios de regiones especficas del ARNm o de genes del ADN. . ARN de interferencia. Los ARN interferentes (ARNi o iRNA) son molculas de ARN que suprimen la expresin de genes especficos mediante mecanismos conocidos globalmente como ribointerferencia o interferencia por ARN. Los ARN interferentes son molculas pequeas (de 20 a 25 nuclotidos) que se generan por fragmentacin de 26 precursores ms largos. Se pueden clasificar en tres grandes grupos: o Micro ARN. Los micro ARN (miARN o RNAmi) son cadenas cortas de 21 22 nucletidos hallados en clulas eucariotas que se generan a partir de precursores especficos codificados en el genoma. Al transcribirse, se pliegan en horquillas intramoleculares y luego se unen a enzimas formando un complejo efector que puede bloquear la traduccin del ARNm o acelerar su degradacin comenzando por la 27 28 eliminacin enzimtica de la cola poli A. o ARN interferente pequeo. Los ARN interferentes pequeo (ARNip o siARN), formados por 20-25 nucletidos, se producen con frecuencia por rotura de ARN virales, pero pueden ser tambin de origen 29 30 endgeno. Tras la transcripcin se ensambla en un complejo proteico denominado RISC (RNA-induced silencing complex) que identifica el ARNm complementario que es cortado en dos mitades que son 31 32 33 degradadas por la maquinaria celular, bloquean as la expresin del gen. 34 o ARN asociados a Piwi. Los ARN asociados a Piwi son cadenas de 29-30 nucletidos, propias de animales; se generan a partir de precursores largos monocatenarios, en un proceso que es independiente de Drosha y

Dicer. Estos ARN pequeos se asocian con una subfamilia de las protenas "Argonauta" denominada protenas Piwi. Son activos las clulas de la lnea germinal; se cree que son un sistema defensivo contra los 35 36 transposones y que juegan algn papel en la gametognesis. ARN antisentido. Un ARN antisentido es la hebra complementaria (no codificadora) de un hebra ARNm 37 (codificadora). La mayora inhiben genes, pero unos pocos activan la transcripcin. El ARN antisentido se aparea con su ARNm complementario formando una molcula de doble hebra que no puede traducirse y es degradada 38 enzimticamente. La introduccin de un transgen codificante para un ARNm antisentido es una tcnica usada para bloquear la expresin de un gen de inters. Un mARN antisentido marcado radioactivamente puede usarse para mostrar el nivel de transcripcin de genes en varios tipos de clulas. Algunos tipos estructurales antisentidos son experimentales, ya que se usan como terapia antisentido. ARN largo no codificante. Muchos ARN largos no codificantes (ARNnc largo o long ncARN) regulan la expresin 39 gnica en eucariotas; uno de ellos es el Xist que recubre uno de los dos cromosomas X en las hembras de los 40 mamferos inactivndolo (corpsculo de Barr). Riboswitch. Un riboswitch es una parte del ARNm (cido ribonucleico mensajero) al cual pueden unirse pequeas 41 42 43 molculas que afectan la actividad del gen. Por tanto, un ARNm que contenga un riboswitch est directamente implicado en la regulacin de su propia actividad que depende de la presencia o ausencia de la molcula sealizadora. Tales riboswitchs se hallan en la regin no traducida 5' (5'-UTR), situada antes del codn de inicio 14 (AUG), y/o en la regin no traducida 3' (3'-UTR), tambin llamada secuancia de arrastre, situada entre el codn de terminacin (UAG, UAA o UGA) y la cola poli A.

BASE NITROGENADA

Apareamiento GC con tres puentes de hidrgeno.

Apareamiento A=T con dos puentes de hidrgeno. Los puentes de hidrgeno se muestran como lneas discontinuas. Las bases nitrogenadas son compuestos orgnicos cclicos, que incluyen dos o ms tomos de nitrgeno. Son parte fundamental de los nuclesidos, nucletidos, nucletidos cclicos (mensajeros intracelulares), dinucletidos (poderes reductores) y cidos nucleicos. Biolgicamente existen seis bases nitrogenadas principales (en realidad hay muchas ms), que se clasifican en tres grupos, bases isoaloxaznicas (derivadas de la estructura de la isoaloxazina), bases pricas o purnicas (derivadas de la estructura de la purina) y bases pirimidnicas (derivadas de la estructura de la pirimidina). La flavina (F) es isoaloxaznica, la adenina (A) y la guanina (G) son pricas, y la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U) son pirimidnicas. Por comodidad, cada una de las bases se representa por la letra indicada. Las bases A, T, G y C se encuentran en el ADN, mientras que en el ARN en lugar de timina aparece el uracilo.

Complementariedad entre purinas y pirimidinas Un punto fundamental es que las purinas y pirimidinas son complementarias entre s, es decir, forman parejas de igual manera que lo haran una llave y su cerradura; son los denominados apareamientos de Watson y Crick. La adenina y la timina son complementarias (A=T), unindose gracias a dos puentes de hidrgeno, mientras que la guanina y la citosina (GC) se unen mediante tres puentes de hidrgeno. Dado que en el ARN no existe timina, la complementariedad se establece entre adenina y uracilo (A=U) mediante dos puentes de hidrgeno. La complementariedad de las bases es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones, pues permite procesos como la replicacin del ADN, la transcripcin de ADN a ARN y la traduccin del ARN en protenas. Estructura El "esqueleto" de las flavinas es la isoaloxazina, por lo que son bases isoaloxaznicas. El "esqueleto" de adenina, hipoxantina, xantina, etc. es la purina, por lo que toman el nombre de bases pricas o purnicas. El "esqueleto" de citosina, uracilo, timina, nicotina, nicotinamida, etc. es la pirimidina, son bases pirimdicas.

Isoaloxazinas Base nitrogenada Nuclesido

Flavina

Riboflavina F

Purinas Base nitrogenada Nuclesido

Adenina

Adenosina A

Guanina

Guanosina G

Pirimidinas

Base nitrogenada

Nuclesido

Timina

Timidina T

Citosina

Citidina C

Uracilo

Uridina U

REPLICACIN DE ADN

Replicacin de ADN. La doble hlice es desenrollada y cada hebra hace de plantilla para la sntesis de la nueva cadena. La ADN polimerasa aade los nucletidos complementarios a los de la cadena original. El proceso de replicacin de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idntica). De esta manera de una molcula de ADN nica, se obtienen dos o ms "clones" de la primera. Esta duplicacin del material gentico se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la sntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hlice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementariedad entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idnticamente, lo que permite que la informacin gentica se transmita de una clula madre a las clulas hijas y es la base de la herencia del material gentico.

La molcula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrgeno entre las bases complementarias liberndose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria aadiendo nucletidos que se encuentran dispersos en el ncleo. De esta forma, cada nueva molcula es idntica a la molcula de ADN inicial. La replicacin empieza en puntos determinados: los orgenes de replicacin. Las protenas iniciadoras reconocen secuencias de nucletidos especficas en esos puntos y facilitan la fijacin de otras protenas que permitirn la separacin de las dos hebras de ADN formndose una horquilla de replicacin. Un gran nmero de enzimas y protenas intervienen en el mecanismo molecular de la replicacin, formando el llamado complejo de replicacin o replisoma. Estas protenas y enzimas son homlogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias. Caractersticas generales Semiconservadora

Tres posibles modelos de replicacin. a) Conservadora, b) Dispersora, c) Semiconservadora (mecanismo real) En cada una de las molculas hijas se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicacin del ADN es semiconservadora. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicacin es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicacin: Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las molculas hijas se conserva una de las cadenas originales. Conservadora. Se sintetiza una molcula totalmente nueva, copia de la original. Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

Experimento de Meselson y Stahl. El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permiti demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hiptesis de replicacin semiconservadora. Para ello se hicieron crecer clulas de Escherichia coli en presencia de nitrgeno-15, un istopo del nitrgeno ms pesado de lo habitual. En consecuencia, el istopo se incorpor a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, hacindolas ms pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las clulas fueron transferidas a un medio que contena nitrgeno-14, es decir, un medio ms ligero, donde continuaron su crecimiento (divisin celular, que requiere la replicacin del ADN). Se purific el ADN y se analiz mediante una centrifugacin en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay ms densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo. En la primera generacin (figura 2.b) se obtuvo una nica banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generacin (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o hbrida. En la tercera generacin se obtuvieron dos bandas, una ligera (con una abundancia del 75%) y otra intermedia (con el 25% restante). La banda intermedia o hbrida representa una molcula de ADN que contiene una cadena pesada (original) y otra ligera (recin sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molcula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existan aun cuando las clulas se pusieron en presencia de nitrgeno-15. El hecho de que cada vez haya ms molculas ligeras y se mantenga el nmero de molculas intermedias demuestra que la replicacin del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecera siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante slo apareceran bandas hbridas de densidad intermedia en todas las 1 generaciones. Secuencial y bidireccional desde puntos fijos. Los orgenes de replicacin son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. Por otro lado, la replicacin se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. El origen de replicacin La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin. El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariticos, la replicacin del 2 ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.

En las clulas eucariotas hay varios replicones

Experimento de Cairns Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicacin a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistan en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contena timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografa. A continuacin se observaba al 3 microscopio. Los resultados indicaban que la replicacin en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC). Secuencialidad

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genticos de complementacin de mutaciones que permitieron determinar que desde los orgenes la replicacin avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las clulas del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El mtodo consista en la conjugacin bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminocidos. Conociendo la localizacin de los genes que codifican las protenas implicadas en la sntesis de los diferentes aminocidos en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un "medio mnimo" (donde slo pudiesen crecer las que hubieran recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se observ que, tras la ltima extraccin apareca con mayor frecuencia el gen implicado en la sntesis de uno de los aminocidos (el correspondiente a la "posicin 1"), que el gen adyacente implicado en la sntesis de otro aminocido ("posicin 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posicin 3" apareca con menor frecuencia que el que ocupaba la "posicin 2", y as sucesivamente. Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora seran los primeros en transferirse, el experimento permiti demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacterias receptoras, que la replicacin sigue un orden (es secuencial).

La replicacin avanza en forma de horquilla Debido a que en la clula ambas cadenas de la doble hlice de ADN se duplican al mismo tiempo, stas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la sntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicacin avanza con una estructura en forma de horquilla formndose una burbuja u ojo de replicacin (tambin llamada estructura cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados 3 intermedios de replicacin, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas), que avanza en direccin a la regin de 2 ADN no duplicado dejando atrs los dos moldes de ADN de cadena simple donde se est produciendo la replicacin. Bidireccionalidad El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayora de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayora de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicacin que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si 3 el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario). As, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plsmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeos, la replicacin se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orgenes de replicacin.

Distincin entre la replicacin unidireccional y la bidireccional mediante el recuento de copias de genes marcadores. O es el origen de replicacin y A, B, C, D, E son genes marcadores.

En la mayora de los casos la replicacin es bidireccional

No obstante, la replicacin se puede considerar, de forma general, bidireccional. La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una tcnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se aade timidina marcada y luego sin marcar, y 3 siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dnde se ha replicado la molcula de ADN. Tambin se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicacin es unidireccional o bidireccional. Otras tcnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicacin hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restriccin). Semidiscontinua

La replicacin es semidiscontnua La replicacin siempre se produce en sentido 5' 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongacin del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debera ser sintetizada en direccin 3' 5'. Este problema lo resolvieron los cientficos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en la dcada de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucletidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucletidos en eucariontes. La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicacin se denomina hebra adelantada (en ingls, leading strand, que a veces se traduce por lder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en ingls, lagging strand), cuya sntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de replicacin 2 avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde. ADN Polimerasas

Estructura en 3D de un ADN polimerasa La ADN polimerasa es la enzima que cataliza la sntesis de la nueva cadena de ADN a partir de desoxirribonucletidos y de la molcula de ADN plantilla o molde que es la que ser replicada. La enzima copia la cadena de nucletidos de forma complementaria (A por T, C por G) para dar a cada clula hija una copia del ADN durante la replicacin. Modo de operacin

En cada horquilla de replicacin, la ADN polimerasa y otras enzimas sintetizan dos nuevas cadenas de ADN que son complementarias respecto a las 2 cadenas originales. Durante este proceso, la ADN polimerasa reconoce una base nucleotdica no apareada de la cadena original y la combina con un nucletido libre que tiene la base complementaria correcta. Luego, la ADN polimerasa cataliza la formacin de nuevos enlaces covalentes que liganel fosfato del nucletido libre entrante con el azcar del nucletido previamente agregado en la cadena hija en crecimiento. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el esqueleto de azcar-fosfato de la cadena hija.

Funcin correctora exonucleasa 3' 5' de las ADN polimerasas. Las ADN polimerasas tambin realizan otras funciones durante el proceso de replicacin. Adems de participar en la elongacin, desempean una funcin correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de ste. Es importante que existan estos mecanismos de correccin ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN daran lugar a mutaciones. Proceso general

La helicasa rompe los puentes de hidrgeno de la doble hlice permitiendo el avance de la horquilla de replicacin. La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separacin de la doble hlice. Las protenas SSB se unen la hebra discontnua de ADN, impidiendo que sta se una consigo misma. La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontnua en la hebra rezagada. La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la sntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada. La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciacin, elongacin y terminacin.

El cebador: son pequeas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que la ADN polimerasa reconozca donde debe unirse.

Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa. Iniciacin Mediante consumo de ATP en direccin a la horquilla de replicacin, es decir, en direccin 5' 3' en la hebra rezagada y 3' 3 5' en la hebra adelantada, rompiendo los puentes de hidrgeno que mantienen unida la doble hlice. El siguiente conjunto de protenas reclutadas son las denominadas protenas SSB (single-stranded DNA binding proteins, protenas ligantes de ADN monocatenario) encargadas de la estabilizacin del ADN monocatenario generado por la accin de las helicasas, impidiendo as que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hlice, de manera que pueda servir de molde. Estas protenas se unen de forma cooperativa, por lo que su unin al DNA conforme avanza la helicasa es rpida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si stos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podra seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y 2 pasndolas a travs de la rotura realizada, sellando a continuacin la brecha. Elongacin Enzimas que participan en la replicacin de E. coli: helicasa, protenas SSB, topoisomerasa, ARN primasa, Holoenzima ADN Pol III

En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la sntesis de las nuevas cadenas aadiendo nucletidos sobre el molde. Esta sntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicacin que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado. Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formacin de un fragmento corto especfico de ARN llamado cebador, que determinar el punto por donde la ADN polimerasa comienza a aadir nucletidos. As, durante la sntesis, en cada horquilla de replicacin se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciacin, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que slo es capaz de sintetizar en sentido 5 3', la replicacin slo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki. La mitad del dmero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada.
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Hebra rezagada: sntesis de cebadores, unin de fragmentos de Okazaki y eliminacin de los cebadores

Enzimas que participan en la eliminacin de cebadores y unin de los fragmentos de Okazaki. El cebador de ARN est pintado en azul y el ADN que lo reemplaza en naranja En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de ste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recin sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hlice de ADN. La eliminacin de cebadores tambin se da en la hebra conductora, de sntesis continua, pero debido a que en sta hay un solo cebador es un proceso que slo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dar tantas veces como fragmentos de Okazaki haya. En la eliminacin del fragmento de Okazaki (tambin denominado iniciador, cebador o primer) intervienen dos de enzimas: por un lado la ADN Pol I, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5' 3' y simultneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por ltimo, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reaccin de condensacin entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucletido contiguo, completando el enlace fosfodister; para ello, es preciso hidrolizar una molcula de ATP.

Nota: diversos autores difieren en los enzimas implicados en esta etapa. Para algunos no es la propia ADN Pol I la que rellena el hueco tras eliminar el primer, sino que lo hace la ADN Pol III (la misma que polimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos autores siguen empleando el trmino ribonucleasa o (RNasa) para referirse a la ADN Pol I en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconoca que la propia ADN Pol I tena la capacidad exonucleasa 5' 3, y se pensaba que esto lo realizaba otro enzima, que reciba este nombre genrico.

Terminacin Terminacin de los genomas lineales El final de la replicacin se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra con una secuencia de terminacin. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la finalizacin de la replicacin. ENZIMA DE RESTRICCIN Una enzima de restriccin (o endonucleasas de restriccin) es aquella que puede reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy lejano a ste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. El mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de la ruptura de dos enlaces fosfodister en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. stos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercana (Apareamiento de Watson & Crick).

Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.

Restriccin de SmaI dejando extremos romos. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos as el ADN vector, que sera aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la clula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores estn los plsmidos, molculas circulares de ADN halladas en las bacterias. Las enzimas de restriccin que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizmeros. Por ejemplo, estn los isoesquizmeros Asp718 y KpnI. El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbilogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin lo que condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante. El primer uso prctico de su trabajo fue la manipulacin de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabticos. Uno de los campos en los que el uso de enzimas de restriccin ha tenido mayor implicacin ha sido el diagnstico de enfermedades genticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si stas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin, al producirse eliminarn o agregarn nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberan observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis. Sistemas de restriccin-modificacin (M-R) El sistema de restriccin-modificacin (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exgenos (normalmente vricos) que ingresen en la bacteria, distinguindolo del ADN propio, anlogo a un sistema inmune. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restriccin, puesto que previamente lo ha modificado por metilacin a travs de la accin de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases especficas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infeccin del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas K12 y B). Este sistema consta de dos partes: Restriccin: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exgenos para evitar la promiscuidad en los intercambios genticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad gentica o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a travs de cortes mediante endonucleasas de restriccin a los DNA exgenos que ingresen a la bacteria.

Modificacin: Consiste en la introduccin de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual est catalizado por una metilasa especfica.

Existen varios mecanismos de accin generales de estos sistemas, de los cuales destacan el tipo I y el tipo II: M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo caracterstico de los sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificacin y las de restriccin estn producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades. Algunas caractersticas son: Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetras. La actividad de restriccin (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecficos. La restriccin requiere de ATP. La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupos metilo.

M-R tipo II: Aqu cada subunidad del dmero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del palndromo, y realiza un corte en un lugar especfico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palndromo. Ms de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plsmidos. Algunas caractersticas que tiene este mecanismo son: Las dos actividades las realizan dos protenas distintas que no forman complejos multiproteicos. No utilizan ATP. Slo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM como donador de metilos. Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce la misma secuencia especfica de ADN. El sitio de reconocimiento consta de 4 6 pb que constituyen una secuencia palindrmica. La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (segn la metilasa en cuestin), en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento. La enzima de restriccin suele ser una protena formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simtricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de restriccin dejan extremos sobresalientes 5', mientras que otras dejan extremos sobresalientes 3'.

Tipos de enzimas de restriccin Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restriccin: Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y modificacin (metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), adems de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores. Tipo 2: Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la metilacin. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta caracterstica es que son muy utilizadas para clonacin de genes, ya que al cortar en sitios especficos se pueden recuperar secuencias conocidas. Slo requieren Mg ++ como cofactor, no necesitan de ATP... Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas. Tienen funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientacin opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg ++ y SAM (S-adenosilmetionina) como cofactores.

Hay otros sistemas de restriccin descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta nicamente DNA metilado en una secuencia especfica, y que adems metila. Nomenclatura El nombre de cada enzima de restriccin est asignado segn el origen bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en: 1. Tres letras que corresponden al nombre cientfico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva. 2. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli ) 3. En nmeros romanos, un nmero para distinguir si hay ms de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restriccin. 4. Todas deberan llevar delante una R de restriccin o un M de metilasa segn la funcin de la enzima, pero generalmente se omite.

De esta manera, el nombre de la enzima de restriccin EcoRI se construira de la siguiente manera: Nomenclatura E co R I Ejemplo Escherichia coli RY13 La primera enzima identificada Corresponde a: Gnero de la bacteria Especie de la bacteria Cepa de la bacteria Orden de identificacin de la enzima en la bacteria

As mismo, las enzimas HaeII y HaeIII provienen de Haemophilus aegyptius, MboI y MboII de Moraxella bovis, etc. Ejemplos En esta tabla se presentan algunas enzimas de restriccin, con su respectivo origen bacteriano y sitio de reconocimiento. Enzima EcoRI Origen Bacteriano Escherichia coli Sitio de Reconocimiento 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'GGATCC 3'CCTAGG CH3 | 5'GATC 3'CTAG | CH3 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'TCGA 3'AGCT 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'GANTC 3'CTNAG 5'GATC 3'CTAG 5'CAGCTG 3'GTCGAC Resultado del Corte 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5' 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' CH3 | 5'---GA TC---3' 3'---CT AG---5' | CH3 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' 5'--GATC---3' 3'---CTAG ---3' 5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens

DpnI*

Diplococcus pneumoniae

HindIII Haemophilus influenzae TaqI NotI HinfI Sau3A PovII* Thermus aquaticus Nocardia otitidis Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Proteus vulgaris

5'CCCGGG 3'GGGCCC 5'GGCC HaeIII* Haemophilus egytius 3'CCGG 5'AGCT AluI* Arthrobacter luteus 3'TCGA 5'GATATC EcoRV* Escherichia coli 3'CTATAG 5'GGTACC KpnI1 Klebsiella pneumonia 3'CCATGG 5'CTGCAG PstI1 Providencia stuartii 3'GACGTC 5'GAGCTC SacI1 Streptomyces achromogenes 3'CTCGAG 5'GTCGAC SalI1 Streptomyces albue 3'CAGCTG 5'GCATGC SphI1 Streptomyces phaeochromogenes 3'CGTACG 5'TCTAGA XbaI1 Xanthomonas badrii 3'AGATCT * = ADN queda con extremos romos SmaI* Serratia marcescens

5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5' 5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5' 5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' 5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Cultivo de clulas y tejidos El cultivo de tejidos fue desarrollado a principios de siglo XX como un mtodo de estudio del comportamiento de las clulas animales, libres de las variaciones sistmicas, y mantenidas en condiciones controladas. Primariamente se limitaba al estudio de las clulas capaces de migrar fuera del tejido cultivado. Con el desarrollo posterior de las tcnicas de disgregado celular y de seleccin de distintos tipos celulares especficos fue posible obtener cultivos de clulas aisladas y cultivos enriquecidos en determinado tipo celular. Se denominaron a partir de ese momento de forma diferente a los distintos tipos de cultivos. El cultivo rgano-tpico implica que se cultiva un trozo de rgano manteniendo su conformacin espacial caracterstica y sus diversos tipos celulares. El cultivo histo-tpico por otro lado, se caracteriza por la re asociacin de clulas de alguna forma para asemejar a la estructura del tejido original. El cultivo de clulas es el nombre que se utiliza para describir el cultivo de clulas disociadas y mantenidas directamente sobre la superficie del recipiente de cultivo. sta es un una poderosa herramienta para el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicacin y transcripcin del ADN, sntesis proteica, metabolismo energtico, nutricin, infecciones virales, transformacin maligna, accin de drogas, toxicidad, secrecin de productos especializados, desarrollo embrionario, etc. Adems debe mencionarse la posibilidad del cultivo de tejidos con fines de reintroduccin reparativa en diferentes patologas como por ejemplo el Parkinson. Como ventajas de esta metodologa podran citarse: Control del medio ambiente celular: permite mantener a las clulas bajo condiciones similares a las fisiolgicas de forma estable, y modificar a su vez nicamente las variables de inters. Caracterizacin y homogeneidad de la muestra: las muestras de tejidos son invariablemente heterogneas, sin embargo generalmente luego de uno o dos pasajes, las lneas celulares asumen una constitucin uniforme al ser mezcladas al azar y al actuar las fuerzas selectivas en favor de los tipos celulares que se dividen ms rpidamente en esas condiciones. Se generan as rplicas casi idnticas disponibles para protocolos de anlisis clnicos o de investigacin. Economa y practicidad: los cultivos pueden ser expuestos a una concentracin menor y conocida de cierta sustancia, existiendo un acceso directo a las clulas. Asimismo, en un solo experimento pueden realizarse una gran cantidad de duplicados y tratamientos distintos, sin tener que recurrir primariamente a grupos de animales.

Como desventajas podran citarse: Experiencia requerida: las tcnicas de cultivo deben ser llevadas a cabo en condiciones de asepsia estrictas, ya que las clulas animales crecen mucho menos rpido que los contaminantes biolgicos. Adems, las clulas de los metazoos no son capaces de vivir de forma aislada fuera del animal, con lo cual se requiere un ambiente de cultivo muy complejo, que simule el plasma sanguneo o el fluido intersticial. In vitro no es in vivo: muchas de las diferencias entre el comportamiento de clulas en cultivo e in vivo se generan debido a la disociacin de las clulas de su geometra tisular tridimensional, y a su propagacin en un sustrato que no solo es bidimensional sino que carece de muchos de los elementos de la matriz extracelular organizada del animal. Las interacciones clula-clula, las caractersticas del tejido se pierden, cambian las proporciones relativas de tipos celulares, y el estadio y regulacin del ciclo celular. Asimismo, el ambiente del cultivo carece tambin de muchos componentes sistmicos, involucrados en la homeostasis y en los diversos ciclos del animal.

Es posible encontrar muchas ms diferencias in vivo-in vitro, lo cual ha llevado a ver al cultivo de clulas con ojos escpticos, sin embargo resulta innegable que muchas funciones especializadas son expresadas in vitro, de tal forma que si se comprenden las limitaciones del modelo puede transformarse en una herramienta poderosa. Biologa de la clula en cultivo Luego del primer sub-cultivo o pasaje, el cultivo primario se denomina lnea celular, y podr ser propagado y sub-cultivado varias veces. Con cada sub-cultivo sucesivo, las clulas con una lenta velocidad de divisin o con menor resistencia a las manipulaciones o tratamientos de disgregado se perdern, y el cultivo ser cada vez ms homogneo y estable. Las lneas celulares pueden ser propagadas de forma inalterada por un nmero limitado de generaciones, luego de lo cual mueren o dan origen a lneas celulares continuas. La alteracin en cultivo dando origen a una lnea celular continua se denomina comnmente transformacin in vitro, y puede ocurrir espontneamente o en forma inducida con agentes qumicos o virus. Sin embargo, la inmensa mayora de las clulas normales no dan origen a lneas celulares continuas. Un ejemplo clsico de historia de vida de un cultivo lo constituyen los fibroblastos humanos, que se mantienen euploides durante su vida en cultivo, hasta la denominada crisis del cultivo (unas 50 generaciones despus), deteniendo sus divisiones y comenzando un perodo de senescencia final. Metodologa del cultivo: tcnica asptica y cmaras de flujo laminar Tcnica asptica.

A pesar de la utilizacin de antibiticos en los medios de cultivo, la contaminacin por microorganismos contina siendo uno de los mayores problemas del cultivo de clulas. Las bacterias, los mico plasmas, las levaduras y las esporas de los hongos, pueden ser introducidas va el operador, la atmsfera, la superficie de trabajo, las soluciones, etc. Una correcta y rigurosa tcnica asptica por parte del operador, conjuntamente con la utilizacin de soluciones y materiales probadamente estriles son imprescindibles para el mantenimiento de los cultivos libres de contaminantes biolgicos. Cmaras de flujo laminar

La cmara de flujo laminar es un dispositivo que permite al operador trabajar en condiciones aspticas en un rea bajo un flujo laminar de aire estril. Existen tres tipos de cmaras de flujo laminar. Las cmaras tipo I son utilizadas para la preparacin de soluciones y el trabajo con microorganismos o cultivos de clulas animales no humanas o de primates. Las cmaras de flujo horizontales y algn tipo de verticales son de esta clase. Claramente la cmara que ofrece menor seguridad al operador es la de flujo horizontal, si bien es tambin la que posee el flujo de aire ms estable y la mejor proteccin frente a las infecciones de los cultivos. Las cmaras de flujo laminar tipo II y III son de flujo vertical, e incorporan diversas protecciones para el operador y el medio. Las de tipo III son de mxima seguridad, en estas el operador no posee contacto directo con los materiales de trabajo (solo a travs de guantes sellados hermticamente contra la pared delantera de la cmara), todo el aire que sale de la zona de trabajo es re filtrado, y todo el material utilizado es auto clavado antes de entrar y de salir de la cmara. Este tipo de cmaras son utilizadas para el trabajo con agentes infecciosos humanos. Ambiente de cultivo: sustratos, fase gaseosa, medios de cultivo y propiedades fsicas La influencia del ambiente de cultivo sobre las clulas es ejercida por cuatro vas principales: (i) naturaleza del sustrato o fase sobre o dentro de la que crecen las clulas, (ii) constitucin fisicoqumica y fisiolgica del medio de cultivo, (iii) constitucin de la fase gaseosa, y (iv) propiedades fsicas como la temperatura de incubacin.

(i) Sustrato. La mayora de las clulas que han sido crecidas en cultivo, han sido cultivadas en mono capa sobre sustratos artificiales, y el crecimiento en suspensin slo ha sido posible para ciertos tipos celulares como las clulas hematopoyticas y otros pocos tipos. Es sabido ya que la mayora de las clulas necesitan adherirse y extenderse sobre el sustrato para poder dividirse, con lo cual una correcta adherencia al sustrato resulta fundamental. Actualmente, las placas de cultivo de polietileno descartables proveen al investigador de una superficie de cultivo simple y reproducible para el cultivo, combinado con buenas propiedades pticas. Otro sustrato muy utilizado, aunque con fines especficos, son las bolitas de polietileno, sephadex, o poliacrilamida, para la propagacin de clulas anclaje-dependientes en suspensin, amplificando as enormemente la superficie real de cultivo de un recipiente, como por ejemplo en el caso de los bio-reactores. Las superficies son muy a menudo pre tratadas con por ejemplo medio de cultivo ya utilizado para el cultivo de otras clulas, o sembrando clulas que luego se remueven dejando sus secreciones adheridas, proveyendo de esta forma alguna de los constituyentes normales de la matriz extracelular del animal entero. Tambin se agregan directamente a las placas, previo al contacto con las clulas, diversas macromolculas de este tipo tales como laminina, fibronectina, colgeno, etc. En muchos casos in vitro, el contacto de la clula con estas macromolculas es fundamental para un correcto crecimiento y expresin de sus caractersticas especializadas. Tambin se utiliza una mono-capa de clulas como acondicionadora del ambiente y como sustrato vivo para el cultivo de otro tipo celular. Este mtodo no solo mejora o en algunos casos posibilita el crecimiento y diferenciacin de ciertos tipos celulares en cultivo, sino que tambin contribuye a emular las condiciones originales de ciertos tejidos. Se han diseado otros muchos sistemas de cultivo para requerimientos especiales de determinado tipo celular, o condicin experimental, tal es el caso de un tipo de recipiente que posee micro-capilares permeables, sobre los cuales se cultivan las clulas, y por dentro de los cuales se hace circular medio de cultivo. (ii) Fase gaseosa. Los constituyentes ms importantes de esta fase para el cultivo de clulas son el O2 y el CO2. Los cultivos varan en sus requerimientos de oxgeno, tal es el caso de los cultivos celulares y los cultivos rgano-tpicos. Mientras que tensiones de O2 atmosfricas o menores son preferibles para la mayora de los cultivos de clulas, algunos cultivos rgano-tpicos requieren hasta un 95% de O2 debido a su escasa difusin. El CO2 tiene un papel complejo, y es difcil entender cmo ejerce su efecto debido a sus implicancias sobre la concentracin de O2 disuelto, el pH y la concentracin de HCO3- del medio de cultivo. La tensin atmosfrica de CO2 y la temperatura del ambiente del cultivo regulan directamente la concentracin de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Se regular as de forma indirecta el pH del medio de cultivo, ya que al cultivo se le adiciona tambin cierta cantidad de HCO3-, con lo cual se establecer un equilibrio que sirve como tampn: H20 + CO2 ( H2CO3 ( H+ + HCO3- + Na+ ( NaCO3 + H+ Se ajustan las concentraciones de HCO3- y CO2 para fijar el equilibrio a pH 7,4. (iii) Medios de cultivo y suplementos. Con el fin de emular las condiciones in vivo se desarrollaron medios de cultivo basales tales como el de Eagle, y medios ms complejos como el 199. Sin embargo estos medios requieren de la suplementacin con suero segn los tipos celulares. Para condiciones en las cuales es deseable eliminar el suero, se desarrollaron medios de cultivo definidos (de composicin conocida) que permiten el correcto crecimiento de un determinado tipo celular in vitro. Cada tipo celular tendr sus propios requerimientos lo cual hace necesario un cuidadoso anlisis de las caractersticas del medio de cultivo que se elige para cada tipo celular. La base de todo medio de cultivo es una solucin salina balanceada, a la cual se le van adicionando diferentes componentes para generar un tampn, aminocidos esenciales, vitaminas, trazas de minerales, y otros metabolitos como piruvato, nuclesidos, lpidos, etc. Como ya hemos comentado, en la mayora de los casos se adiciona adems distintas proporciones de suero, cuyo componente mayoritario son las protenas tales como transportadores de minerales, hormonas o lpidos (albmina, globulinas, transferrina, etc). Otros de sus componentes importantes son metabolitos diversos, nutrientes especficos, factores de crecimiento polipeptdicos (PDGF, FGF, NGF, etc.), y hormonas (insulina, hidrocortisona, etc.).

(iv) Propiedades fsicas. La mayora de las lneas celulares crecen a pH 7,4. Con el fin de fijar el pH del medio de cultivo en este valor, se utiliza un tampn bicarbonato como ya se ha descrito. Este tampn si bien no tiene una alta capacidad, es muy aconsejable debido a su baja toxicidad y a que es el principal sistema de tampn in vivo. Otro factor importante es la osmolaridad, que si bien en el plasma humano es aproximadamente 290 mOsm/kg, en la prctica, en cultivo pueden utilizarse osmolaridades de entre 260 y 320 mOsm/kg para la mayora de las lneas celulares. La temperatura de incubacin de los cultivos se ajusta a la temperatura promedio del animal del cual proviene el cultivo, para mamferos debe ser de 37C, mientras que para otros cultivos de origen diferente como en el caso de insectos o anfibios ser distinta. Finalmente, la viscosidad es otra propiedad importante del medio de cultivo, que se encuentra principalmente determinada por los constituyentes del suero.