APLICACIN DE VECTORES RETROVIRALES EN LA ANEMIA DE FANCONI

Anemia de Fanconi: Es una enfermedad hereditaria rara: 1/350000 casos Enfermedad gentica autosmica recesiva producida en diversos grados por mutaciones en 8 - 13 genes: FANCA, FANCC, FANCD1/BRCA2, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG y FANCL DUDA: La mutacin de estos genes implica que no se expresen, o se expresan pero con protenas no funcionales? Estos genes codifican para protenas implicadas en la reparacin del DNA. Mutaciones en estos genes implican: Gran riesgo a desarrollar cncer La medula sea y sus clulas madre hematopoyticas se ven muy afectadas, ya que es un tejido de gran proliferacin celular. Disminuye as, la produccin de clulas sanguneas competentes. Por tanto: G.Rojos Anemia G.Blancos Dificultad para combatir infecciones (Sobretodo disminuyen neutrfilos que actan frente a microorganismos. Plaquetas coagulacin Hemorragias (Petequias, puntitos rojos en la piel) Malformaciones congnitas Manchas cutneas Baja estatura Esperanza de vida: Unos 24 aos
Gen FANCA FANCB FANCC FANCD1 / BRCA2 FANCD2 FANCE FANCF FANCG / XRCC9 FANCI FANCJ / BACH1 FANCL / PHF9 / POG FANCM/Hef FANCN FANCO FANCP Localizacin 16q24.3 Xp22.2 9q22.3 13q12.3 3p26 6p22-p21 11p1 9p13 15q25-q26 17q22-q24 2p16.1 14q21.3 16p12.1 17q25.1 16p13.3

Puesto que los sntomas no son iguales en todos los casos, la enfermedad se detecta mediante ensayo citogentico de aberraciones cromosmicas en linfocitos de sangre perifrica tratndolo con MMC (Mitomicina C) o DEB (Diepoxibutano), a cuyos efectos son muy sensibles. El gen FANCA es el que ms frecuentemente se encuentra mutado y presenta un espectro de mutaciones muy amplio. La mayora son grandes delecciones FANCB Solo en hombres. En mujeres la copia mutada es la que se inactiva. Ruta complejo FANC

Se puede subdividir en dos rutas independientes en respuesta a estmulos distintos: los agentes inductores de enlaces cruzados y las radiaciones ionizantes La mayora de protenas FA (FANCA, -B, -C, -E, -F, -G, -I, -L) forman un complejo nuclear necesario para la posterior activacin de FANCD2 mediante la ubiquitinacin de la lisina 561 en respuesta a los agentes inductores de ICLs. Se cree que esta monoubiquitinacin es llevada a cabo por otras protenas FANC (.) Uso de vectores retrovirales para la terapia de AF

Nos centraremos en el penltimo paso: Correccin gentica de la mdula sea *Como el diseo de vectores retrovirales lo explica Bea, me centrar en explicar como se lleva acabo y mediante que tcnicas.* 1. Produccin de los plsmidos helper y el plsmido con el transgn. (es decir, el gen FANC corregido) Vamos a usar los genes del VIH, (excepto aquellos que codifican para los factores de virulencia de la enfermedad del SIDA) y los introduciremos en plsmidos). DUDAS Partimos de los plsmidos con los genes ya insertados de encargo o por el contrario, se obtienen plsmidos determinados Sin nada a los que, mediante enz de restriccin les insertamos los genes que nosotros queremos? O tambin se me ocurre que para preparar los plasmidos helper, tenemos plasmidos con la informacin del virus y con enzimas vamos cortando y eliminando hasta quedarnos con el gen que queremos? Cmo se prepara? Cmo se insertan las secuencias de los genes? Con enzimas de restriccion? Se hacen en tubos de ensayo o en algn medio especial? Cada gen se inserta con una enzima de restriccin difente? Una vez que tenemos preparado nuestro plsmido, necesitaremos amplificarlo, Mediante PCR? Imagino que el el plsmido que posee el gen de las protenas de unin a los receptores celulares de membrana, ser uno especifico para las clulas madre hematopoyticas de la medula sea extraida no? Cual es? Se tarda mucho tiempo en obtener los plsmidos necesarios?

Cmo se puede comprobar que los plsmidos que tienes son los correctos y no tienen errores? Secuenciandolos? Nota: En vez de usar promotores sde otros virus, en el tratamiento de esta enfermedad se usa el promotor de la PGK (fosfoglicerato quinasa humana) 2. Introduccin de los plsmidos a una lnea celular para obtener viriones (vectores virales) con la informacin deseada. Qu lnea celular se usa para ello, porque motivo? Mediante que mecanismo entran los plasmidos a la clula? Porque no se usan bacterias para este proceso y se induce transformacin artifial mediante elctroporacion por ejemplo? De esta forma tambin se produciran viriones. En este paso, los helper plasmid se expresan para dar protenas, pero, y el transgen tambin? Quiero decir, nse transcribir, puesto que se encapsida en forma de RNA pero tambin se traduce? Cunto tiempo dura este proceso? Al producirse particulasvricas, se produce la lisis de las clulas del cultivo?esperais a que se agote el medio y luego ya sacais los viriones? Los viriones los separais del resto del cultivo por filtracin? Aqu es el momento en el que se observaba fluorescencia en el cultivo no? Las clulas iluminadas eran las que estaba produciendo partculas vricas supongo no? Realizais tcnicas de recuento de partculas vricas? Si es asi, que tcnica usais? (En clase hemos dados algunas de estas tcnicas y estara bien comentarlo)Para saber cunto extraeis no? 3. Infeccin de clulas madre hematopoyticas con los viriones (vectores virales) obtenidos Animales: Ratones -luego Humanos Haceis primero pruebas en cultivos o lneas celulares de clulas madre hematopoyticas de raton y si tiene xito, es decir el transgen se integra correctamente y tal, este cultivo se inyectar al raton no? En algn hueso grande puede ser? Como comprobais/que signos observais en el cultivo celular de cel madre hematopoyticas para saber que estas clulas tienen el gen Fanc correctamente insertado y se expresa de la forma adecuada? En cuanto a la insercin del transgen.. Se inserta en el mismo sitio del gen mutado? Se insertara, por lo menos en el mismo cromosoma no? O es un proceso azaroso? Esta integracion del transgen no implica que el gen mutado se siga expresando no? El riesgo, en la integracin, a producir cncer, se produce si se inserta cerca de un oncogn, y al expresarse el transgen, se sigue expresando el oncogen no? Que inconvenientes tiene el trabajo en animales como las ratas . ES decir, hay datos necesarios para la investigacin y el tratamiento que no se pueden obtener en ratas? Cunto tiempo supone esta fase de la investigacin? Tras la inyeccin del cultivo (de cel madre hematopoyicas con el gen FANC expresndose correctamente) Se produce una renovacin de todas las clulas sanguneas a medida que pasa el tiempo? Es decir, Hay por un lado una eliminacin natural de cel sanguneas (como cualquier otra celula en su ciclo celular) y por otro lado las cel sanguneas que se producen(ya corregidas en los genes FANC mutados) van purgando el torrente sanguneo, o curando al individuo? Habria que hacer varias transfecciones de medula corregida? Ya se que se me ha ido la mano con las dudas. Sorry