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Quim. Nova, Vol. XY, No.

00, 1-4, 200_

Elionai Cassiana de Lima Gomes e Armando da Silva Cunha Jnior* Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antnio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte - MG, Brasil Maria Irene Yoshida Departamento de Qumica, Instituto de Cincias Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antnio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte - MG, Brasil Rodrigo Jorge Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900 Ribeiro Preto SP, Brasil Recebido em 2/5/11; aceito em 25/8/11; publicado na web em 30/9/11

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD FOR QUANTITATION OF THE DRUG BEVACIZUMAB BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. In this study an analytical method has been developed and validated for the quantitation of the drug bevacizumab (Avastin) by high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC column was a BioSuite 250 HR SEC, 300 x 7.8 mm x 5 m (Waters, EUA). The mobile phase was consisted by phosphate buffered saline (PBS). The results revealed that the method was specific, precise, accurate, robust and linear (r2 = 0.998) from 5 to 75 g mL-1. Therefore, it can be used in drug release studies or in quality control ampoules of the drug. Keywords: bevacizumab; high performance liquid chromatography; validation.

INTRODUO O bevacizumabe (Avastin) um anticorpo monoclonal humanizado, produzido por tecnologia de DNA recombinante em um sistema de expresso em clula de mamfero, de ovrio de hamster chins, em um meio nutriente contendo o antibitico gentamicina e purificado por um processo que inclui a inativao viral especfica e etapas de remoo. Esse anticorpo constitudo por 214 aminocidos e tem massa molecular de aproximadamente 149 kDa. O bevacizumabe foi aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) em fevereiro de 2004 e em janeiro de 2005 pela EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) para uso no tratamento de cncer colorretal. O mecanismo de ao do bevacizumabe baseia-se na sua ligao ao fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF, vascular endothelial growth factor, um dos principais agentes que estimulam a formao de novos vasos), inibindo desta forma a ligao do VEGF aos seus receptores na superfcie das clulas endoteliais. A neutralizao da atividade biolgica do VEGF diminui a vascularizao, o que, no caso de tumores, causa a diminuio ou supresso do crescimento.1 Devido ao seu efeito inibidor da angiognese, o frmaco vem sendo utilizado no s no tratamento de diversos tipos de cncer, mas tambm em doenas oculares decorrentes da angiognese excessiva, tais como a Retinopatia Diabtica Proliferativa e a Degenerao Macular Relacionada Idade.2 Seu uso off-label em tais doenas j prtica comum dentro dos consultrios de oftalmologia em diversos pases, inclusive o Brasil. Como necessria a aplicao diretamente no local de ao, o frmaco administrado no interior do bulbo do olho por meio de injees intravtreas.1 So requeridos entre 150 e 300 L do medicamento em cada injeo, o que torna prtica comum pelos mdicos o fracionamento da ampola de Avastin, j que a mesma contm originalmente 4 mL do medicamento. Assim, fundamental o desenvolvimento de um mtodo analtico seletivo e de alta sensibilidade que permita a quantificao do frmaco para avaliar a qualidade dos produtos fracionados e, tambm, possibilitar
*e-mail: armando@ufmg.br

o desenvolvimento de novos sistemas de administrao. A maioria dos trabalhos descritos na literatura utilizam ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) para a quantificao do bevacizumabe, uma tcnica cara e de difcil aplicao em rotina analtica.3-8 Poucos so os trabalhos que utilizam CLAE para a quantificao do frmaco e, quando o fazem, no h informaes claras em relao ao desenvolvimento do mtodo.9,10 O presente trabalho teve por objetivo o desenvolvimento e a validao de mtodo analtico para doseamento do frmaco utilizando cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), uma tcnica mais simples e mais econmica. Foi escolhida a cromatografia por excluso de tamanho, uma vez que as tcnicas mais utilizadas em CLAE (cromatografia em fase normal e reversa) utilizam solventes orgnicos para ajuste da polaridade da fase mvel, como acetonitrila e metanol, o que causaria a desnaturao do frmaco. A validao foi realizada de acordo com a Resoluo n 899/2003 da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA).11 PARTE EXPERIMENTAL Material e equipamentos Foram utilizados os seguintes compostos: Avastin (25 mg/mL, ampola de 4 mL); gua purificada obtida em sistema Milli-Q para uso em CLAE; fosfato de potssio monobsico anidro; fosfato de sdio monobsico anidro; fosfato de sdio dibsico anidro; fosfato de sdio dibsico hepta-hidratado; cloreto de sdio; D-(+)-trealose; Tween 20. Para as anlises foram utilizados: espectrofotmetro Hewlett Packard HP 8453; cromatgrafo Waters (bomba Waters 515 e autoinjetor Waters 717) acoplado a detector Waters 486 UV-VIS; coluna Waters - BioSuite 250, 5 m, HR SEC (7,8 x 300 mm). Mtodo Desenvolvimento do mtodo analtico Primeiramente foi realizada uma varredura do frmaco na regio

Nota Tcnica

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE MTODO ANALTICO PARA QUANTIFICAO DO FRMACO BEVACIZUMABE POR CROMATOGRAFIA A LQUIDO DE ALTA EFICINCIA

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do ultravioleta em espectrofotmetro HP 8453. Uma amostra de bevacizumabe foi diluda em soluo salina tamponada pH 7,4 at uma concentrao final de 25 g/mL, sendo a varredura programada em uma faixa entre 200 a 400 nm, com o objetivo de se determinar o comprimento de absorvncia mxima do frmaco. Foram testadas duas solues como fases mveis. A primeira, constituda de tampo fosfato de sdio pH 7,4, foi preparada com 1,2 g de fosfato de sdio monobsico anidro e 13,4 g de fosfato de sdio dibsico hepta-hidratado, diludos em gua purificada at um volume final de 1000 mL. O pH final foi ajustado com fosfato de sdio monobsico anidro. A segunda soluo testada como fase mvel, soluo salina tamponada pH 7,4, foi preparada com 2,38 g de fosfato de sdio dibsico anidro, 0,19 g de fosfato de potssio monobsico anidro e 8,00 g de cloreto de sdio, diludos em gua purificada at um volume final de 1000 mL. O pH final foi ajustado com fosfato de potssio monobsico anidro. Com o objetivo de reduo de custo e de tempo de anlise, foram avaliados trs diferentes fluxos para a fase mvel (0,5; 0,8 e 1,0 mL/min). Validao do mtodo analtico Todo mtodo desenvolvido e no descrito em farmacopeia ou formulrios oficiais deve ser validado, sendo avaliados os seguintes parmetros: especificidade, intervalo, linearidade, limite de deteco, limite de quantificao, preciso, exatido e robustez.11 Parmetros avaliados A especificidade do mtodo foi testada analisando-se uma amostra de soluo salina tamponada pH 7,4 contendo as substncias presentes na formulao do medicamento nas concentraes indicadas pelo fabricante: 60 mg/mL de D-(+)-trealose e 0,4 g/mL de Tween 20 (polissorbato 20 ou monolaurato de polioxietileno 20 sorbitano). A avaliao da linearidade foi realizada a partir da mdia de 3 curvas analticas obtidas em 3 dias consecutivos, nas concentraes de 5 (limite inferior do intervalo), 10, 25, 50 e 75 (limite superior do intervalo) g/mL de bevacizumabe. Para cada dia foi utilizado um lote diferente do medicamento, totalizando trs lotes de produo ao final dos trs dias de anlise. Todas as amostras foram diludas em soluo salina tamponada pH 7,4 at a concentrao final desejada, filtradas em membrana 0,45 m de poro (Durapore, Millipore) e injetadas em triplicata no cromatgrafo, registrando-se os valores das reas. Os resultados foram tratados estatisticamente pelo mtodo dos mnimos quadrados, obtendo-se a regresso linear. Ainda como resultado da avaliao da linearidade do mtodo, foram calculados os limites de deteco e de quantificao, por meio da diviso entre o desvio padro dos coeficientes lineares das trs curvas analticas do ensaio de linearidade pela mdia dos coeficientes angulares das curvas, multiplicados por 3,0 e 10,0, respectivamente.11 Para o estudo da robustez foram avaliadas a variao de fluxo (0,99 a 1,01 mL/min) e de pH da fase mvel (7,0 a 7,8). A preciso foi avaliada em dois nveis: preciso intracorrida (repetitividade) e preciso intercorridas (preciso intermediria). Para a repetitividade, cinco solues com concentraes diferentes (5, 10, 25, 50 e 75 g/mL) foram injetadas em triplicata, totalizando 15 determinaes, sendo o resultado da anlise expresso em termos de desvio padro relativo (DPR). A preciso intermediria foi avaliada do mesmo modo, porm as anlises foram realizadas em trs dias diferentes, totalizando 45 determinaes. A exatido foi definida preparando-se as amostras at a obteno de quatro concentraes utilizadas para a construo da curva analtica utilizada no teste de linearidade, considerando-se que o mtodo exato quando h proximidade dos resultados obtidos em relao ao

valor verdadeiro. Foi utilizada a concentrao declarada nas ampolas de Avastin como referncia. Alm disso, foi feita uma avaliao da estabilidade do frmaco. O bevacizumabe foi diludo em soluo salina tamponada pH 7,4 at uma concentrao final de 50 g/mL e a amostra foi colocada em incubadora mantida a 37 C por 7 dias. Em tempos pr-determinados, foram retiradas alquotas desta amostra, que foram analisadas por CLAE. RESULTADOS E DISCUSSO Desenvolvimento do mtodo analtico Os primeiros relatos da utilizao do Avastin (bevacizumabe) por meio de injeo intravtreo no tratamento de doenas da coroide e da retina datam de agosto de 2005.12,13 A partir dessa data, a utilizao intravtreo do medicamento se tornou uma prtica comum em vrios pases. Mas esse procedimento requer o fracionamento da ampola do Avastin, j que nessa via de administrao a dose requerida do frmaco entre 200 a 400 vezes menor que a utilizada por via sistmica. At o momento, apenas Bakri e colaboradores4 realizaram estudos de estabilidade com o Avastin. O mtodo de quantificao desenvolvido por esses autores, apesar de dispendioso e de difcil aplicao em rotina analtica, tem sido o mais adotado nos mais diferentes tipos de estudo empregando o bevacizumabe. De acordo com o espectro de varredura feito na regio do ultravioleta, o comprimento de onda de maior absoro do frmaco encontrado foi 279 nm e, portanto, esse foi o comprimento de onda selecionado para as anlises em CLAE. As fases mveis testadas foram compostas exclusivamente por tampo, uma vez que o uso de solventes orgnicos poderia desnaturar o frmaco. O primeiro tampo testado (tampo fosfato de sdio 0,1 M pH 7,4) no apresentou viabilidade para ser utilizado como fase mvel, pois apresentou uma alta absorvncia em 279 nm e no houve uma boa resoluo entre o pico referente ao tampo e o pico referente ao frmaco (Figura 1). Em seguida, foi testada soluo salina tamponada pH 7,4, que apresentou uma baixa absorvncia no comprimento de onda selecionado (Figura 1) e no interferiu no pico do frmaco. Dessa forma, esse tampo foi escolhido como fase mvel. Aps escolha do tampo a ser utilizado como fase mvel, foi feita a avaliao de diferentes fluxos de fase mvel (0,5; 0,8 e 1,0 mL/min).

Figura 1. Cromatogramas das fases mveis testadas: (a) tampo fosfato de sdio 0,1 M pH 7,4, mostrando o valor da rea do pico; (b) bevacizumabe (50 g/mL) diludo em tampo fosfato de sdio 0,1 M; (c) soluo salina tamponada pH 7,4, mostrando o valor da rea do pico

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Desenvolvimento e validao de mtodo analtico para quantificao do frmaco bevacizumabe

Foram considerados a simetria do pico e o tempo de reteno. No houve alterao na simetria dos picos quando o fluxo alterado. Dessa forma, o fluxo de 1,0 mL/min foi escolhido por proporcionar maior rapidez anlise, diminuindo o tempo de corrida de 28 (fluxo de 0,5 mL/min) para 15 min (1,0 mL/min). O tempo de reteno (tR) do frmaco foi reduzido de 14,98, referente ao fluxo de 0,5 mL/min, para 7,58 min, com fluxo de 1,0 mL/min (Figura 2).

Figura 3. Cromatograma da amostra de soluo salina tamponada pH 7,4 contendo 60 mg/mL de D-(+)-trealose e e 0,4 g/mL de Tween 20 (polissorbato 20)

Figura 2. Cromatograma do bevacizumabe (50 g/mL) em soluo salina tamponada pH 7,4 com fluxo de 1,0 mL/min

Por meio de anlise de varincia (ANOVA), verificou-se regresso linear significativa e desvio da linearidade no significativo (p<0,05). O coeficiente de determinao encontrado para a curva mdia foi de 0,9983, estando acima de 0,99, que o valor mnimo aceitvel pela RE 899/2003 da ANVISA (Tabela 1).
Tabela 1. Resultados do tratamento estatstico por anlise de varincia para a regresso linear Fonte de variao Total Regresso Desvios da regresso Erro puro Graus de liberdade 14 1 3 10 Estatstica de regresso e coeficientes R2 Inclinao Intercepto 0.9983 1536 -2161 Soma dos quadrados 2,432 x1010 2,428 x 10
10

O cromatograma obtido com o fluxo escolhido apresentou pico simtrico, com tempo de reteno curto, como demonstrado na Figura 2. Durante o estudo, o volume de injeo foi fixado em 20 L. Os parmetros cromatogrficos utilizados encontram-se no Quadro 1.
Quadro 1. Parmetros cromatogrficos utilizados para validao do mtodo analtico Parmetro Deteco Fluxo Coluna Temperatura Fase mvel Volume de injeo Tempo de corrida Condio UV (= 279 nm) 1,0 mL/min Slica,7,8 x 300 mm, tamanho de partcula 5 m 25 C Tampo PBS pH 7,4 20 L 15 min

Varincia 1,737 x 109 2,428 x 1010 6666667 2000000

12140,5* 3,33

20000000 20000000

* Valor significativo ( = 0,05)

Validao do mtodo analtico A seletividade ou especificidade foi o primeiro parmetro avaliado para a validao do mtodo analtico desenvolvido, uma vez que se a especificidade no for garantida, os outros parmetros podem ser comprometidos. O mtodo apresentou boa especificidade, pois no foram registrados picos no tempo de reteno do frmaco no cromatograma referente soluo salina tamponada pH 7,4 contendo D-(+)-trealose na concentrao de 60 mg/mL e 0,4g/mL de Tween (polissorbato) 20 (Figura 3). A linearidade de um mtodo demonstra que os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do frmaco na amostra, dentro de um intervalo especificado.14 Desse modo, o mtodo proposto apresentou linearidade para o intervalo de concentraes entre 5 a 75 g/mL, conforme equao da reta Y = 1536x 2161.

Com os dados provenientes da avaliao da linearidade foram calculados os limites de deteco e de quantificao. Os valores obtidos foram 1,11 e 3,71 g/mL, respectivamente. A robustez de um mtodo analtico mede sua suscetibilidade frente a pequenas variaes que podem ocorrer durante as anlises de rotina.15 O mtodo se mostrou robusto para variaes de fluxo no intervalo proposto (0,99 a 1,01 mL/min). Porm, para as variaes de pH, no intervalo testado (7,0 a 7,8), verificou-se que h diferena estatisticamente significativa nos valores de rea obtidos em pH 7,0 quando comparados aos obtidos em pH 7,4 ou 7,8. Em relao aos dois ltimos, no houve diferena estatisticamente significativa entre as reas obtidas (p<0,05). Os resultados esto descritos nas Tabelas 2 e 3. Sendo assim, recomenda-se o controle do pH para a utilizao deste mtodo, visto que pode haver erros nos resultados se o valor de pH no for mantido constante durante o estudo.

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Tabela 2. Robustez com relao variao do fluxo. Mdias com letras iguais so estatisticamente semelhantes a 5% Fluxo (mL/min) 0,99 1,00 1,01 Concentrao (g/mL) 1 46,3 48,2 47,6 2 48,2 47,8 47,2 3 48,0 47,8 46,4 4 47,7 48,6 50,0 5 47,5 45,5 47,2 Mdia 47,5 a 47,6 a 47,7
a

CONCLUSO O mtodo analtico proposto para deteco e quantificao do bevacizumabe por CLAE mostrou-se sensvel, preciso e linear no intervalo de concentrao entre 5 e 75 g/mL, sendo adequado para o controle de qualidade do medicamento ou estudos de desenvolvimento de sistemas de liberao farmacutica com esse peptdeo. A estabilidade do frmaco em soluo salina tamponada pH 7,4 limitada, porm suficiente para a realizao de anlises normalmente conduzidas em rotina analtica. AGRADECIMENTOS CAPES, pelo apoio financeiro. REFERNCIAS
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CV 1,57% 2,54% 2,87%

Tabela 3. Robustez com relao variao do pH. Mdias seguidas de letras distintas diferem entre si estatisticamente pelo teste t de Student a 5% pH 7,0 7,4 7,8 Concentrao (g/mL) 1 38,0 49,8 51,4 2 35,9 46,4 50,4 3 36,8 48,6 50,2 4 37,8 49,0 51,0 5 36,5 50,7 49,6 Mdia 37,0 a 48,9 b 50,5
b

CV 2,39% 3,29% 1,39%

Os resultados da repetibilidade e da preciso intermediria foram expressos em termos de desvio padro relativo (DPR) (Tabela 4). Todos os valores de DPR obtidos, tanto para a preciso intracorrida quanto para a preciso intercorridas, encontram-se abaixo de 5%, estando de acordo com o que preconiza a RE 899/2003 da ANVISA, o que evidencia repetibilidade e preciso intermediria adequadas para o mtodo analtico em questo.
Tabela 4. Valores de desvio padro relativo da avaliao da repetibilidade e da preciso intermediria do mtodo analtico Concentrao (g/mL) 5 10 25 50 75 DPR (%) Dia 1 4,56 4,87 1,11 1,81 0,91 Dia 2 1,27 1,27 1,60 0,59 0,53 Dia 3 1,91 2,91 0,65 1,72 0,44 Interdias 3,59 3,38 2,75 2,21 1,99

No que diz respeito exatido, o mtodo permitiu a recuperao de 99,66 2,37% para a concentrao de 5 g/mL; 101,39 4,13% para 10 g/mL; 101,95 2,07% para 50 g/mL e 99,79 2,17% para 75 g/mL, o que caracteriza o mtodo como exato. Por meio do estudo de estabilidade, verificou-se que a concentrao de bevacizumabe atinge 94% da concentrao inicial em 7 dias, em soluo salina tamponada pH 7,4 e temperatura de 37 C. A estabilidade do medicamento satisfatria, uma vez que o estudo de estabilidade foi conduzido em condies mais drsticas do que as condies em que o mesmo armazenado (entre 2 e 6 C).