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Sensores eletroqumicos: consideraes sobre mecanismos de funcionamento e aplicaes no monitoramento de espcies qumicas em ambientes microscpicos

Electrochemical sensors: fundamentals and applications in microenvironments

Denise Lowinsohn; Mauro Bertotti*

Instituto de Qumica - Universidade de So Paulo, CP 26077, 05513-970 So Paulo - SP, Brasil

ABSTRACT

Electrochemical sensors have attracted considerable attention in recent years because they provide data about the chemical state of our surroundings and the dynamics of the chemical transformations in the form a spatially resolved image. Particular interest has been directed to measurements in restricted-volume samples as new technologies enable the fabrication of miniaturized versions of sensors with reproducible characteristics. Taking these aspects into consideration, this review focuses on the use of electrodes of micrometer dimensions to acquire chemical information in microdomains in which concentrations may not be spatially homogeneous. This is possible because microelectrodes allow fast-response measurements with

micrometer resolution to be performed. On the other hand, the use of microelectrodes as amperometric sensors presents an inherent drawback owing to the insufficient specificity toward the substrate of interest. Hence, some comments on strategies to enhance the selectivity of amperometric sensors are also made. Finally, recent applications of structurally microscopic electrodes as in vivo sensors are shown, as well as a prospect of the future trend in this field.

Keywords: electrochemical sensors; microelectrodes; in vivo measurements.

INTRODUO

O atual panorama da Eletroanaltica

As tcnicas eletroqumicas constituem-se em poderosa ferramenta para os qumicos analticos na resoluo de seus problemas, especialmente por causa de algumas caractersticas vantajosas como a elevada sensibilidade das determinaes, custo moderado e portabilidade1-3. A versatilidade das tcnicas eletroqumicas tambm merece destaque visto que possvel controlar as reaes eletrdicas modificando a interface eletrodo-soluo e selecionando-se criteriosamente o potencial aplicado clula. A facilidade de automao em virtude da medio de sinais eltricos, a possibilidade de proceder especiao de ons metlicos em certos casos e a "compatibilidade ambiental", pois o reagente empregado o eltron, tambm consistem em aspectos que conferem aos mtodos eletroanalticos uma posio de destaque no contexto da Qumica Analtica.

Inerentes s propriedades acima destacadas, aparecem aspectos desvantajosos das medies eletroqumicas, principalmente quando comparadas s efetuadas com tcnicas espectroscpicas. Um dos problemas refere-se interao do eletrodo com a amostra, que em muitos casos ocasiona perda ou irreprodutibilidade nas medidas. O conjunto de compostos passveis de determinao eletroanaltica tambm menos abrangente que no caso das tcnicas espectroscpicas. Finalmente, deve-se destacar a natural averso s tcnicas eletroqumicas em

razo do sofisticado e nem sempre muito bem compreendido processo heterogneo de transferncia de eltrons que ocorre na interface eletrodo-soluo.

No atual panorama da Eletroanaltica, pesquisas nas quais se utilizam detectores amperomtricos acoplados a sistemas de separao tm recebido ateno crescente, especialmente nos casos em que se deseja a miniaturizao do sistema analtico4-16. Uma justificativa para esta motivao inclui a disponibilidade de tecnologias que facilmente viabilizam a fabricao de eletrodos em escala micromtrica, a preos relativamente baixos. Alm disso, a sensibilidade das determinaes no comprometida pela reduo do tamanho do sensor ou da clula, como o caso dos mtodos espectroscpicos, uma vez que a reao de interesse ocorre na regio interfacial eletrodo/soluo e, portanto, no depende do volume da amostra. Alta sensibilidade analtica pode tambm ser obtida empregando-se espectroscopia de massa ou fluorescncia por laser induzido17. Entretanto, os instrumentos requeridos para o emprego destas tcnicas so muito mais caros e de maior porte que um potenciostato, o qual pode ser facilmente construdo em um "chip" de poucos centmetros. Desta forma, a fabricao de sistemas analticos compactos que empregam deteco amperomtrica tem sido proposta na literatura e o aspecto diferencial prende-se possibilidade de realizar todas as operaes analticas de maneira integrada e contnua em um nico instrumento8,15,16. H vrios exemplos na literatura em que a associao da eletroforese capilar com deteco amperomtrica proposta no desenvolvimento de equipamentos internacionalmente conhecidos como TAS ("micro total analysis system") ou "lab-on-a-chip"18-20. Ainda no que tange ao uso de detectores amperomtricos em sistemas hidrodinmicos, cumpre destacar que a possibilidade de reduo da exposio do eletrodo a contaminaes provenientes de amostras reais constitui-se em fator relevante e que justifica os seguidos progressos oriundos da introduo de amostras por sistemas FIA ou BIA ("batch injection analysis")21,22.

Sensores eletroqumicos: um panorama resumido

Sensores qumicos so dispositivos que permitem a coleta de dados e obteno de informaes com manipulao mnima do sistema estudado. Desta forma, os resultados obtidos podem ser analisados e correlacionados com outros parmetros no ambiente em que esto inseridos. Estes dispositivos possuem caractersticas peculiares que os distinguem de mtodos instrumentais de largo porte, os quais, por usa vez, so cada vez mais precisos, sensveis e seletivos, mas no permitem a obteno de informaes in situ e em tempo real. Dados nestas condies experimentais so facilmente obtidos com sensores e, mesmo que as medidas no tenham preciso e exatido comparveis s dos mtodos instrumentais, em muitas ocasies tm-se elementos suficientes para tomadas de deciso. Caractersticas vantajosas tambm inerentes ao uso de sensores qumicos referem-se portabilidade, facilidade de automao, possibilidade de

miniaturizao e baixo custo.

A Figura 1 apresenta um esquema geral dos principais componentes de um sensor qumico. A obteno de informao analtica depende essencialmente da capacidade da membrana, usualmente posicionada na extremidade do dispositivo, em reconhecer a espcie de interesse de maneira seletiva. H inmeras alternativas de imobilizao desta membrana na superfcie do sensor e um aspecto relevante associado a esta operao envolve a necessidade de acesso a algum processo qumico que viabilize a transduo do sinal para o detector. Por sua vez, o sinal transmitido deve ser maximizado em relao s informaes sobre o analito, ou seja, deseja-se minimizar o efeito de contribuies estranhas como, por ex., interferentes, rudos eletrnicos ou erros experimentais. Neste sentido, a efetiva capacidade do dispositivo em discriminar o analito constitui-se em aspecto de grande importncia na fabricao de sensores de uso geral e em larga escala, devendo-se ressaltar, entretanto, que aspectos referentes sensibilidade, estabilidade e robustez tambm devem ser considerados.

Dentre os sensores qumicos, h vrias classificaes possveis as quais podem se basear no tamanho, tipo de aplicao ou mecanismo de transduo da resposta. De acordo com o banco de dados do ISI Web of KnowledgeSM, 46702 artigos cientficos foram publicados contendo a palavra-chave "sensor" ou "sensors", desde 2000. Estes trabalhos referem-se a investigaes com sensores de diversos tipos e incluem transduo potenciomtrica, amperomtrica, piezoeltrica, ptica, trmica, condutomtrica, entre outras. Percebe-se, portanto, a vastido de uma rea vigorosamente crescente e no inteno deste artigo fazer uma reviso de amplitude to larga. Mesmo no que concerne s tcnicas eletroqumicas, verifica-se a existncia de milhares de trabalhos sobre o assunto em que so abordados tpicos sobre novos materiais, aplicaes em amostras ambientais, biolgicas e de interesse industrial, novos mtodos de fabricao, estratgias para melhoria na seletividade e nos limites de deteco, etc. O vigor nesta rea atestado pela publicao de 2678 artigos em igual perodo de tempo, selecionados com base nas palavras-chave "electrochemical and sensor" e "electrochemical and sensors", alguns dos quais

consistindo em excelentes e abrangentes revises relativamente recentes sobre o tema23-34. Aplicaes destes dispositivos para obteno de informaes no campo e em amostras de interesse ambiental23,24,30,33 exemplificam a importncia desta rea de pesquisa no contexto social, econmico e da sade.

A fabricao de sensores descartveis35-37 e o desenvolvimento de tecnologias que permitem a imobilizao de enzimas em sistemas eletrdicos para confeco de biossensores com elevada estabilidade tambm tm atrado o contnuo interesse de pesquisadores ligados Eletroanaltica38-42. Sofisticados mtodos para "screen-printing" surgem rotineiramente na literatura43-46 e a possibilidade de fabricao de microeletrodos isolados ou na forma de "arrays", os quais viabilizam ganho de sensibilidade e abrem perspectivas para monitoramento multielementar47,48, impulsionam pesquisas com vistas a aplicaes rotineiras dos dispositivos.

O foco do presente artigo

Como pde ser evidenciado nos tpicos anteriores, existe uma ampla gama de motivaes e inovaes tecnolgicas que ampliaram de maneira exponencial as fronteiras de atuao da Eletroanaltica e, em particular, o campo associado ao desenvolvimento de sensores eletroqumicos. Como j frisado, h revises extensas e recentes sobre o tema, incluindo compilaes na rea de eletrodos modificados e biossensores. De outro lado, a aplicao de sensores amperomtricos no estudo de sistemas biolgicos constitui-se em rea menos explorada, mas que tem recebido incentivo devido s atraentes perspectivas. Em um contexto crescentemente interdisciplinar, em que a busca de informaes em sistemas biolgicos tem sido cada vez mais importante para compreenso do mecanismo de funcionamento das clulas, destaca-se a rea de fabricao de sensores miniaturizados. Os resultados de experimentos eletroqumicos conduzidos com eletrodos que possuem pelo menos uma das dimenses em escala micromtrica so bastante distintos em funo do diferenciado mecanismo de transporte de massa (vide seo adiante), viabilizando medies de corrente em estado estacionrio (ou seja, o sinal medido independe do tempo)49-52. Outra particularidade destes eletrodos prende-se possibilidade de construo de dispositivos estruturalmente microscpicos e desta forma, se descortina um vasto campo de atuao da eletroqumica em que se estudam molculas confinadas em volumes muito pequenos de soluo. A presente reviso almeja contextualizar este assunto apresentando alguns dos princpios fundamentais que norteiam os progressos neste campo de pesquisa, assim como exemplos ilustrativos de aplicaes prticas destes sensores miniaturizados.

No ambiente celular, os dispositivos usualmente operam no modo amperomtrico e, portanto,

apresentam reduzida seletividade. Justificam-se, desta maneira, estratgias para a modificao da superfcie eletrdica, quer seja para fins de eletrocatlise, como para restrio da passagem de espcies interferentes. Comparativamente aos inmeros trabalhos descritivos sobre mtodos de modificao de superfcies eletrdicas, menos nfase tem sido dada na literatura ao uso de ferramentas para a compreenso dos diversos fatores que influenciam a resposta nos eletrodos modificados. Assim, pretende-se abordar o assunto relativo a eletrodos modificados levando em considerao aspectos vinculados a propriedades da estrutura, composio e dinmica das reaes eletrdicas e, sempre que possvel, exemplos de nossas contribuies nesta rea sero apresentados.

ASPECTOS FUNDAMENTAIS SOBRE SENSORES ELETROQUMICOS

Importncia da modificao da superfcie do eletrodo

Os sensores amperomtricos constituem-se em dispositivos mantidos em potencial fixo e que propiciam sinais de corrente faradaica proporcionais concentrao do analito, em funo de processos eletrdicos que ocorrem na interface eletrodo/soluo. Todavia, a corrente medida em experimentos eletroqumicos tambm possui um componente capacitivo, associado a mudanas da capacitncia da dupla camada eltrica durante variaes de potencial. A Figura 2 representa, de maneira esquemtica, a influncia da concentrao da espcie eletroativa para ambas as situaes e observa-se claramente que a busca de informaes sobre a concentrao da espcie eletroativa depende de uma ntida distino entre as correntes capacitiva e faradaica. Pela anlise da figura conclui-se que informaes analticas em concentraes mais baixas podem ser obtidas com mais confiabilidade melhorando-se a sensibilidade das determinaes (aumento da inclinao da reta, curva IF(B)) e/ou pela diminuio da corrente capacitiva, condies nas quais a discriminao entre correntes faradaica e capacitiva otimizada. Visto que no caso de sensores amperomtricos o potencial mantido constante durante a medio da corrente, deve-se destacar tambm a importncia da avaliao da seletividade das determinaes uma vez que, via de regra, em amostras complexas podem existir espcies qumicas que tambm so eletroativas no potencial selecionado.

Uma estratgia elegante para superar os problemas de seletividade acima considerados envolve a modificao da superfcie eletrdica. Algumas dcadas atrs trs atributos principais eram requeridos em um eletrodo de trabalho utilizado em experimentos eletroqumicos: boa condutividade, estabilidade qumica perante processos redox em soluo e larga faixa de potencial de trabalho. Desde ento, essas premissas passaram a ter um significado menos importante uma vez que, para determinados sistemas qumicos, percebeu-se a necessidade do trabalho com superfcies seletivamente reativas, as quais proporcionavam resultados favorveis em razo da melhoria da atividade qumica53.

O uso de reagentes moleculares para manipular deliberadamente a superfcie de eletrodos tem vasta aplicao em Eletroanaltica, pois conduz a melhoria na capacidade de reconhecimento e/ou na amplificao de sinais de corrente, ao mesmo tempo em que pode tornar as determinaes mais seletivas pelo efeito eletrocataltico (diminuio da sobretenso dos processos eletrdicos) ou pela restrio da passagem de espcies interferentes empregando-se membranas apropriadas.

Os procedimentos acima descritos tm estreita associao com o termo "eletrodos quimicamente modificados"54 e visto que o objetivo do uso de sensores amperomtricos est centrado na medio de sinais de corrente em matrizes de natureza complexa (fluidos biolgicos, guas naturais, alimentos, etc), a modificao da superfcie eletrdica , na maioria dos casos, necessria para que se atinjam os propsitos desejados. Entretanto, cabe destacar que em algumas situaes favorveis as medies podem ser feitas com eletrodos sem qualquer tipo de modificao, como no caso do monitoramento da concentrao de cido ascrbico em frutas ctricas empregando-se microeletrodos de ouro55 e platina56. Isto vivel pois estudos realizados com suco de laranja por nosso grupo de trabalho empregando a enzima ascorbato oxidase demonstraram a ausncia de outras espcies eletroativas no potencial de trabalho. Outro exemplo tambm interessante a determinao direta de vitamina E em leos e gorduras vegetais utilizando microeletrodos de platina57.

A importncia da funcionalizao da superfcie eletrdica propiciou a criao de uma rea com fronteiras bastante abrangentes e nas ltimas dcadas os trabalhos tm se estendido desde

estudos fundamentais at aplicaes prticas. A engenhosidade dos qumicos tem levado proposio de inmeras estratgias para a imobilizao deliberada de espcies qumicas na superfcie de eletrodos slidos e h revises bastante completas sobre este assunto54, 58-62, razo pela qual no se pretende abordar este tema no presente artigo.

Tcnicas para caracterizao da atuao do filme modificador

O trabalho com monocamadas desejvel, pois pode-se ter um controle mais preciso do grau de funcionalizao da superfcie63. Todavia, na maior parte dos casos trabalha-se com multicamadas, que viabilizam um efeito cataltico em escala tridimensional devido difuso do substrato pelo filme64. Investigaes com filmes mais espessos do ensejo a uma influncia significativa da estrutura da camada imobilizada na dinmica do processo global de eletrodo e inter-relaes entre estes dois parmetros so bastante relevantes ao se lidar com eletrodos modificados.

Na avaliao da eficincia cataltica de um eletrodo modificado, fatores relacionados difuso do substrato na soluo, propagao da carga eltrica no filme, penetrao do substrato no filme e posterior difuso e velocidade da etapa de transferncia eletrnica entre mediador e substrato devem ser considerados65-69. A Figura 3 ilustra as diferentes etapas deste processo dinmico, investigado por Saveant e colaboradores66. Estes autores estudaram de maneira qualitativa e quantitativa os perfis de concentrao esperados para situaes em que os parmetros acima descritos so considerados. O objetivo destes estudos consiste na avaliao da relevncia da contribuio de cada um dos parmetros na cintica do processo global de eletrodo. As diferentes combinaes produzem subcasos definidos pela localizao da zona de reao no filme, os quais podem ser caracterizados aumentando-se o regime de transporte de material superfcie eletrdica. Para tanto, o uso de eletrodos rotativos muito conveniente, pois pode-se variar de maneira controlada o coeficiente de transporte de massa variando-se a velocidade de rotao do eletrodo.

Em termos analticos, onde se deseja maximizar o sinal de corrente e manter uma relao linear com a concentrao do substrato, o sistema ideal seria aquele para o qual a reao mediada ocorresse de maneira uniforme no interior do filme68. Esta condio obtida para sistemas qumicos em que a reao entre mediador e substrato possui cintica moderada e para os quais no h limitao pelo transporte de carga ou transporte de massa. Deve-se ressaltar, entretanto, que nestes casos o dispositivo pode apresentar restries para lidar com elevadas taxas de material eletroativo proveniente da soluo. Um exemplo tpico de sistema com esta caracterstica consiste no processo de oxidao andica de nitrito em filmes de porfirinas de rutnio, cuja investigao com eletrodo rotativo permitiu a determinao da constante cintica da reao entre nitrito e stios de Ru(III) eletrogerados em potenciais suficientemente positivos70.

A modificao da superfcie eletrdica com compostos que facilitam os processos de transferncia eletrnica proporciona um desafio importante no que diz respeito a investigaes sobre composio, estrutura molecular e morfologia. Isto se deve ao fato de que os filmes so depositados em superficies planas e a quantidade de material associada a uma monocamada tem um valor tpico de 10-10 mol/cm2, portanto, as tcnicas empregadas devem possuir alta sensibilidade. H artigos de reviso e textos mais aprofundados em que se discutem fundamentos e aplicaes de ferramentas espectroscpicas na anlise de superficies3,71-74. Nosso grupo tem empregado algumas das tcnicas acima relacionadas na investigao da estrutura de filmes de xidos de molibdnio, nos quais se depositaram micropartculas de metais nobres, como platina, paldio e rdio75,76. A formao de xidos e hidrxidos de cobre tambm foi averiguada empregando-se EDS ("energy dispersive spectroscopy") e os resultados indicaram a forte relao entre a composio dos filmes e a atividade eletroacataltica do processo de oxidao do etanol com o potencial aplicado ao eletrodo de trabalho77.

Interpretaes mais consolidadas sobre o significado qumico do evento observado, principalmente quando este envolve variao de massa na interface durante o experimento, podem ser tambm obtidas empregando-se a balana eletroqumica de cristal de quartzo78,79. Esta fornece informaes de natureza no-eletroqumica (variao da massa do eletrodo via medio da freqncia de vibrao do cristal de quartzo) como, por ex., a cintica de crescimento de filmes ou o mecanismo de transporte inico, sem perturbar o processo eletroqumico. Alm disso, em alguns casos em que a estequiometria do processo eletrdico bem estabelecida, possvel correlacionar em tempo real a massa de filme eletrodepositado na superfcie do eletrodo por duas tcnicas diferentes, medindo-se a variao na freqncia e a carga. A utilidade desta tcnica na investigao de processos eletrocatalticos foi por ns demonstrada no estudo da oxidao andica do etanol em eletrodos de cobre em meio alcalino80.

Consideraes sobre a seletividade das determinaes

Conforme j discutido, uma das grandes limitaes das tcnicas eletroqumicas com finalidades analticas tem vnculo com a carncia de seletividade das determinaes. Se a esta dificuldade se adicionar a limitao do uso contnuo do sensor em funo de eventuais problemas com envenenamento, compreende-se o enorme esforo da comunidade eletroqumica na busca de alternativas para restringir o acesso de determinadas espcies qumicas superfcie eletrdica. Neste sentido, a estratgia convencionalmente utilizada consiste na deposio de membranas polimricas insolveis em meio aquoso, que so seletivas difuso de compostos dissolvidos em soluo por diferentes mecanismos. Como exemplos de substncias convencionalmente utilizadas podem ser citados Nafion81-83, polipirrol84, polianilina85 e acetato de celulose86. Cabe ressaltar um interessante uso de membrana de gelatina slida no recobrimento da superfcie eletrdica, que traz vantagens adicionais relacionadas menor influncia da conveco nas medies, uma vez que a camada protetora possui espessura relativamente grande. No se observou, entretanto, diminuio significativa da velocidade de transporte do analito superfcie do eletrodo87.

O modo de atuao das membranas protetoras baseia-se essencialmente em restrio por carga e tamanho e os polmeros mais utilizados so acetato de celulose e Nafion. No primeiro caso excluem-se substncias qumicas devido dimenso das molculas, uma vez que a porosidade do filme pode ser controlada adequadamente alterando-se o pH da soluo e o tempo de hidrlise. Desta forma, somente espcies relativamente pequenas tm acesso superfcie do eletrodo (ou aos stios catalticos). No caso do Nafion, o controle da passagem de espcies carregadas efetuado devido imobilizao de filme contendo stios aninicos (sulfonato) dispostos de maneira estruturada no filme. Desta forma, o polmero depositado restringe severamente a passagem de nions, mas permevel a ctions e espcies eletricamente neutras. Na Figura 4 apresenta-se de maneira esquemtica o recobrimento de uma superfcie eletrdica com vistas ao bloqueio da passagem de espcies qumicas.

MEDIES EM AMBIENTES MICROSCPICOS

Miniaturizao dos dispositivos

Seguindo uma tendncia da cincia contempornea, a miniaturizao de sistemas eletroqumicos tambm constitui-se em rea de fronteira das pesquisas, embora o trabalho com eletrodos de dimenses micromtricas remonte dcada de 40, quando a necessidade de monitorar a concentrao de oxignio em organismos vivos originou a idia da introduo de eletrodos de platina, de dimenses reduzidas, em tecidos e msculos88. Polarizando-se os eletrodos em potenciais suficientemente negativos, foram obtidos sinais de corrente proporcionais concentrao de oxignio com a vantagem de que as pequenas correntes oriundas do processo faradaico no causavam danos s clulas.

O termo "microeletrodos" est associado obteno de situaes de estado estacionrio em janelas de tempo muito mais curtas que as usualmente observadas ao se trabalhar com eletrodos de dimenses milimtricas. H vrias maneiras de se obter condies de estado estacionrio como, por ex., garantindo a contnua chegada de material eletroativo superfcie do eletrodo por conveco forada e controlada (eletrodo rotativo ou com clulas do tipo "wall-jet") ou pela utilizao de um segundo eletrodo de trabalho (localizado nas proximidades do eletrodo principal), cuja funo minimizar as perdas oriundas da difuso planar regenerando-se continuamente a espcie eletroativa ("positive feedback effect")89. Outra possibilidade envolve o uso de eletrodos com geometria suficientemente apropriada para garantir um fluxo convergente do material eletroativo, de forma a manter um fluxo contnuo em direo ao eletrodo de trabalho. Para tanto, eletrodos que possuem escala micromtrica em pelo menos uma de suas dimenses so bastante eficientes, pois o tempo necessrio para o atingimento do estado estacionrio (como conseqncia da difuso convergente) tanto menor quanto mais reduzida for esta dimenso. Desta forma, o trabalho com microeletrodos reveste-se de importncia na medida em que se minimizam os efeitos da conveco natural, sempre presente alguns segundos aps o incio dos experimentos.

O desenvolvimento contnuo da eletrnica e da indstria de preciso tem possibilitado a construo de eletrodos com rea eletroquimicamente ativa cada vez menor, impulsionando pesquisas envolvendo tais microelectrodos (ou ultramicroeletrodos) na rea de estudos

eletroqumicos fundamentais ou na aplicao dos mesmos com finalidades analticas. H inmeras revises sobre este assunto, incluindo mtodos de fabricao e aplicaes49-52,90-92. Cabe ressaltar, entretanto, que existem demandas crescentes para o desenvolvimento de mtodos analticos para monitoramento de espcies qumicas em micro-ambientes, particularmente no caso de amostras de elevado custo ou nas quais o nmero de molculas muito pequeno. Anlises em nano ou at mesmo pico-litros tm sido requeridas e neste contexto situam-se amostras de interesse biolgico4,93-97. A potencialidade analtica do uso de microeletrodos como sensores eletroqumicos despertou o interesse na construo de dispositivos que, alm de possurem as propriedades eletroqumicas inerentes aos microeletrodos, pudessem ser fabricados de maneira estruturalmente micromtrica, viabilizando o uso em ambientes microscpicos84,95. Nestes casos, o isolamento de microfibras condutoras feito sem o uso de suportes relativamente volumosos, como os utilizados classicamente (micropipetas de vidro, ponteiras de plstico, etc). Tintas eletroforticas, Teflon e outros materiais tm sido largamente empregados para estes fins e h certamente inmeras outras alternativas que podem satisfazer as necessidades requeridas em funo do tipo de amostra, freqncia de uso e tamanho do dispositivo desejado98-100.

Objetivando a fabricao de dispositivos estruturalmente microscpicos, temos estudado procedimentos para corroso de microfibras de platina e ouro (dimetro tpico de 50 mm) em que, utilizando-se transformadores AC e solues de trabalho apropriadas, se obtm extremidades "afinadas", como as mostradas na Figura 5. Por fim, as fibras so seladas pela imerso em um plastificante de borracha e posteriormente deixadas com a ponta para cima at a secagem completa101.

Finalmente, deve-se destacar a importncia da incorporao do eletrodo de referncia ao corpo do eletrodo de trabalho, principalmente no caso de sistemas qumicos cujo estudo requer a utilizao de dispositivos de dimenses muito pequenas. H diversos procedimentos descritos na literatura84,102 com vistas fabricao de eletrodos com estas caractersticas. O mais usual envolve a introduo de uma microfibra dentro do suporte do eletrodo, seguida de deposio de

uma fina camada de prata por "sputtering" na camada externa. Esse microeletrodo , ento, mergulhado em soluo de HCl e aplicando-se potencial apropriado o filme de prata convertido em filme de AgCl no corpo do capilar84,103,104.

Importncia e consideraes sobre medies em ambientes microscpicos

A comunicao entre clulas efetuada por biomolculas, como catecolaminas, insulina e dopamina, entre outras, e a habilidade de monitoramento da concentrao destes compostos muito importante em estudos fisiolgicos relacionados transmisso de sinais para o sistema nervoso central. Como j relatado anteriormente, o uso de sensores eletroqumicos de dimenses estruturalmente microscpicas constitui-se em poderosa ferramenta para este tipo de estudo, em que se deseja realizar anlises em microambientes e em tempo real. Esta caracterstica essencial dos sensores eletroqumicos os distinguem com vantagens comparando-se com procedimentos bem estabelecidos na literatura em que so empregadas tcnicas de extrao de amostras em regies adjacentes clula. Neste caso, volumes muito pequenos (da ordem de nL ou mesmo pL) so removidos do ambiente celular com auxlio de micropipetas para posterior anlise por tcnicas analticas convencionais, como as espectroscpicas ou de separao, e especial ateno tem sido dada eletroforese capilar. Ganha-se em seletividade, pois as tcnicas citadas podem conduzir a informaes sobre a composio da amostra, mas perde-se em resoluo temporal e espacial105. Uma excelente reviso sobre "single-cell analysis" foi publicada recentemente e nela podem ser encontradas informaes detalhadas sobre as metodologias usualmente empregadas neste tipo de investigao106. Avaliaes crticas sobre as vantagens e desvantagens da anlise de clulas individuais tm sido apresentadas na literatura107 e como aspectos positivos considera-se a importncia da localizao das molculas na clula e a anlise de comportamentos individuais que se diluem em populaes. De outro lado, problemas vinculados representatividade dos resultados tm sido apontados, assim como o fato de que informaes diferentes podem ser obtidas no como resultado do comportamento da clula, mas sim dos diferentes estgios do processo de diviso.

A possibilidade de mapear o microambiente vizinho clula constitui-se na grande vantagem dos sensores amperomtricos neste tipo de estudo108. Uma das caractersticas necessrias do sensor empregado a elevada resoluo espacial em escala tridimesional e, para tanto, a fabricao de dispositivos com geometria microscpica essencial. O tempo de resposta do dispositivo deve ser muito baixo, para que os dados sobre os eventos possam ser adquiridos em tempo real, e tanto a seletividade como a sensibilidade das determinaes devem ser suficientemente altas, para que os sinais medidos tenham perfeita correlao com as informaes desejadas.

Um aspecto a ser considerado no uso de sensores eletroqumicos para obteno de informaes sobre a liberao de biomolculas em ambientes celulares diz respeito eventual distribuio no-uniforme da espcie qumica de interesse no espao amostrado. Diferentemente de medies realizadas em meio homogneo, nestes casos cria-se um gradiente de concentrao, de forma que o significado da medio efetuada em um ponto muito especfico do ambiente celular deve ser analisado com cuidado. Este efeito tanto mais pronunciado quanto menor for a distncia entre a fonte emissora da biomolcula e a extremidade do sensor, razo pela qual a resposta do dispositivo deve ser muito rpida para monitorar com resoluo as variaes na composio do microambiente.

Outro detalhe a ser considerado durante medies em amostras de dimenses reduzidas tem relao com a perturbao no sistema ocasionada pela eletrlise. Nestas situaes, em que o nmero de molculas extremamente pequeno, as modificaes na composio da soluo podem ser significativas, tanto pela remoo do analito estudado, como tambm pela introduo de novas espcies qumicas resultantes do processo eletrdico. Estudos tm sido realizados com intuito de avaliar a extenso da eletrlise nestes microambientes, tipicamente da ordem de alguns pL, e de fazer comparaes com processos similares conduzidos em condies convencionais (volumes no restritos). As perdas por evaporao so minimizadas pelo recobrimento da soluo aquosa com leos minerais ou acondicionamento da amostra em "microvials" ou reservatrios especialmente fabricados por litografia93-95,97. Estas estratgias so bastante teis quando se deseja monitorar a concentrao total da espcie liberada durante um evento no ambiente celular e, visto que as molculas podem ser mantidas em volumes muito reduzidos, pode-se trabalhar com concentraes relativamente altas.

Determinaes amperomtricas in vivo de espcies qumicas de importncia biolgica

Conforme j frisado em seo anterior, o emprego de sensores eletroqumicos para monitoramento da concentrao de molculas de relevncia biolgica tem sido objeto de investigaes crescentes e profcuas em Eletroanaltica, motivadas especialmente pela versatilidade dos procedimentos associados tcnica. Uma das espcies mais estudadas consiste no xido ntrico (NO), molcula reconhecida como mensageiro celular no corpo humano. O papel do NO na evoluo de diversas doenas relacionadas ao corao e impotncia sexual tem motivado estudos sobre comportamento bioqumico e propriedades teraputicas. A rpida difuso da molcula do centro gerador ao stio de atuao e a elevada reatividade qumica justificam o desenvolvimento de dispositivos confiveis, precisos, sensveis e de resposta rpida para viabilizar a compreenso dos mecanismos de atuao do NO.

O desenvolvimento de sensores eletroqumicos para medies de NO in vivo remonta ao incio da dcada de 90, quando foram publicados os primeiros trabalhos que nortearam o princpio de fabricao de sensores comercias para NO. Estes baseiam-se no recobrimento de microeletrodos de platina com filmes eletropolimerizados de porfirinas de nquel109,110. O papel destes filmes envolve processo eletrocataltico de oxidao do NO e na presena de membranas de Nafion restringe-se a oxidao de espcies aninicas presentes nos fluidos biolgicos como, por ex., ascorbato. Algumas revises sobre o assunto podem ser encontradas na literatura111-115, assim como exemplos de recentes aplicaes destes sensores eletroqumicos para monitoramento de NO em amostras biolgicas114,116-119. Nossas contribuies nesta rea envolveram estudos sobre a codeposio de complexos de rutnio e xidos de molibdnio em microeletrodos de ouro e pde-se constatar a viabilidade do uso do dispositivo no monitoramento da variao da concentrao de NO liberado em reao qumica envolvendo peroxonitrito e tempol em meio de bicarbonato120.

Pode-se constatar a importncia do uso de microeletrodos como sensores para neurotransmissores121 em nvel celular pelos inmeros trabalhados publicados recentemente na literatura. Compostos como glutamato122, catecolaminas123,124, dopamina125-127, serotonina124,127, entre outros, tm sido determinados com seletividade, sensibilidade e tempo de resposta adequados, fornecendo subsdios para melhor compreenso dos processos de transmisso de informaes entre clulas nervosas.

O glutamato o principal neurotransmissor excitatrio do crebro de mamferos e em altas quantidades pode causar desordens neurolgicas, incluindo esquizofrenia, doena de Parkinson, derrame e epilepsia. Portanto, sensores capazes de monitorar a liberao desta espcie qumica em tempo real podem contribuir para melhor entendimento dos estados fisiolgico e patolgico induzidos pelo glutamato no sistema nervoso central. Quanto determinao de glutamato in vivo, h uma grande quantidade de trabalhos recentes relatados na literatura122,128-130.

Algumas purinas, tais como ATP e adenosina, tambm so de grande importncia biolgica por serem indicativos de distrbios neurolgicos. Por esta razo, um aumento crescente no nmero de artigos publicados na literatura envolvendo a fabricao de microeletrodos para determinao destas purinas em tempo real tem sido evidenciado131-133.

Outros compostos gerados como respostas a estmulos s clulas tambm tm sido determinados com sensores eletroqumicos e, dentre eles, podem-se citar perxido de hidrognio134, lactato135-137 e superxidos138,139. A possibilidade de monitoramento de mais de um composto na superfcie do crebro com um dispositivo nico constitudo por conjunto de

microeletrodos de disco separados foi discutida por Michael e colaboradores125. A seletividade das respostas obtidas para glutamato, glicose e colina foi demonstrada em trabalho em que enzimas so suportadas na superfcie de microletrodos de fibra de carbono com auxlio de filmes polimricos123. Propostas para determinao simultnea de catecolaminas e serotonina124 ou serotonina e dopamina127 tambm so encontradas na literatura.

O lactato conhecido como um dos mais importantes metablitos em anlise clnica e consiste em indicador de choques, insuficincia respiratria, doenas cardacas e desordem metablica. Os nveis de lactato podem tambm ser associados a problemas nos tecidos, trombose e s condies fsicas de animais e atletas. Por este motivo, novas tecnologias para dosagem do lactato vm sendo estudadas em conjunto com testes laboratoriais realizados fora do ambiente clnico convencional, testes estes chamados de "point-of-care testing"140. Viabiliza-se, desta maneira, a dosagem da concentrao sangunea do lactato em campo, de forma precisa e com uma pequena gota de sangue obtida da ponta de um dos dedos do atleta. Como o resultado obtido em poucos minutos, a realizao do teste, a interpretao dos resultados e a tomada de decises so facilitadas, ampliando o uso do indicador na Medicina Esportiva.

PERSPECTIVAS E DESAFIOS

A viabilidade tecnolgica da fabricao de microeletrodos com extremidades muito finas, com dimenses sub-micromtricas, tem alargado o uso da tcnica SECM ("scanning electrochemical microscopy") no estudo de sistemas celulares141. A elevada resoluo espacial da tcnica oriunda da dimenso reduzida do eletrodo, associada rapidez das respostas obtidas em condies de estado estacionrio, permite a obteno de informaes sobre a concentrao em uma escala tridimensional. Obtm-se, portanto, mapas topogrficos do sistema qumico. A tcnica tambm possibilita a gerao eletroqumica de espcies qumicas em regies muito especficas, dando ensejo a experimentos sobre a reatividade de molculas em localidades definidas da clula. Finalmente, cabe ressaltar a importncia de se operar no modo "positive feedback"89,142, uma vez que se pode encapsular um pequeno nmero de molculas em um ambiente muito restrito. Como a espcie eletroativa pode ser continuamente regenerada no microeletrodo, localizado muito prximo do substrato, mesmo que o nmero de molculas seja pequeno podem-se obter correntes mensurveis142,143.

Embora existam vantagens indiscutveis no uso de sensores eletroqumicos, alguns aspectos ainda esto no limiar de solues plausveis quando se pensa em termos "realmente prticos". Um dos desafios para os quais j existem pesquisas em andamento refere-se, por ex., implantao de sensores no corpo humano144. Esta possibilidade altamente atraente pois eliminam-se as desvantagens dos procedimentos invasivos muito freqentes que, mesmo para volumes pequenos de amostra, causam inconvenientes. O exemplo mais prximo da vida cotidiana envolve medies do nvel de glicose no sangue, para as j quais existem sensores amperomtricos comerciais145. Entretanto, quando implantados no tecido humano, de se esperar uma pronta resposta do organismo contra a "invaso", resultando no desenvolvimento de camadas protetoras que tendem a isolar o dispositivo do ambiente celular. Outros tens a serem considerados relacionam-se necessidade de recarregamento da bateria do sensor, eventual recalibrao peridica e biocompatibilidade dos materiais empregados. Trata-se, portanto, de aspectos de ordem prtica que vo requerer investigaes aprofundadas para consecuo das metas desejadas, ou seja, dispositivos operando a baixo custo e com autonomia suficientemente prolongada para garantir o longo uso.

Ressalte-se ainda que sistemas miniaturizados de monitoramento constituem-se em ferramenta para coleta e transmisso de dados sobre a sade de pacientes em ambientes domiciliares ou no trabalho, facilitando a predio de doenas e o possvel diagnstico. Como conseqncia, consultas face a face podem ser reduzidas, assim como as estadas em hospitais. Essa tecnologia, denominada telemetria, tambm pode contribuir para otimizao dos recursos destinados preveno de doenas, principalmente em ambientes rurais. Trabalhos envolvendo o uso de sistemas telemtricos implantados para monitoramento de atividades neurais146, nvel de oxignio no sangue e freqncias cardaca e respiratria147 e arritmias148 j esto relatados na literatura.

Em resumo, o futuro da rea de pesquisas sobre sensores eletroqumicos, especialmente aqueles destinados ao uso com fins de monitoramento em sistema biolgicos, certamente vai envolver o conceito de interdisciplinaridade. A preparao de novos polmeros e matrizes hospedeiras aos quais se alojam catalisadores eficientes consiste em rea onde qumicos de diferentes especialidades podem atuar e, neste sentido, so relevantes no s pesquisas aplicadas mas tambm aquelas de cunho fundamental. A imobilizao do material em eletrodos de dimenses nano ou micromtricas necessita de estudos contnuos na rea de novos materiais e nanotecnologia. Investigaes e novos desenvolvimentos relacionados ao uso do sensor eletroqumico no monitoramento de metablitos de reaes enzimticas ou substncias de interesse bioqumico podem ser de valia tanto para profissionais ligados rea de Qumica, como tambm para aqueles ligados s reas biolgicas. A construo de dispositivos portteis e a recepo e transmisso fidedigna de dados a longas distncias (telemetria) vai depender da interao com engenheiros. Conclui-se, portanto, que a linha de pesquisa envolvendo sensores

eletroqumicos vai suplantar em um futuro prximo as fronteiras da academia e atrair a ateno das reas tecnolgicas e comerciais, demonstrando a importncia deste ramo da cincia para a melhoria das condies de vida em nossa sociedade.

AGRADECIMENTOS

FAPESP, CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro concedido na forma de bolsas e para o financiamento das pesquisas.