FACULDADE ESTÁCIO DE SÁ DE CAMPO GRANDE-MS

BIOQUÍMICA – PRÁTICA

PROFESSOR Dr. JOAQUIM CORSINO APOIO TÉCNICO – Rafael e Euler

Campo Grande – MS 2008 INTRODUÇÃO A – Objetivos Gerais das Aulas Práticas de Bioquímica As aulas práticas de Bioquímica tem como objetivo criar condições para que os estudantes sejam capazes, ao final do curso, de: 1. Manipular os equipamentos freqüentemente utilizados em laboratório de bioquímica. 2. Conhecer por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades químicas das substâncias que compõem os organismos vivos. 3. Interpretar resultados experimentais. B – Normas do Laboratório de Bioquímica 1. Espectrofotômetro, centrifuga, banho-maria ou quaisquer outros aparelhos, somente deverão ser manuseados pelos alunos após instruções, a fim de se evitar danos irreparáveis. 2. Em dias e hora pré-determinados, os alunos terão à sua disposição professores e técnicos encarregados de orienta-los na execução e interpretação dos referidos trabalhos. 3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixa-los aberto, tomando o cuidado de fechar as torneiras completamente. 4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar a corrosão dos encanamentos. C – Prevenção de Acidentes 1. Trabalhar sempre protegido por avental. 2. Não fumar dentro do laboratório. 3. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira de gás, antes que tenha a mão o palito de fósforo acesso. 4. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma chama. Usar banho de água ou areia. 5. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, álcali ou ácidos fortes (quando concentrados), não deverão ser pipetados com a boca.

TRABALHO PRÁTICO

IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber: 1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de aminoácidos. 2. O significado de seguintes reações particulares. • Reação xantoprotéica • Reação de Sakaguchi • Reação de aminoácidos que contém enxofre. 1. Reações Gerais dos Aminoácidos a.Formação de sais com ácidos e bases devido à natureza de íon dipolar dos aminoácidos O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos, é extremamente importante para o entendimento de muitas propriedades das proteínas. Além disso, separar, identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, que são passos necessários para a determinação da composição e seqüência aminoácidos das proteínas, é baseada no comportamento característicos de cada um destes monômeros. Os aminoácidos são cristalizados a partir de soluções aquosas neutras em sua forma totalmente ionizada como íons dipolares ou zwitterions. Embora tais íons dipolares sejam eletricamente neutros e não se movam em um campo elétrico, eles possuem cargas opostas nos seus dois pólos. Quando um aminoácido neutro é dissolvido em água, ele pode se comportar como um ácido (doador de prótons) ou como uma base (aceptor de prótons). OHR-CH(+NH3)-COOH H
+

OHR-CH(+NH3) COOH
+

R-CH(NH2)-COO-

[ A-] Sabendo-se que: pH = pK1 + log -------[ HA]

onde HA é um ácido qualquer

Podemos, por uma curva de titulação, calcular os diferentes pK, s de um determinado aminoácido bem como o seu ponto isoelétrico, a partir da relação:

PK, 1 + pK,2 pI = ---------------------2 Dessa maneira, podemos, a partir dos valores de pK e pI identificar qualquer dos 20 aminoácidos protéicos.

Procedimento experimental

a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amônia liberada formando um complexo violeta ou púrpura. NaOH 2N e acompanhar a dissolução da tirosina precipitada. que é amarelo.20. conseqüentemente.5 – amarelo. reduzindo. Escrever as reações envolvidas nos diversos passos da experiência. Reação com Ninhidrina A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) é um composto heterocíclico que forma um derivado corado. gota a gota. + NH3 H HO CH2 C COO - TIROSINA OBSERVAÇÃO: O vermelho de cresol apresenta os seguintes pontos de viragem: pH 0. Prosseguir a adição de HCl até dissolução da tirosina. esta reação é freqüentemente utilizada para determinação quantitativa de aminoácidos em solução.5 – 6. pH 2. e um derivado aldeídico com um átomo de carbono a menos e. com os amingrupos dos aminoácidos livres ou de terminações de proteínas e peptídeos. Exceto o derivado da prolina. NH3 .5 – rosa. usando a estrutura da tirosina e explicar cada etapa do processo. pK2 = 9. HCl 10% e notar a formação de precipitado. observar que a tirosina não se dissolve.0 – 2.roxo pK. pH acima de 7. Adicionar. Posteriormente. . A ninhidrina oxida o aminoácido. As reações podem ser equacionadas da seguinte maneira: H O OH OH O + H R C COOH NH2 CO2 + R C O O OH H NH3 O HO Ninidrina reduzida O Ninidrina oxidada O + H + 3 H2O + HO O N O O - O Complexo colorido Como a intensidade da coloração do complexo formado é proporcional à concentração de aminoácidos ou peptídeos pequenos. s da tirosina: pK1 = 2. após reagir com aminas. produzindo CO2 . pK3 = 10. Adicionar.11.• • • • • Suspender uma pitada de tirosina em 1 mL de água Acrescentar uma gota de indicador de cor (vermelho cresol).07 Responda: • • Qual é o pI da tirosina? Se em lugar da tirosina tivesse sido empregada a glicina.0 . gota a gota. os mesmos resultados seriam observados? Por que? b.

5 α – Naftol NaClO .0 1.0 3 3 1 4 Triptofano 0.0 3 3 1 5 Solução Protéica 1.5% o mL N gotas gotas mL 1 Água 1. 2.0 3 3 1 2 Arginina 0. Aminoácidos com grupos guanidina: Reação de Sakaguchi H2N C NH R NH2 OH Os aminoácidos com grupo guanidina [ Um complexo verde com o α – naftol ( ] desenvolvem em meio alcalino ) que.0 3 3 1 Misturar e observar a cor.0 1.0 1.0 1. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.5 mM 1.0 3 3 1 3 Glicina 0. Anote os resultados e explique-os.0 Ninhidrina 0.0 1. Anote os resultados e explique-os.Procedimento experimental Tubo 1 2 3 4 5 6 Amostra/Concentração Água Glicina 0. Identifique o (s) aminoácidos (s) contendo o grupo guanidina. Após a adição da ninhidrina.5 mM Aspartame 0. adoçante 200 vezes mais potente do que o açúcar.5 mM Leucina 0.mL 1.1% (gotas) 5 5 5 5 5 5 * Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éste ). aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos. Procedimento experimental Amostra/Concentraçã Volume NaOH 2. Tubos . que desaparece após alguns minutos. Compare os resultados com o branco (tubo 1).5 mM 1. usando o tubo 1 como controle.5 mM Prolina 0.19%* Solução protéica Volume .5 mM 1. Reações específicas de identificação de aminoácidos a.0. em presença de hipoclorito de sódio (NaClO) passa a avermelhado.

Relacione os aminoácidos aromáticos e suas respectivas estruturas. formando o PbS. com suas respectivas fórmulas estruturais. em meio alcalino e. . c.mL 2 2 2 2 NaOH 2 N 100º C mL 1 1 1 1 (CH3COO)2Pb mL 0. Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2 Pb.5 0.5 0.b. Reação para aminoácidos contendo enxofre Aminoácidos que contém enxofre. O precipitado branco que se forma é devido à ação do HNO3 (ácido mineral forte).5 mM Solução Protéica Volume .5 mM Tirosina 0. Procedimento experimental *** OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança.5 mM Triptofano 0.5 Anote os resultados obtidos e explique-os.5 0. Reação xantoprotéica Específica para aminoácidos que apresentam anel aromático. que escurece a reação: H H R S R C NH2 COOH + NaOH Na2S + R C NH2 Aminoácido com enxofre COOH Sulfeto de sódio Aminoácido sem enxofre PbS CH3COONa Acetado de sódio Na2S Sulfeto de sódio + (CH2COO)2Pb Acetado de chumbo + Sufeto de chumbo Cite os aminoácidos que contém enxofre. liberam o enxofre que aparece na forma de sulfeto de sódio (Na2S). e o desenvolvimento da cor amarela ocorre por formação de nitrocompostos (anel aromático + NO 2 ).mL 2 2 2 2 2 HNO3 . Tubos 1 2 3 4 5 Amostra/Concentração Água Glicina 0.mL 1 1 1 1 1 Anote os resultados e explique-os. os experimentos a seguir deverão ser efetuados na capela. Procedimento experimental Tubos 1 2 3 4 Amostras Água Cisteína Glicina Solução Protéica Volume . à quente.

Neste pH as proteínas não apresentam carga efetiva (as cargas positivas são iguais às negativas) e portanto não atuam como forças eletrostáticas entre as outras moléculas presentes no meio.CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS I – INTRODUÇÃO As proteínas. força iônica do meio.pelo fato das moléculas de proteínas se repelirem. III – REAÇÃO DO BIURETO 3. quando tratadas com uma solução diluída de sulfato de cobre. A solubilidade por exemplo. de cor púrpura) . devido à formação do complexo de coordenação entre o átomo de cobre e 4 átomos de nitrogênio. Estas moléculas. que são macromoléculas de peso molecular definido. Em geral as proteínas são menos solúveis no ponto isoelétrico. bem como as técnicas e reações de identificação das mesmas. em meio alcalino.(complexo de coordenação entre peptídeos e cobre II. Nestes casos. O comportamento físico-químico das proteínas está relacionado a vários fatores. HN R CH O C HN Cu NH HC NH R C O Biureto . II – OBJETIVOS ESPECÍFICOS No final deste trabalho prático o aluno estará familiarizado com as propriedades físicoquímicas das proteínas. haverá menor tendência para agregação e precipitação. Sendo assim. são eletrólitos cujo comportamento se ajusta aos mesmos princípios físicos de eletrólitos de massa molecular menor. dão coloração púrpura característica. A natureza química dos radicais R (cadeias laterais) dos aminoácidos que compõe a estrutura primária das proteínas determina a sua estrutura secundária e/ou terciária.1 – Fundamento NH C O A reação do biureto ocorre com substâncias que contenham grupos e grupos nitrogenados. De ambos os lados do pH isoelétrico todas as moléculas terão carga efetiva positiva ou negativa. essa reação é positiva para todas as proteínas e peptídeos graças às suas ligações peptídicas. depende pH. constante dielétrica do solvente e temperatura.

5 5 Extrato de Soja(d). e observar a coagulação. IV – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS 4. • d) homogeneização de 10 g de farinha de soja de semente de soja em 100 mL de água destilada.5 (c) 4 Leite . 2 mL 0. etc). 2 mL 0. Procedimento • Colocar em tubos de ensaio soluções contendo proteínas (ovo.5 (b) 3 Gema de ovo . 2 mL 0. pelo professor. enquanto que no tubo contendo apenas água e os reagentes verificar-se-á uma cor azul escura característica do cobre em meio alcalino (formação de Cu (OH)2 e de óxidos de Cu). Esta reação é sensível a concentração da ordem 1:30. soro. A reação de Heller (reação de proteínas com HNO3 concentrado) é freqüentemente utilizada para a pesquisa de albumina na urina e permite a dosagem semi-quantitativa.5 0.2 – Coagulação com ácidos minerais – Reação de Heller Fundamento Os ácidos minerais fortes desnaturam as proteínas.5 2 Clara de ovo(a). Procedimento Experimental ***OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança.000. .5% mL NaOH a 10% mL 1 Água.5 0.5 0.5 0. 4. de maneira demonstrativa. • c) homogeneização de 50 g (5 colheres médias) de leite em pó com 100 mL de água. Observar que em alguns tubos haverá formação de uma coloração violeta.1.3. transformando-as em metaproteínas. • b) homogeneização de 1 gema de ovo com 50 mL de água. insolúveis. 2 mL 0.5 0. 2 mL 0. quando submetidas à ação do calor desnaturam irreversivelmente.1 – Termocoagulação – Coagulação pelo calor As proteínas são termolábeis. • Aquecer.1.5 • Soluções preparadas por: a) homogeneização de 1 clara de ovo com 50 mL de água.1 – Reações de Precipitação de Proteínas com Desnaturação 4. o experimento a seguir deverá ser efetuado na capela. característica de reação positiva.2 – Procedimento Montar uma bateria com: Tubos Amostra CuSO4 a 0.

por exemplo: HgCl 2.Colocar um tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica • Juntar cuidadosamente e vagarosamente. pelas paredes do tubo. 2 mL de HNO3 concentrado. Outros somente precipitam proteínas em meio ácidos. até observar a formação de precipitado. (CH2COO)2Pb (acetato de chumbo). AgNO3 CuSO4. assim o exigem.1. Creatinina. Procedimento B Colocar em um tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica. Notar a formação de um anel branco na separação das camadas. Observar no limite de separação das duas camadas um anel branco (proteína e meta-proteína). • Tubo Então Juntar: • 0.3 – Precipitação com Sais de Metais Pesados Alguns sais de metais pesados precipitam as proteínas. 4.4 – Precipitação com Solventes Orgânicos Colocar em tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica. FeCl3. Procedimento A Solução Protéica CuSO4 0. quando os métodos de dosagens de Glicose.1. Notar que não ocorre precipitação. etc. Esta reação é utilizada em análises clínicas para desproteinização de sangue (método de Follin – Wu). • 1 mL de etanol. Interprete os resultados observados.1. • 1 mL de solução de Na2WO4 10% • Agitar. Uréia.5% FeCl3 1% (CH2COO)2 Pb mL 1% 1 2 2 2 *gotas 3 2 *gotas 4 2 *gotas * Adicionar gotas das soluções de metais pesados à solução protéica. 4.5 mL de H2SO4 10%. Por exemplo: Na2WO4 (tungstato de sódio). sem misturar.5 – Precipitação por reagentes alcalóides . Forma-se imediatamente um precipitado. 4.

Reação de Esbach Procedimento Experimental Colocar em tubo de ensaio: • 2 mL de solução protéica. re-dissolve o precipitado formado..0g em 100 mL de H2O). Forma-se um precipitado amarelo. . tânico. Quando adicionamos base.). etc. • 1 mL do reativo de esbach (ácido pícrico – 1. agem pelo seu âniom e reagem com as proteínas formando sais (proteinados) insolúveis.Os reagentes alcalóides (ácido pícrico.0g / ácido cítrico – 2. • Juntar: • 1 mL de NaOH 10%. cítrico.. Explicar. no lado ácido do seu pI. Observar a dissolução do precipitado. portanto. Esta reação só é possível se a proteína apresentar carga positiva.

em meio alcalino.0 1.0 H2O2 3% gotas 3 3 b. nem pelo oxigênio molecular (O2). Procedimento Experimental 1.mL 5. Note a formação de espuma abundante. que se intensifica.: O reativo de Kastle-Meuer é uma solução alcalina de fenolftaleína reduza (AH 2). sendo rara em tecidos animais. Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade.0 Água . lentamente. Atividade da Catalase Enzima presente em quase todas as células animais. a. no tubo que contém sangue. 2. Atividade da Peroxidase A peroxidase é uma enzima encontrada em todas as plantas superiores. oxidando assim a fenolftaleína.0 Sangue diluído mL 5. Manipular reações catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar semiquantitativamente a influência da concentração de enzima. AH2 + H2O2 Fenolftaleína reduzida → 2H2O + A+ Fenolftaleína oxidada . OBS. Não sendo oxidada pelo peróxido de hidrogênio (H2O2). Note o aparecimento imediato de cor rosa. que transfere dois átomos de hidrogênio do substrato (AH 2) para H2O2. Procure uma explicação para o fato. que oxida diidroxifenóis na presença de H2O2. a. As exceções são leucócitos. Em um tubo de ensaio colocar: • 10 gotas de sangue • 5 mL de água destilada – homogeneizar • 1 mL de H2O2 3% (10 volumes) – agitar b. Esquematize a reação ocorrida. hemácias. fígado e rins.ENZIMAS I Objetivos Específicos • • • Ao final deste trabalho prático o estudante deverá saber: Manipular experimentalmente soluções de enzimas. Colocar em dois tubos de ensaio: Tubos 1 2 Reativo Kastle-Meyer 1. que adquire coloração rósea. formando a quinona correspondente. temperatura e do pH na atividade enzimática. O sangue contém peroxidase. que é convertido em H2O.

e de estrutura incerta. O O C5H10O5 + C H H2SO4 α-naftol O furfural HOH2C C6H12O6 + Composto violeta O C H H2SO4 α-naftol Composto violeta hidroximetilfurfural Procedimento experimental Preparar os seguintes 8 tubos de reação: Tubos 1 2 3 4 Amostra Água Glicose 0. 1.1 M Frutose 0. etc. há reações gerais e outras para estruturas mais específicas.1 M Sacarose 0.0 1. de cor violeta. o estudante deverá saber: • • Executar testes qualitativos para reconhecimento de carboidratos Significado dos seguintes testes: Molisch.IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS Introdução Os carboidratos podem ser identificados por meio de várias reações. Assim. para aldoses. mono e dissacarídeos redutores. Objetivos Específicos No final deste trabalho prático. Barfoed.0 1. como aquelas.1 M Volume mL 1. Algumas dessas reações envolvem a formação de complexos corados. Abaixo estão representadas as reações de formação de furfural e de hidroximetilfurfural.0 Alfa-naftol 5% em etanol gotas 3 3 3 3 . Reação de Molich Os carboidratos e algumas substâncias. que se transformam em furfural ou seus derivados na presença de H2SO4. reagem com alta naftol. Seliwanoff e Benedict. cetoses. formando compostos de condensação. e a especificidade da identificação depende da estrutura dos carboidratos.0 1. respectivamente a partir de uma pentose e de uma hexose.

portanto. dando origem a um composto de cor roxa. Cu+2 (aq) + CH3COO. Anotar os resultados.) + CH3COO.1 M Volume mL 1 1 Seliwanoff (Resorcinol 0. por sua vez. ( *) Aspartame = L – aspartil-L –fenilalanina – metil – éster.5 . nas condições do teste. que contém resorcinol (1.5 6 7 8 Amido 0.5 1.0 1.(aq) + carboidrato oxidado 3. a partir da reação entre acetato cúprico e o carboidrato. formam derivados de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff. e que haja a menor agitação possível.1% Aspartame 0. 2 mL de h2SO4 concentrado (CUIDADO CORROSIVO!!!). Reação de Seliwanoff Na presença de HCl. a diferenciação entre ambos ( mon e dissacarídeos ). 2. sem agitar. pela ação desidratante do ácido sulfúrico. e é positiva também para sacarose que.0 1. Estes. pela velocidade com que se forma Cu2O. deve ser desprezada. ou hidroximetilfurfural no caso de hexose. porque na presença de HCl. Estes. Reação de Barfoed Através desta reação se distingue um mono de um dissacarídeo. Oreativo de Barfoed oxida os monossacarídeos ( a mono-ácidos ) mais rapidamente que os dissacarídeos permitindo. produzindo compostos avermelhados. usando o tubo 1 (branco. as cetoses.2%” (*) Ciclamato/sacarina 1.0 1. O teste de Molisch serve para identificar carboidratos.(aq) + carboidrato → Cu2O (prec. adicionar lentamente.3 – bezenodiol). transformam-se em furfural no caso de pentoses. mais rapidamente do que as aldoses. natol). Para o bom êxito desta reação é necessário que o tubo esteja seco. ocorre a sua transformação em frutose.0 3 3 3 3 Pela parede do tubo inclinado.1% Maltose 0. A reação exige aquecimento em banho fervente.05 % em HCl 2 N) 1. controle) como referência. A concentração do HCl na reação não deve ultrapassar 12 % (aproximadamente 4 N). é hidrolisada em glicose e frutose. A coloração verde que às vezes se forma. Mesmo a glicose pode dar reação positiva. reagem com os fenóis (timol. se o aquecimento for prolongado. A reação que ocorre é a seguinte: Aquecimento Cetose + HCl O C O H resorcinol Composto violeta furfural Procedimento experimental Preparar 5 tubos de ensaio: Tubos 1 2 Amostra Água Frutose 0.

colocar em banho de água fervente. a não ser após a sua hidrólise. mas negativos para polímeros de cadeias longas. 4.5 1. sob aquecimento. lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle) como referência. acrescente algumas gotas de etanol absoluto. são reduzidos por grupos aldeídos ou cetônicos livres de vários carboidratos. de cor azul. As reações abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presença e na ausência de agentes redutores. sobretudo na urina. Quando notar o aparecimento da cor vermelha acompanhada ou não de precipitado de cor marrom avermelhado.1 M Sacarose 0. baseadas em ensaio . Reação de Benedict Utilizada para identificação de carboidratos redutores. nomeio da reação. forma-se uma suspensão que. íons metálicos disponíveis para se reduzirem. amido não dá reação positiva. reage com os íons metálicos. mercúrio. em meio alcalino e a quente. Cu (OH)2. há testes mais sensíveis para dosagem rápida de glicose. dissolvidos em Na2CO3 2 M. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja. Atualmente. emprega-se CuSO4 à 2%. Mas se compostos redutores forem acrescentados à suspensão. em meio alcalino. Assim. e a reação é tanto mais positiva quanto maior a extensão da hidrólise. Ausência de composto redutor: Meio alcalino Cu(OH)2 (azul) Aquecimento CuO + (preto) H2O Presença de composto redutor: Meio Alcalino Cu (OH)2 (azul) Aquecimento Cu2O + (amarelo/vermelho) H2O Como não é prático utilizar uma suspensão de Cu2+. Para dissolver o precipitado eventualmente formado. cobre. era empregado no diagnóstico de pacientes diabéticos. Colocando-se hidróxido de cobre II. o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2O. formando um complexo iônico solúvel. de modo rotineiro. acrescenta-se ao meio da reação um composto orgânico solubilizador que. no caso de reagente de Benedict (qualitativo). agitando o tubo. CuO de cor preta. emprega-se CuSO 4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%. solubilizado por tartarato de Na + e de K+ 10%. etc. retirar o tubo do banho.1 M Pentose 0. até no máximo 15 minutos.3 4 5 Glicose 0. e também para evitar que o CuO (preto) mascare o resultado da reação. Anotar os resultados obtidos. se precipita como óxido de cobre II. ou suspeito de sê-lo. dissolvido em NaOH 2 M. prata.1 M 1 1 1 1.5 1. que se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho.5 Após misturar o conteúdo dos tubos. em meio alcalino adequado. Íons de metais como. e acompanhar o desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos. ferro. Os testes de carboidratos redutores são positivos para compostos com grupamento – OH glicosídico livre. No caso do reagente de Felihling. o teste de substâncias redutoras. Até alguns anos atrás.

0 1.0 1.1 M 4 Sacarose 0. + a ++++).0 Resultado Aquecer todos os tubos em banho de água fervente .0 1. numa escala de 1 a 4 cruzes.0 1.1 M 5 Amido 0. Explique os resultados. Procedimento experimental Identificação de substâncias redutores com reagentes de Benedict (qualitativo) Preparar 9 tubos de ensaio: ´Tubo Amostra 1 Água 2 Glicose 0.0 1.0 1.enzimático (glicofita/glicose-oxidase) e que são muitos mais práticos.0 1.0 Reagente de Benedict 1.0 1. Anotar os resultados obtidos (se positivo.1 M 3 Frutose 0.1% 6 Maltose 0.0 1.0 1. comparando com o tubo 1 (controle). durante 5 minutos. por não exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados.1 M 7 Aspartame 0. .0 1.0 1.0 1.2% 8 Ciclamato/Sacarina 9 Urina humana Volume mL 1.0 1.0 1.0 1.

A cadeia linear (amilose) é solúvel e a cadeia ramificada (amilopectina). enquanto o glicogênio. B. Na estrutura do amido. cuidadosamente. o glicogênio é formado por ligações de tipo α (1.6). 8. Deixar o amido se depositar no béquer aproximadamente 20 minutos 6. filtrando em gaze e recolhendo o filtrado no béquer de 500 mL 5. transferindo as raspas para um béquer de 250 mL 2. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro 3. de composição incerta. mas é refeito quando é resfriado. Na presença de iodo. 4. Também. com uma lâmina de vidro. 7.IDENTIFICAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS Objetivos Específicos No final deste trabalho prático o estudante deverá saber: 1.4) não reage com iodo. A celulose. O amido da batata é constituído por 98% de amilose e 2% de amilopectina. à semelhanç do amido. Extrair novamente o amido da raspa com 50 mL de água. Colocar aproximadamente 25 mL de (amido) completo para 50 mL (água quente) . Esse complexo se desfaz sob aquecimento. recolhendo o filtrado em um béquer de 500 mL. à semelhança do amido. mas constituído de ligações β (1. perdendo a cor azul.4) e α (1. reage formando um complexo de cor avermelhada. a cadeia linear é constituída por resíduos de glicose ligados entre si por ligações α (1. também um polímero de glicose. 3. 6. Extrair grãos de amido de batata Preparar soluções de amido Reconhecer a presença de amido pelo teste de iodo – Lugol Realizar a hidrólise química do amido Determinar a progressão de hidrólise pelos testes de iodo e Benedict Reconhecer os produtos de hidrólise parcial e total de amido Extrair e caracterizar o glicogênio hepático significado das reações e operações realizadas I. Descartar. Extração do amido 1. o líquido sobrenadante. Filtrar em gaze. o amido forma um complexo de cor azulada. Extração e identificação do amido O amido não pode ser detectado pelos testes de redução. para determinação da atividade redutora. enquanto na cadeia ramificada ocorrem ligações α(1. insolúvel.6).4). 5. porque dispõe de um número muito reduzido de resíduos de glicose livre.4) e α(1. Preparação da solução de amido 1. Espremer a gaze 4. Procedimento experimental A. 2. Raspar integralmente uma batata.

os tubos que dissolveram cor com Lugol. Adicionar em um dos tubos 3 gotas de lugol.1% Celulose Glicose 0.0 1. aquecer em banho maria fervente por 30 minutos. logo que adiciona o HCl. Anotar os resultados. lentamente. Continuar o aquecimento até que se forme uma solução opalescente em banho-maria. sob constante agitação 4. durante 1 a 2 minutos. Utilizar esta solução para as experiências subsequentes C. Observar. obtém-se resultado semelhante empregando-se HCl concentrado.2. de cadeias de glicose de tamanhos variáveis.5 mL para outro tubo de ensaio.0 1. fervente 5. Fisiologicamente. 1 mL da solução e transferir 0.1 M Sacarose 0.5 mL para um tubo e 0. obtido em A. Resfriar.0 1. e no outro adicionar 1 mL do reativo de Benedict e aquecer em banho maria fervente.6 3. e no final do processo obtém-se uma mistura de glicose e maltose. Sendo que deve retirar. Hidrolise ácida do amido A estrutura polimérica do amido pode ser desfeita por hidrólise das suas ligações glicosídicas.0 Lugol (iodo 5% em KI 10%) gotas 2 2 2 2 2 2 Resultado Aquecer em banho de água fervente. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada fria ao deposito de amido. Durante a hidrólise do amido são formados compostos intermediários. Procedimento experimental: Transferir 25 mL de amido para um elenmyer e adicionar 1 mL de HCl concentrado. Adicionar esta última suspensão à água em ebulição. Repetir o processo em intervalos de 5 a 5 minutos. à quente. usando sempre o tubo 1 (controle) como referência. o amido é hidrolisado enzimaticamente pela amilase salivar e pela amilase pancreática. observar a coloração. D.0 1. Detecção do amido – reação com Lugol Tubos 1 2 3 4 5 6 Amostras Água Amido obtido em B Maltose 0.1 M Quantidades mL 1. Observar novamente. Quimicamente.0 1. observar a coloração. Amido amido solúvel + maltose Eritrodextrina + maltose Acrodextrina + maltose .

Esse óleo será utilizado como material para as provas seguintes.Acetona Agitar vigorosamente e verificar: a) b) c) d) Insolubilidade no 1º e 2º tubos Emulsão estável nº 3 e 4 Solubilidade parcial no tubo nº 5 que se torna total pelo aquecimento Solubilidade total no demais tubos. Caracterização 1. Extração • Em copo de 100 mL pesar 10 g de soja moída e seca • Adicionar 25 mL de álcool • Agitar por 5 minutos • Filtrar através de papel de filtro.Éter Sulfúrico 7º.HCl a 4% 3º.Clorofórmio 8º. para um béquer • Lavar o resíduo com 10 mL de álcool por duas vezes • Evaporar o filtrado em banho de areia.Benzeno 9º.Etanol 6º.M altose Glicose EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS I.NaOH a 10% 5º. . Extração de lipídeos de semente se soja Procedimento experimental a. Juntar mais 20 gotas de óleo nos tubos contendo: • Éter • Clorofórmio • Benzeno • Acetona Observar a grande solubilidade do óleo nesses solventes. com agitação constante até diminuição total do álcool • Observar o resíduo amarelo e oleoso.Na2CO3 a 2% 4º. colocar 3 gotas de óleo vegetal em cada um e adicionar 3 mL de: 1º. b. Solubilidade Em uma bateria de 9 tubos de ensaio numerados.Água 2º.

várias técnicas neste sentido foram desenvolvidas. aonde a glicose reage diretamente com certas substâncias orgânicas. os métodos enzimáticos foram surgindo e colocados em prática. REATIVOS A – Reativo cromogênico Num frasco de 2. exatamente.05 mL Reativo cromogênico 2. A temperatura ambiente.05mL Soro 0. presentes na amostra. em meio alcalino. Estável por um ano. Procedimento a.000 mL.000 mL. Misturar até completa dissolução e guardar em frasco escuro.I – DOSAGEM DE GLICOSE Vários métodos foram propostos para a determinação de glicose. urina. Como exemplo. produzindo uma mistura.5 mL Misturar e colocar os tubos. Posteriormente. fotometricamente. Outros métodos. ambos. o que determina a falta de especificidade para a análise em questão. AMOSTRA Soro. A intensidade da cor é medida. .05 mL Padrão 0. colocar 1 g de tiouréia. foram desenvolvidos. em 630 nm.5 mL 2. era utilizado o seu poder redutor.5 mL 2. em equilíbrio. B – Solução padrão de glicose Pesar. estes métodos sofrem interferências de outros agentes redutores. plasma. por 24 meses. O soro deve ser colhido em jejum e livre de hemólise. podemos citar o método de glicose-oxidase e o método da hexoquinase. é estável por 12 meses e. a ortotoluidina é a mais utilizada. Os oxidantes mais empregados foram os íons cobre e os íons ferricianeto. Esfriar em água corrente por 2 a 3 minutos e ler as absorvâncias. quando conservada em geladeira. No início. a quente e em presença de ácido acético glacial. líquor e outras. em banho fervente. 1 – MÉTODO DA ORTOTOLUIDINA A glicose reage especificamente com a ortotoluidina. Tomar 3 tubos. 1 g de glicose e dissolver em 800 mL de água destilada. durante 10 minutos. em geladeira. acrescentar 940 mL de ácido acético glacial e 60 mL de ortotoluidina. Adicionar 1 g de ácido benzóico e diluir com água destilada até completar 1. uma glicosilamina e a correspondente base de Schiff. Naturalmente. Destas substâncias. e proceder como a seguir: Branco Amostra Padrão Água destilada 0.

manose também. efetuar novamente as leituras e calcular. A absorbância desta solução frente a um branco de ácido acético não deve ser superior a 0.25 g/24 horas. em concentrações inferiores a 0. A hemoglobina até 350 mg/dl e a bilirrubina até 20 mg/dl não interferem no método sem desproteinização. A adição de tiouréia como antioxidante confere ao reativo uma cor ligeiramente amarelada. A reação segue a lei de Beer até 1. É importante o uso de ortotoluidina. c. presentes em casos de gravidez e durante a lactação ou em casos raros de galactosemia infantil. Somente os métodos do ortotoluidina e da hexoquinase fornecem resultados exatos para a glicose urinária. Quando os valores forem maiores que 300 mg/dl. b. d. até 1. pode provocar turvação.2 g/dl. multiplicando o resultado final pelo fator de diluição. O resfriamento. .015 e. É recomendaável não desproteinizar com ácido perclórico.500 mg/dl. a mais incolor possível. f. A urina e o líquor podem seguir a metodologia direta para o soro ou plasma. A lactose e a galactose. em água muita fria. VALORES DE REFERÊNCIA Soro e plasma – 70 a 110 mg/dL Sangue total – 60 a 100 mg/dL Líquor – 40 a 70 mg/dL Urina – até 30 mg/dL ou até 0.500 mg/dl.CÁLCULO Glicose (mg/dL) + Absorvância da amostra / Absorvância do padrão x 100 NOTAS a. podem reagir com a ortotoluidina. diluir a solução final com reativo de cor. Quantidades maiores dão erros positivos. g.

Princípio A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose de acordo com a seguinte reação: GOD Glicose + O2 + H2O Ácido Glucônico + H2O2 H2O2 formado reage com 4-aminoantipirina e fenol. Nas 24 horas que sucedem à ingestão aguda de álcool. Tampão fosfato – pH 7. Após o manuseio armazenar. através de uma reação oxidativa formando um antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra. entre 2 – 8 ºC. POD 2H2O2 + 4 – Aminoantipirina + fenol REAGENTES Enzimas – conservar entre 2 – 8 ºC Tampão – Conservar entre 2 – 8 ºC. sob ação catalisadora da peroxidase. Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da glicólise. As amostras de sangue não contendo um antiglicolítico. Somente para uso diagnóstico in vitro.4 Padrão – 100 mg/dl – Estável entre 15 – 25 ºC.2 – GLICOSE ENZIMÁTICA Finalidade Sistema enzimático para a determinação de Glicose no sangue. devem ser centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma Antipirilquinonimina + 4H2O . INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS Ácido ascórbico em concentrações acima de 100 mg/L interferem na reação diminuindo os resultados. As reduções podem também ser significativas nos indivíduos submetidos a jejum prolongado ou em obesos tratados com dieta com baixo valor calórico. pleural e senovial em método cinético. líquor e líquidos ascíticos. ocorre significativa redução na glicemia. AMOSTRA A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo 8 horas ou de acordo com recomendação médica. para evitar evaporação. bem vedado. Usar plasma ou soro tomando as precauções a seguir.

0 mL Teste 0. Nas amostras com antiglicolítico. hipoglicemia do diabético tipo II e do paciente com intolerância à glicose. CÁLCULOS Glicose (mg/dL) = Absorvância do teste x 100 / Absorvância do padrão LINEARIDADE A reação é linear até 400 mg/dl. A concentração de glicose no líquor representa um dos parâmetros para a distinção entre meningite bacteriana e virótica. hipoadrenocorticismo. insuficiência supra-renal e/ou hipofisária. Hemoglobina até 160 mg/dL e Triglicérides até 750 mg/dL não produzem interferências significativas. quando não ocorre contaminação bacteriana. . etc). A redução da concentração de glicose nos líquidos corporais encontra-se relacionada a processos inflamatórios ou infecciosos. A hipoglicemia pós-prandial é classificada em hipoglicemia alimentar.ou soro. Causas mais comuns de hipoglicemia do jejum: hiperinsulinismo.02 mL 2. doença hepática grave e alcoolismo. Quando a ocorrência de sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação. duas formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e pós-prandial. hiperpituitarismo.0 mL Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 ºC durante 15 minutos. INTERFERÊNCIAS Bilirrubina até 16 mg/dL. PROCEDIMENTO Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Padrão Reagente de cor Branco 2. pleural e senovial.85%). VALORES DE REFERÊNCIA Plasma: 70 a 110 mg/dL Líquor: 2/3 da glicemia – em amostras colhidas simultaneamente. O mesmo procedimento deve ser realizado na colheita de líquor e líquidos ascítico. nos estados de intolerância à glicose e nas diabetes secundárias a várias doenças (hipertiroidismo.0 mL Padrão 0.02 mL 2. soro e outros líquidos separados das células. Determinar as absorvâncias do teste e padrão em 505 nm. dosar novamente e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. síndrome auto-imune (formação espontânea de anticorpos para receptores da insulina). a glicose permanece estável por 3 dias entre 2 – 8 ºC. No plasma. a concentração da glicose permanece estável por até 24 horas. separados das células ou coágulo. A cor é estável por 60 minutos. tumores extrapancreáticos. SIGNIFICADO CLÍNICO Valores elevados ocorrem nos vários tipos de diabetes primárias. Diluir a amostra com NaCl mol/L (0. Valores diminuídos ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a várias causas.

2 H2O2 + 4 aminoantipirina + p-hidroxibenzoato peroxidase 4 .antipirilquinonimina + 4 H2O Amostra Soro ou plasma isentos de hemólise (anticoagulante . colesterol livre + O2 col.0 mL 2. COLESTEROL Principio O colesterol no soro é quantificado através das seguintes reações enzimáticas: 1.O uso de anticoagulantes como: citrato. que interferem nos métodos utilizando a reação GOD-POD levando a resultados falsamente diminuídos.0 mL 20 µL - Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. se mantida a 10ºC conserva-se por 3 meses.OBSERVAÇÕES • • • A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos A água utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade A urina contém numerosas substâncias. absorvancia do teste ---------------------------. EDTA e Oxalato. esterase col. retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotômetro em 510 nm zerando o aparelho com o branco. na população brasileira. T (teste) e P (padrao) B T Reagente de cor 2.0 mL Solução padrão Amostra 20 µL P 2.x 200 absorvancia do padrao . Procedimento Identificar três tubos com B (branco). Amostra quando refrigerada de 2 a 8ºC se conserva por 7 dias. em ambos os sexos. principalmente o ácido úrico.heparina). ésteres de colesterol 2. Calculo Colesterol (mg/dL) = Valores de referencia Em termos estatísticos. esterase colesterol livres mais ácidos graxos colesterona + H2O2 3. os níveis de colesterol situam-se na faixa de 150 – 240 mg/dL. provocam resultados ligeiramente diminuídos. Jejum de 12 a 16 h.

01 mL Padrão Reagente de cor 1.Desejável Risco moderado Alto risco (DCI) Colesterol (mg/dL) < 200 200 – 239 > 240 TRIGLICERIDES Principio Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintes reações: Triglicéride lípase da lipoproteína glicerolquinase Mg+2 glicerol + acido graxo glicerol . Soro. Procedimento Tomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir Branco Teste Amostra 0.8ºC.x 200 absorvancia do padrao Valores de referencia Desejável Limiar alto Triglicérides < 200 200 – 400 .01 mL 1.0 mL 1.0 mL Padrão 0. O armazenamento prolongado da amostra não e recomendado porque varias substancias podem ser hidrolisadas liberando glicerol. levando a obtenção de resultados falsamente elevados.3 . Efetuar as leituras das absorvancias do padrão e do teste em espectrofotômetro em 540 nm.fosfato + ADP Glicerol + ATP Glicerol .0 mL Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. O nível da água do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio.fosfato + O2 glicerol-3-fosfato dihidroxiacetona + H2O2 oxidase 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + ESPAS peroxidase quinoneimina + 4 H2O Amostra A amostra deve ser obtida após jejum de 12 a 14 h. O analito e estável por 2 . Calculo Triglicérides (mg/dL) = absorvancia do teste ---------------------------.3 .

Em três tubos de fotocolorimetros marcados B (branco). Após centrifugar. . Vide limitações do procedimento. Pela diferença obtida entre o colesterol total e o determinado no sobrenadante.COLESTEROL Fundamento As lipoproteínas de baixa densidade (LDL ou β-lipoproteínas) separam do soro. P (padrão) e D (desconhecido). o colesterol ligado às mesmas determina-se utilizando o sistema enzimático Colesterol oxidase/peroxidase com colorimetria segundo Trinder (Fenol/4-AF). Ler em espectofotometro a 505 nm. Amostra Soro a) Coleta: o paciente deve estar em jejum (de 12 a 16 h) b) Aditivos: não são necessários c) Substâncias interferentes conhecidas: os soros hipertrigliceridemicos (com quilomicrons) produzem sobrenadantes turvos. Separar rapidamente o sobrenadante. Utilizar o sobrenadante como amostra para o ensaio colorimetrico. no sobrenadante fica o resto de lipoproteínas (HDL e VDL). a bilirrubina interfere nos níveis maiores de 50 mg/L Procedimento Em um tubo de Kahn. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. colocar: Amostra 200 µL Reagente precipitante 100 µL Homogeneizar agitando (sem inverter) durante 20 segundos e deixar 15 minutos no banho Maria a 20-25ºC.Elevado Muito elevado 400 – 1000 > 1000 LDL . colocar: B P D Sobrenadante 100 µL Padrão 20 µL Reagente de 2 mL 2 mL 2 mL trabalho Misturar e incubar 5 minutos a 37ºC quando seja utilizado o reagente de trabalho de Colestat enzimático AA/liquida ou 15 minutos a 37ºC quando seja utilizado aquele de Colestat enzimático. pecipitando-as seletivamente pela adição de polímeros de alto peso molecular. Tirar do banho Maria e esfriar. obtém se o colesterol ligado as LDL.

Calculo do resultado LDL colesterol (g/l) = colesterol total (*) – (D x f) f = 0. Valores esperados Risco baixo ou nenhum (pessoas normais): menores de 140 mg/dL Risco moderado (pessoas com probabilidade de contrair ECC): entre 140 e 190 mg/dL Risco elevado (pessoas suspeitas de ter ECC): acima de 190 mg/dL .624 P (*) valor obtido com Colestat enzimático ou Colestat enzimático AA liquida.

Amostra Soro. Calculo Absorvancia do teste Colesterol HDL (mg/dL) = ---------------------------. O teor de colesterol da fração HDL e determinado pelo sistema enzimático colesterol 250 Dolis/colesterol enzimático liquido Dolis.159 45 . Procedimento Identificar três tubos com B (branco). retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em espectrofotômetro em 510 nm. No sobrenadante.0 mL 2. zerando o aparelho com o branco.x 50 x 2 Absorvancia do padrao Valores de referencia Col.HDL COLESTEROL Principio Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e muita baixa densidade (VLDL).0 mL 50 µL - Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. sob refrigeração de 2-8ºC.65 35 – 55 Alto risco > 160 < 45 < 35 .20ºC. o sobrenadante. resta apenas a fração de alta densidade HDL.0 mL Solução padrão Sobrenadante 50 µL P 2. o paciente deve estar em jejum obrigatório de 12 h. Após a precipitação. Estável por 4 dias. T (teste) e P (padrao) B T Reagente de cor 2. HDL fem (mg/dl) Col. são precipitadas seletivamente por polietilenoglicol tamponado. LDL(mg/dl) Col. permanece estável por 15 dias se mantido a . HDL masc (mg/dl) desejável < 130 > 65 > 55 risco moderado 130 .

Calculo Ácido úrico (mg/dL) = absorvancia do teste ---------------------------.5 a 6.5 a 7. O nível da água do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio.ÁCIDO ÚRICO Principio O ácido úrico e determinado de acordo com as seguintes reacões: Ácido úrico + O2 + H2O uricase alantoina + CO2 +H2O2 peroxidase antipirilquinonimina + 4 H2O 2 H2O2 + DHBS + 4 – aminoantipirina Amostra Usar soro. O analto e estável por 3 dias entre 2 – 8ºC e por 6 meses a –10ºC.02 mL 1. úrina e líquidos (aminiotico e sinovial).0 1. Procedimento Tomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir : Branco Teste Amostra 0.0 250 a 750 por 24 h .x 6 absorvancia do padrao Valores de referencia Soro: homens Soro: mulheres Urina Acido úrico (mg/dl) 2. Efetuar as leituras das absorvancias de padrão e do teste em espectrofotômetro em 520 nm.0 mL 1.0 mL Padrão 0.0 mL Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC.02 mL Padrão Reagente de trabalho 1.

onde: Cp = concentração do padrão Ct = concentração do teste Ap = absorbância do padrão At = absorbância do teste Valores de referencia Soro Plasma Proteínas totais 6.3 g/dL . Amostra Soro ou plasma (heparinizados).0 a 8. Calculo O calculo pode ser efetuado através do Fator de Calibração. zerando o aparelho com o branco em 545 nm. cuja absorbância medida em 545 nm e diretamente proporcional a concentração de proteína na amostra. Procedimento Pipetar em tubos de ensaio identificados: Tubos Branco Água destilada 20 µL Amostra Padrão Biureto 1000 µL Teste 20 µL 1000 µL Padrão 20 µL 1000 µL Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.8 a 8. O analito e estável por 8 dias entre 2-8ºC.PP Fundamento As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com íons cúpricos em meio alcalino (reagente do biureto). Ler absorbância do padrão e do teste. Fc = Cp ------Ap Ct = Fc x At.PROTEINAS TOTAIS . formando um complexo de coloração violeta.0 g/dL 6.

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