Universidade de Braslia Instituto de Cincia Biolgicas Departamento de Biologia Celular Bioqumica e Biofsica Experimental

Prtica 05
Espectrofotometria e Fotocolorimetria

Braslia, 9 de Julho de 2010

ndice
Introduo.............................................................................................................................3 Mtodos (Materiais e Procedimentos)...............................................................................4-5 Resultados.........................................................................................................................6-7 Discusso.............................................................................................................................8 Referncias Bibliogrcas....................................................................................................9

Introduo
A espectrofotometria um dos mtodos de anlises pticas mais utilizados em investigaes biolgicas e fsico-qumicas. Essa tcnica utiliza o fenmeno fsico da absoro, pois, dependendo da estrutura qumica da molcula sob investigao, diferentes comprimentos de onda so absorvidos/reetidos. Chama-se a essa propriedade absoro seletiva, caracterstica de cada substncia. Se essa reexo acontecer no espectro do visvel, como no caso do -caroteno, por exemplo, possvel diferenciar esse soluto de outros pelo fato de se se conhecer esses comprimentos de onda. Quando um feixe de luz monocromtico (comprimento de onda especco) incidido em determinada soluo, acontece a absoro desse feixe pela soluo e, assim, so oferecidas informaes sobre a QUALIDADE e a QUANTIDADE dos componentes da amostra. O aparelho utilizado nessas experincias, capaz de comparar essas propriedades da soluo chamado espectrofotmetro. Esse possui recursos eletrnicos que interpretam os resultados obtidos e nos d uma gama de informaes importantes para a experincia realizada. Para entender seu funcionamento, preciso entender alguns conceitos. Transmitncia (T) a razo entre as intensidades dos feixes transmitido e incidente. importante lembrar que, segundo Bouguer e Lambert, a intensidade da luz transmitida decresce exponencialmente com o aumento da espessura da cubeta (local onde a soluo esto armazenada). August Beer estudou a inuncia da concentrao da soluo, mantendo-se a espessura constante. Ambos chegaram praticamente mesma concluso: mudando a espessura da cubeta ou a concentrao da soluo, o que aumenta ou diminui o nmero de partculas que interagem com a radiao. A frmula abaixo contempla o trabalho desses cientistas:

A absorbncia, conceito muito empregado nesse relatrio, a medida da frao da radiao que absorvida pela amostra e indiretamente proporcional ao log da Transmitncia (T): a = absortividade (caracterstico da amostra) b = espessura da cubeta (cm) c = concentrao a substncia (mg/mL) Nessa prtica, o grupo teve um primeiro contato prtico com os conceitos de transmitncia e absorbncia, alm da manipulao inicial de um espectrofotmetro ao analisar a mesma substncia em diferentes pHs.

Mtodos
Nessa primeira experincia, tivemos nossa primeira experincia terica e prtica de espectrofotometria. Analisamos solues de vermelho de fenol em diferentes valores de pH com o intuito inicial de aprendermos a manusear o espectrofotmetro, mas tambm para construirmos as curvas de absorbncia em funo dos comprimentos de onda.

MATERIAIS
Soluo de Vermelho de Fenol pH 4,7 Soluo de Vermelho de Fenol pH 9,0 Espectrofotmetro Spectonic Cubetas de vidro gua Destilada (blank)

PROCEDIMENTOS
Executamos as leituras das solues de vermelho de fenol em diferentes pHs para analisar seus espectros de absorbncia utilizando comprimentos de onda entre 400 e 580nm e anotamos os valores obtidos na seguinte tabela: Comprimento de Onda (nm) 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 pH 4,7 0,59 0,73 0,71 0,54 0,35 0,16 0,05 0,01 0,01 0,00 pH 9,0 0,06 0,09 0,12 0,18 0,26 0,45 0,66 0,96 1,14 0,50

Para utilizarmos o espectrofotmetro, ns ajustvamos o comprimento de onda desejado para fazer a leitura e sempre inseramos o blank e zervamos o equipamento, como forma de calibragem. Esse procedimento era repetido toda vez que se alteravam os comprimentos de onda.
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 Os espectros de absoro do vermelho de fenol (pH 4,7 e 9,0) esto representados no grco abaixo. Os pico mximos de absoro para esto destacados na tabela acima, mas, para pH 4,7 est no comprimento de onda de 420nm (A=0,73) e para pH 9,0 est no comprimento de onda 560 (A=1,14) pH 4,7 Absorbncia 1,5 1,125 0,75 0,375 0 400 450 500 550 600 Comprimento de Onda (nm) pH 9,0

Resultados
1) Apresentar os espectros de absoro do vermelho do fenol (pH 4,9 e 9) numa mesma folha milimetrada, denir os picos mximos de absoro. Colocar a Absorbncia na ordenada e comprimentos de onda na abcissa. Vide MTODOS. 2) Fazer anlise crtica dos grcos e apontar as possveis falhas tcnicas cometidas. Apesar do grco mostrar a mesma substncia nas duas curvas, elas esto em diferentes pH. E isso suciente para que haja modicao na estrutura molecular da substncia, que acarreta em uma absoro diferenciada da luz. por isso que o vermelho de fenol apresenta dois picos diferentes de absoro de acordo com o pH. O pico de absoro no pH = 4,7 de aproximadamente 420 nm, j no pH = 9,0 , o pico aproximadamente 560nm. O espectrofotmetro um equipamento que muito sensvel e por isso muito suscetvel a pequenas falhas tcnicas que podem levar a leves alteraes nos resultados. Uma simples sujeira na cubeta proveniente do manuseio com mos sem luvas ou da lavagem incorreta ou pequenos movimentos na bancada onde se encontra o aparelho so sucientes para alterar os resultados. por isso que esse grco uma curva de valores aproximados. 3) Determinar a concentrao do vermelho de fenol em pH 9,0 usando o valor de 560nm = 49.670 (dado da literatura) e o valor de A obtido em seu experimento. Para se determinar a concentrao de uma soluo utiliza-se a Lei de Beer, que pode ser enunciada como: A=bc onde A a absorbncia obtida por meio do experimento; b a espessura da cubeta e c a concentrao da substncia; o valor de foi dado no enunciado. Colocando os valores encontrados no experimento e o dado da questo e considerando a espessura da cubeta utilizada com sendo 1cm, teremos: 1,14 = 49670 . 1 . c c = 2,2951 . 10-5 4) Determinar valor de A1% 650nm da soluo de vermelho de fenol (MM=354,37) em pH 9,0. 10 = A1%560nm.MM 10 . 49670 = A1%560nm . 354,37 A1%560nm = 1401,642

5) Qual a utilidade do espectro de absoro de uma substncia? Todas as molculas possuem diferentes nveis de absoro e transmisso da luz. uma caracterstica intrnseca de cada substncia, como se fosse sua impresso digital. Por isso, atravs do espectro de absoro de uma substncia que possvel identicla. 6) Qual a utilidade do blank no procedimento realizado ? O blank o controle do experimento. Nele so adicionados todos os componentes do experimento, menos a substncia que vai ser analisada. Com ele, feita a zeragem do espectrofotmetro. Desse modo, o equipamento ir desconsiderar a absorbncia que se refere ao solvente da soluo, cubeta e s impurezas contidas nela. Assim, ser analisada apenas a substancia em questo.

Discusso
Na prtica realizada, o objetivo era a determinao do espectro de absoro do vermelho de fenol em diferentes pHs. Para tal, utilizamos duas amostra de vermelho de fenol em diferentes pHs (pH 4,7 e pH 9,0) e as inserimos no espectrofotmetro em diferentes comprimentos de onda, de modo que poderamos traar o espectro de absorbncia da substncia. Como o vermelho de fenol um indicador cido-bsico que se apresenta colorido tanto em sua forma protonada (ambiente cido) como em sua forma desprotonada (ambiente bsico) os comprimentos de onda utilizados encontravam-se dentro do espectro do visvel. Ao analisarmos os resultados obtidos na tabela e no grco montado, pudemos observar que em pH 4,7 o melhor comprimento de onda com o qual se pode trabalhar o vermelho de fenol na faixa de 420nm, enquanto que para pH 9,0 o melhor comprimento de onda seria na faixa de 560nm. E no poderamos deixar de nos perguntar o motivo de uma mesma substncia apresentar duas curvas to distintas de absorbncia. A resposta vem do mesmo fato que propicia ao vermelho de fenol ser um timo indicador cidobsico, pois isso signica que em diferentes pHs (cido ou bsico, como no caso 4,7 ou 9,0) a conformao estrutural das molculas da amostra diferente e, portanto, absorve e emite diferentes valores. Assim, mesmo que de modo geral uma substncia apresente um valor prprio de absorbncia, esse valor pode ser inuenciado pelo pH no qual a amostra se encontra, pois o pH pode modicar a geometria molecular da substncia.

Referncias Bibliogrcas
Anotaes de Aulas - Prof(a) Ildinete Silva Pereira - IB/CEL - UnB MARZZOCO, A.; TORRES, B. B.; Bioqumica Bsica. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1999. STRYER, L.; Bioqumica. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 4 Edio. LEHNINGER, A.; NELSON, D.; COX, M. M.; Princpios de Bioqumica, PDF/CD em ingls, 2005 SOUZA, E.; SIQUEIRA, E.; FREITAS, S.; Bioqumica e Biofsica Experimental. Ed. UnB. Braslia, Maro 2002.