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Universidad Austral de Chile Facultad de Medicina Instituto de Microbiologa Clnica

Viable but Nonculturable Vibrio cholerae O1 in the Aquatic Environment of Argentina

BINSZTEIN, N. y col. Applied and Environmental Microbiology, Dec.2004, p. 70: 7481-7486.

INTEGRANTES: Pablo Altamirano Felipe Araya Luis Celis Johana Corts Daniela Espinoza

MCLI 210 Tecnologa Mdica INTRODUCCIN La familia Vibrionaceae posee ms de 48 especies, y su taxonoma est en constante revisin gracias a la incorporacin de tcnicas de biologa molecular. La especie Vibrio cholerae, se ha caracterizado por ser responsable de brotes de gran magnitud con alta letalidad en pases desarrollados. Es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, no esporulado y oxidasa positivo. La mayora de las cepas patognicas poseen en su membrana externa un antgeno denominado O, en la porcin externa del lipopolisacrido (LPS), del tipo O1 u O139. Mientras que las cepas ambientales no patognicas de esta bacteria presentan otros tipos de antgeno O y por eso se categorizan como no-O1, no-O139. La transmisin de V. cholerae se produce a travs del consumo de alimentos de origen marino, especialmente mariscos bivalvos crudos. Vibrio cholerae reside en aguas marinas y continentales, encontrando condiciones favorables en aguas con niveles moderados de salinidad, alto contenido de nutrientes, temperaturas clidas, pH neutro o ligeramente alcalino, presencia de macrfitas acuticas, plancton, peces, moluscos y tambin es capaz de residir en agua dulce si encuentra sustratos orgnicos o inorgnicos que favorezcan su supervivencia. Es capaz de sobrevivir durante largos perodos en las aguas de estuarios y aguas saladas frente a condiciones ambientales extremas, desarrollando un estado latente que ha sido designado como viable pero no cultivable (VNC), ya que el organismo no puede ser recuperado mediante el uso de medios de cultivo tradicionales. Se postula que en este estado Vibrio cholerae sobrevive para en usarlos el medio como ambiente durante Estudios perodos recientes interepidmicos. En perodos de stress, estas formas VNC se adhieren a organismos reservorios. demostraron que algunos artrpodos (crustceos e insectos) constituyen

el grupo ms importante de invertebrados que ocupa esta funcin. Adems, la interaccin con el plancton parece jugar un papel importante en la ecologa del microorganismo y para facilitar la persistencia, sobre todo en respuesta a las bajas temperaturas y la reduccin de las concentraciones de nutrientes. Vibrio cholerae es el agente etiolgico del Clera, enfermedad intestinal aguda grave, de notificacin obligatoria inmediata, segn reglamento sobre notificacin de enfermedades transmisibles de declaracin obligatoria N 712. En el continente americano se registraron entre 1991 y 2004 alrededor de 1,2 millones de casos de clera con 12.000 muertes, que correspondieron a la sptima pandemia, demostrando el riesgo de mortalidad que existe durante los brotes epidmicos. En Argentina, han habido siete epidemias desde 1992, causadas por Vibrio cholerae biotipo O1 el Tor, los que se produjeron principalmente durante los meses de verano y las cepas de Vibrio cholerae O1 fueron aisladas de muestras de agua recogidas de los ros durante los perodos de epidemia. Sin embargo, el microorganismo no se pudo recuperar del medio ambiente durante perodos interepidmicos. En Argentina, Vibrio cholerae no-O1 fue aislado de muestras tomadas en el Ro de la Plata, donde la estacionalidad de los brotes se asoci a cambios de temperatura y floraciones de plancton, lo que sugiri que hay reservorios ambientales de Vibrio cholera. Estudios recientes de la diversidad gentica de Vibrio cholerae O1 donde se analiz la produccin de toxina colrica (TC) por algunas cepas, se encontr que un clon de la cepa epidmica de Amrica Latina estaba relacionada con una nueva variante (que no produca TC), aislada en un brote en Tucumn. Lo que sugiri que no se produjeron nuevos linajes en esta regin, sino que las cepas pertenecientes a los dos clones estaban presentes en el medio ambiente y reaparecieron espordicamente como

agentes cultivables patgenos, en respuesta a condiciones ambientales favorables. Los objetivos de esta revisin bibliogrfica se fundamentan en el desarrollo de un estudio donde se determina el reservorio ambiental de Vibrio cholerae O1 en Argentina y donde se evala la asociacin de este patgeno con las especies de plancton. Por ltimo se dar a conocer la situacin actual de Vibrio cholerae en Chile y el mundo, mostrando las implicancias epidemiolgicas de este patgeno.

MATERIALES Y MTODOS Lugares de recoleccin de muestras Se recolectaron muestras de cinco sitios. Uno de los sitios estaba ubicado en una estacin fija en la plataforma continental Argentina y los otros cuatro sitios fueron localizados a lo largo de un transecto en la frontera entre el Ro de la Plata y su estuario. Entre febrero de 1999 y mayo de 2000, se efectuaron seis viajes a la estacin de muestreo en la plataforma marina Argentina y seis viajes por el estuario del Ro de la Plata para la toma de muestras. La toma de muestras y procesamiento. Las muestras de plancton se recogieron con redes de malla de 25 y 200 micras. Se tomaron 20 ml de muestra de plancton concentrado, de los cuales 10 ml se dividi en tres partes, y estas fueron colocados en tres frascos, los que adems contenan: Frasco 1: 0,025% de extracto de levadura y 0,002% de cido nalidxico, se incub durante 6 a 12 horas a 35 C y se fij con formaldehdo al 3% para el anlisis de la inmunofluorescencia directa (DFA por sus siglas en ingls) y recuento directo de viables (DVC). Frasco 2: Formaldehdo al 4% para la identificacin de las especies de zooplancton y fitoplancton. Frasco 3: Se mantuvo a -20 C para el anlisis de PCR. Los restantes 10 ml de la muestra de plancton se enriquecieron con caldo peptona alcalina para el aislamiento de Vibrio cholerae por los Las muestras de agua fueron recogidas en botellas estriles de 5 litros y se filtraron a travs de membranas con poros de 0,22 micras. Luego, las membranas fueron lavadas con 4 ml de tampn mtodos de cultivo convencionales.

fosfato, y el buffer se fraccion para el anlisis por DFA-DVC, PCR y cultivo directo. Parmetros fsicos y qumicos (temperatura y salinidad) se midieron in situ en todos los sitios en el momento del muestreo. DFA-DVC. La deteccin de Vibrio cholerae O1 VNC, se realiz mediante kits de anticuerpos de fluorescencia directa (New Horizons Diagnostics Corporation) y tcnica de conteo viable directo DFA-DVC. Posteriormente las muestras fueron incubadas en oscuridad a temperatura ambiente durante 6-8 horas en presencia de extracto de levadura y cido nalidxico. Bajo esas condiciones, el V. cholerae (VNC) pas de una forma cocoide a una forma ms elongada, la bacteria no se multiplic debido al efecto inhibitorio del cido nalidxico. Despus de la incubacin, las muestras se fijaron con formaldehdo al 4% y se tieron con isotiocianato de fluorescena conjugada con anticuerpos monoclonales anti-O1. Las preparaciones teidas se observaron utilizando un microscopio de epifluorescencia con una longitud de onda de 490 nm. Deteccin directa del gen de la toxina del clera (ctxA). Se us PCR para la deteccin de la regin que abarca los genes ctxB ctxA en muestras de agua y plancton. La muestra de agua y/o plancton se hierve durante 10 minutos y se centrifuga. El sobrenadante se utiliz como ADN molde. Para la primera ronda de PCR, los cebadores utilizados fueron 5'GTGGGAATGCTCCAAGATCAAATCG 3' (sentido) y 5'ATTGCGGCAATCGCATGAGGCGT 3' (antisentido). Para la segunda ronda de PCR, se us el cebador 5GATATGCAATCCTCAGGGTATCC 3 junto con el cebador sentido. La reaccin de amplificacin consisti en 5 min a 94 C y 30 ciclos de 1 min a 94 C, 1 min a 60 C y 2 min a 72 C. Extraccin de ADN.

Se extrajo ADN de las muestras de agua marina, de estuarios y de muestras de plancton. Se tom una alcuota de 1 ml de una muestra de plancton o agua, se homogeniz, se centrifug y se suspendi en tampn SET (20% sacarosa, 50 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 7,6). Despus del tratamiento con lisozima, proteinasa K, y sulfato de dodecil de amonio, se extrajo el ADN con bromuro de cetiltrimetilamonio y agua tridestilada. PCR. El ADN extrado de muestras de agua y el plancton se utiliz como molde para la deteccin de Vibrio cholerae. Por anlisis de amplificacin utilizando cebadores universales ARNr 16S se confirma la presencia de ADN bacteriano. Las muestras que arrojaron resultados positivos en el 16S ARNr de PCR fueron sometidos a otra reaccin de amplificacin con cebadores especficos para Vibrio cholerae. Se utiliz PCR mltiple para detectar los genes que codifican para los antgenos somticos O1 y O139 y las muestras positivas fueron analizadas para la presencia de los genes asociados con virulencia ctxA y tcpA. Factores de virulencia. Las cepas de Vibrio cholerae no-O1 viables cultivables, asociadas a genes de virulencia se detectaron por transferencia de hibridacin de colonias con sondas especficas (Southern blot). Las sondas, incluido el fragmento de ClaI pCVD628 para las secuencias de genes zot y ace , el fragmento EcoRI de pCVD27 para el gen ctxA , y el fragmento XbaI-ClaI de pBB241 para el gen zot. Las sondas se marcaron con digoxigenina por cebado aleatorio. El gen tcpA, fue detectado por el ensayo de PCR mltiple, que permite la identificacin de ambos biotipos El Tor (471 pb) y Clsico (617 pb) en secuencias tcpA. Los cebadores utilizados fueron 5'GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG '3 3' (tcpA1 El El Tor) Tor), y y 5 5' (tcpA2 alcohol fenolcloroformo-isoamlico, concentrado con isopropanol, y se suspendi en

CACGATAAGAAAACCGGTCAAGAG

'(tcpA3

Clsico)

5'

ACCAAATGCAACGCCGAATGGAG 3 '(tcpA4 clsico). Las condiciones de amplificacin fueron 5 min a 94 C, 30 ciclos de 1.5 min a 94 C, 1.5 min a 60 C, y 1.5 min a 72 C, y una extensin final de 10 min a 72 C.

Estadsticas. La relacin entre la presencia de Vibrio cholerae no-O1 viables cultivables o Vibrio cholerae O1 VNC y la temperatura y la salinidad, fue de tendencia lineal (p 0,05) estadsticamente significativo. La presencia de la variable dependiente Vibrio cholerae no-O1 cultivable se defini con dos categoras: positivas, para Vibrio cholerae no-O1, y fue aislado al menos una muestra de agua o plancton de un solo sitio, y negativos, cuando no se encontr Vibrio cholerae no-O1. Las mismas categoras se definieron para Vibrio cholerae O1 como variable dependiente. La variables independientes salinidad y temperatura se dividieron en tres categora: la salinidad, a menos de 10 g / ml, 10 a 25 g / ml, y ms de 25g/ml, y la temperatura, inferior a 15 C, 15 a 20 C, y ms de 20 C.

RESULTADOS Aislamiento de Vibrio cholerae Se obtuvieron 84 muestras de agua y plancton: 21 muestras obtenidas de la estacin marina. 63 muestras obtenidas del estuario de Ro de la Plata en los

meses ms clidos (entre Noviembre y Marzo). El Plancton fue dividido en: o o Microplancton (25-200 um). Incluye Fitoplancton y Protozooplancton. Mesoplancton (> 200 um). Incluye Zooplancton.

Se lograron aislar 97 cepas de V. cholerae no-O1, de las cuales ninguna present genes de virulencia asociados a V. cholerae O1. Adems, la tasa de aislamiento de V. cholerae no-O1 ascendi cuando aument la temperatura y disminuy cuando aumento la salinidad. Se pudo observar que hay una relacin entre el aislamiento de cepas de Vibrio cholerae no-O1 de agua, y del mesoplancton. acompaada por una muestra positiva de plancton. Vibrio cholerae Viable, pero no cultivable (VNC) A pesar de que cepas de Vibrio cholerae no-O1 fueron aisladas por cultivos convencionales, el DFA-DVC mostr la presencia de Vibrio cholerae O1 VNC, ya que despus de la incubacin con extracto de levadura y acido nalidxico se observaron bacterias en forma de barra. Esto indicara que una muestra de agua positiva para V. cholerae no-O1 va

Microfotografa fluorescente de V. cholerae O1 en microplancton

Microfotografa fluorescente de V. cholerae O1 en una muestra de agua

Microfotografa fluorescente de V. cholerae O1 en zooplancton

Los resultados del DFA-DVC fueron confirmados por PCR Heminested y PCR mltiple. Las reacciones de la amplificacin mostraron la presencia de: Genes codificantes de la toxina colrica (CT): ctxA y ctxB.:

PCR Heminested para la deteccin de ctxA y ctxB. Carril M, estndar de 100 pb; carril 1, control negativo; carriles 2,4,5,6,8,9, muestras negativas; carriles 3,7,10 y 11, muestras positivas; carril 12, control positivo (V. cholerae O1 cepa O425)

Genes especficos de V. cholerae O1:

PCR mltiple para la deteccin de genes especficos para O1 y O139. Carril M, estndar de 100 pb; carril 1, control negativo; carriles 2-5, muestras positivas; carril 6, control positivo de Vibrio cholerae O1; carril 7, control positivo de Vibrio cholerae O139

Genes codificantes del Pili tipo IV corregulador de la toxina

(TCP), como es el tcpA:

PCR mltiple para le deteccin de ctxA/tcpA. Carril M, estndar de 100 pb, carriles 1-8, muestras positivas; carril 9, control positivo de Vibrio cholerae O1 cepa O425; carril 10, control negativo

En relacin al nmero de muestras: a) 19 de 84 resultaron positivas con ambas pruebas (9 muestras de agua, 5 muestras de mesoplancton y 5 muestras de microplancton). b) 59 muestras fueron negativas al determinarlas con ambos mtodos. c) 6 muestras de distintos orgenes obtuvieron resultados positivos con la tincin de fluorescencia, pero negativas con la tcnica de PCR. Estas muestras fueron consideradas negativas (en la observacin fueron confundidas con la fluorescencia alta del fondo o contraste). En relacin a los lugares de la toma de muestras, Vibrio cholerae O1 VNC fue encontrado tanto en muestras de la estacin marina, como de las estaciones del estuario. En el estuario de Ro de la Plata, Vibrio cholerae O1 VNC fue identificado en muestras colectadas de 6 cruceros realizados en el verano, invierno y primavera. otoo. En el caso de la estacin marina las muestras fueron positivas para 5 de los 7 cruceros entre el verano y el Esto muestra que no hay una relacin significativa entre la presencia de V. cholerae O1 y la temperatura o la salinidad, adems, se puedo deducir que no hay una correlacin entre los tipos de muestra colectada en un sitio especfico (Por ejemplo: una muestra de microplancton positiva no fue frecuentemente acompaada por una muestra de agua o de mesoplancton positiva) Asociacin con plancton Zooplancton Varias especies de zooplancton fueron colectadas con una malla de aberturas 200 um: o Desde la estacin del estuario:

Acartia tonsa Diaptomus sp. Paracalanus crassirostris Paracalanus parvus

Desde la estacin marina: Corycaeus amazonicus Centropages furcatus Ctenocalanus vanus las especies de zooplancton fueron separadas,

Todas

identificadas y confirmadas individualmente su asociacin con V cholerae O1 por DFA-DVC Microplancton Para Vibrio cholerae VNC en microplancton se determin con las tcnicas de PCR y DFA-DVC. Para el microplancton, 1 muestra marina y 4 muestras del estuario fueron positivas para Vibrio cholerae VNC. Al microscopio ninguna de las especies de microplancton se le pudo observar llevando consigo V. cholerae. Las especies que presentaban mayor cantidad de muestras positivas fueron: o Estuario: Diatomeas Thalassionema nitzchioides Pleurosigma cf. normanii Thalassiosira sp. Coscinodiscus

Dinoflagelados

Ceraticum furca Noctiluca scintillans Prorocentrum scutellum Diplopelta asimtrica Protoperidinium.

Estacin marina Diatomeas Meunieria membrancea Cerataulina pelgica Leptocylindrus minimus Hemiaulus sinensis Thalassionema nitzschioides Guinardia flccida Protoperidinium

Vibrio cholerae VNC fue identificado en muestras de microplancton o o o o en la primavera y verano en las estaciones del estuario. en otoo en las estacin marina. verano, invierno y primavera de la estacin del estuario. otoo de la estacin marina.

Mientras que Vibrio cholerae VNC fue asociado con el zooplancton en

DISCUSIN Y CONCLUSIN Distintos reportes han logrado demostrar que existen reservorios medioambientales para Vibrio cholerae en diferentes reas geogrficas del mundo. Este fue el primer estudio donde se demostr que V. cholerae O1 VNC est presente en muestras aguas, tanto de estuarios como marinas, y plancton. Estudios previos sugirieron que V. cholerae estaba presente en el medio ambiente en asociacin con el plancton, adjunto a coppodos y otros hidrfitos acuticos. En este estudio, V. cholerae O1 VNC fue asociado con microplancton y zooplancton. En una fraccin de zooplancton colectada desde el estuario de Ro de la Plata se asociaron tanto especies de origen marino (Acartia tonsa, Paracalanus crassirostris, Paracalanus parvus) como especies originarias del agua continental (Diaptomus sp.) con V. cholerae O1 VNC. Destacan principalmente la especie Acartia tonsa que se produce en el estuario de Ro de la Plata y Diaptonus sp., que ha sido repetidamente encontrado en aguas continentales de Argentina. Adems en la estacin marina de la plataforma continental existen otras especies asociadas con V. cholerae O1 VNC (Corycaeus amazonicus, Centropages furcatus y Ctenocalanus vanus), las cuales son comnmente habitantes de las costas del norte de las aguas de Argentina. Tanto en el estuario como en el medioambiente marino, un gran nmero de muestras de agua con fracciones de zooplancton fueron positivas para V. cholerae O1. Probablemente en aquellos casos donde las muestras fueron positivas para V. cholerae O1 pero negativas para plancton fijado a V. cholerae O1, se incluy especies ms pequeas que el tamao del poro utilizado. Los coppodos constituyen un reservorio ambiental para V. cholerae debido al ciclo de crecimiento que poseen donde se incluye un

cambio en el tegumento, que por biolgicos o mecnicos produce

la accin de diferentes agentes una abundancia de sustancias

microscpicas que otorgan fijacin a la bacteria. Vibrio cholerae no-O1 cultivable se identific predominantemente en los meses ms clidos y en estuarios con baja salinidad, descubrimiento que concuerda con los de otros reportes. Esta relacin no se observ en Vibrio cholerae no-O1 no cultivable, ya que este organismo se encontr en todas las temporadas, tanto en mar como estuarios. V. cholerae O1 VNC fue encontrado en el Ro Ganga de Varanasi, India. Si de este fuera el caso en el Ro de la Plata y en la plataforma marina Argentina, podemos especular que Vibrio cholerae no-O1 (o por lo menos algunas cepas de este grupo) pueden ser ms fcilmente transformadas a cepas cultivables en comparacin con cepas de V. cholerae O1 en presencia de baja salinidad y a altas temperaturas. Se demostr que la tcnica de PCR empleada para deteccin de Vibrio cholerae es una herramienta til para anlisis de muestras medioambientales aun cuando las concentraciones de bacterias son muy bajas (2-3 UFC/ml). Por otra parte, la combinacin de los mtodos PCR y DFA-DVC, permiti confirmar la viabilidad de Vibrio cholerae O1 y la potencial patogenicidad de Vibrio cholerae O1 no cultivable. El mtodo DFA-DVC confirm la presencia de formas viables de Vibrio cholerae O1, mientras que el PCR permiti detectar genes de virulencia que pueden formar parte, no slo de cepas Vibrio cholerae O1, sino tambin de Vibrio cholerae no-O1. Previo a este estudio, no se tena evidencia de que Vibrio cholerae O1 era parte de la flora normal del suroeste de las aguas del Ocano Atlntico, tanto en las aguas costeras del Ro de la Plata como en el estuario. El Vibrio cholerae O1 VNC, detectado por estos mtodos y usado en este estudio, posea una informacin gentica tpica de una forma patgena de Vibrio cholerae O1 (Por ejemplo los genes ctxAB y tcpA).

En algunas condiciones climticas Vibrio cholerae O1 VNC puede revertirse a un estado transmisible, por lo que los programas para prevencin del clera en Sudamrica no deben ser abandonados.

SITUACIN MUNDIAL

EL CLERA EN CHILE El Vibrio cholerae es una bacteria que desde 1816 ha originado siete pandemias conocidas en el mundo occidental, muchas de las cuales han afectado directamente a los chilenos. La sptima y ltima pandemia se origin en Indonesia en 1961 llegando al Per en 1991 y reportando en Chile 174 casos entre 19911994. El ltimo brote de clera en el pas fue reportado a fines de 1997 en la comuna de San Pedro de Atacama, al norte del pas, que afect a 23 personas, con una letalidad de 8,7%. Asimismo, en muestras ambientales desde 1991 hasta 1998, se han confirmado 88 cepas de Vibrio cholerae 01, que incluye los biotipos: clsico y el Tor. Es por esto que resulta importante no bajar la guardia ante esta enfermedad, con lo cual se hace esencial entre otros aspectos: extremar las medidas sanitarias y el control sobre los alimentos. Desde entonces, se realiza como parte de las actividades de vigilancia el estudio de Vibrio cholerae en todos los casos de diarrea que ocurren en las regiones (I a VI Regin). En el resto de las regiones se realiza muestreo de los coprocultivos que se toman habitualmente a los cuadros diarreicos: 1 de cada 5 en los mayores de 18 aos y 1 de cada 10 en los menores de 18 aos. La vigilancia tambin se realiza mediante el estudio ambiental de muestras de aguas de regado, hortalizas y mariscos. En este contexto, la Seccin de Bacteriologa del ISP tiene como funcin el actuar como Laboratorio Nacional de Vigilancia. En sus laboratorios se reciben cepas bacterianas y muestras de algunos laboratorios que no tienen capacidad de respuesta ante sospechosa de patgenos que son de notificacin obligatoria. Esta funcin se basa en el Decreto Supremo 158 del 2004:

ARTICULO 1.- Se considerarn enfermedades de notificacin obligatoria las que a continuacin se indican, con su correspondiente periodicidad: De Notificacin Inmediata: La sospecha de casos de Difteria, Clera, Botulismo, etc. ARTICULO laboratorio enfermedad: Enteropatgenos: Campylobacter spp. Es debido a esto que la confirmacin diagnstica de aislamientos de Vibrio cholerae de muestras clnicas y ambientales las realiza el ISP. El cual dentro de sus capacidades ha implementado un Plan Clera para el fortalecimiento del laboratorio de referencia del Instituto Salud Pblica a travs del uso de metodologas para: Identificacin y Serotipificacin rpida, con inclusin de mtodos moleculares abreviados. Tipificacin gentica por Electroforesis de Campo Pulsado, segn protocolo CDC-PulseNet, para definir clones circulantes. Adems de un refuerzo de los laboratorios locales a travs de: Envo de medio de cultivo TCBS a los laboratorios de los hospitales Base del pas. Envo de medio de transporte Cary-Blair a los laboratorios de los hospitales Base del pas. Capacitacin y transferencia tecnolgica: o Coprocultivo e identificacin de Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, a los 9.- Se les considerar agentes objeto de vigilancia causales de de siguientes microbiolgicos

Conjuntamente, la utilizacin de Epidemiologa molecular para la tipificacin de aislamientos ante un escenario de brotes, permite la aplicacin e integracin de la biologa molecular a las investigaciones epidemiolgicas. Lo que permite un estudio a nivel gentico de la etiologa, distribucin y prevencin de las enfermedades infecciosas en las poblaciones humanas, animales, vegetales y sus posibles interacciones. Tambin la identificacin de subtipos microbianos y la

determinacin de relaciones entre aislamientos. Hoy en da, desde la aparicin de la enfermedad en Hait en octubre de 2010, y ante la confirmacin de casos en Venezuela, el Instituto de Salud Pblica ha coordinado con el Ministerio de Salud, las seremis de Salud del pas, la Superintendencia de Servicios Sanitarios, Directemar, Sernapesca y otras entidades pblicas y privadas, la actualizacin de mtodos y guas tcnicas tanto para laboratorios clnicos (donde se confirman los casos clnicos sospechosos) como del ambiente (donde se confirma la presencia del Vibrio cholerae en el ambiente). Adems del lanzamiento de una serie de campaas para evitar el ingreso de clera al pas Es as que en lo que va del ao 2011 se han notificado 8 casos sospechosos de clera en nuestro pas. Todos ellos han sido descartados por laboratorio y siete de ellos por el Instituto de Salud Pblica, segn lo establece la Circular de Vigilancia y Control de Clera B51/ 41 del 2 de Diciembre de 2010.

BIBLIOGRAFA Divisin de Salud de las Personas, Departamento de Epidemiologa, Ao 2000. La situacin del clera en las Amricas. OPS Boletn Epidemiolgico vol. 12 n 1, 1991. OPS Ao del Centenario1902-2002 Noticias de Salud Semana a Semana. Comunicado N 7 Normas Tcnicas de Vigilancia de Enfermedades Transmisibles. Ministerio de Salud, Divisin de Salud de las Personas, Departamento de Epidemiologa, Ao 2000. BINSZTEIN, N. y col. Viable but Nonculturable Vibrio cholerae O1 in the Aquatic Environment of Argentina. Appl. and Environ. Microbiol. 2004, p. 70: 7481-7486. BRICENO, I. y col. Septicemia fatal causada por Vibrio cholerae noO1, no-O139 hemoltico en Chile: Caso clnico. Rev. md. Chile. 2009, vol.137, n.9, pp. 1193-1196. HEITMANN, I. y col. Revisin y recomendaciones para el manejo de diarrea por Vibrio parahaemolyticus. Rev. chil. infectol. 2005, vol.22, n.2, pp. 131-140. LEYVA, V. y col. Determinacin de Vibrio Cholerae en ostin fresco .Revista Cubana de Aliment. Nutr. 1996,vol.10,n1. LOCASCIO DE MITROVICH, C. y col. Microcrustceos y Vibrio cholerae O1 viable no cultivable (VNC): resultados en la Cuenca del Ro Sal, Tucumn, Argentina. Lat. Am. J. Aquat. Res. [online]. 2010, vol.38, n.1 pp. 71-80. Sitios webs: <http://www.Emol.cl>

<http://www.LaTercera.cl> <http://www.ispch.cl>

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