INFORME # 2.

Fecha de realizacin: 06/02/2012 Fecha de entrega: 29/02/2012

RESUMEN En este informe se presenta los resultados obtenidos mediante la absorcin UV/visible tras aislar determinada protena presente en la harina segn el grado de solubilidad de las mimas frente a solventes, tales como, agua, cloruro de sodio y etanol. Para llevar a cabo este proceso de absorcin, fue utilizado dos mtodos ampliamente conocidos: Mtodo de absorcin en UV y Mtodo de Biuret, los cuales permiten la cuantificacin de cada una de las protenas extradas anteriormente. E siguiente trabajo plasma la necesidad de cuantificar las protenas, las cuales son polmeros lineales de -aminocidos, presentes en la harina de trigo (haz de oros), donde su extraccin se realiza por medio de criterios fsicos, los cuales incluyen aspectos de solubilidad, y su debida cuantificacin basada en propiedades intrnsecas de las protenas para absorber luz en el U.V y la capacidad de las mismas parar formar ciertos complejos coloreados en soluciones alcalinas.

INTRODUCCIN Las protenas son polmeros lineales de aminocidos con amplia variabilidad estructural y funciones biolgicas muy diversas. La variedad de protenas es elevadsima, y para su clasificacin se suele recurrir a: Criterios Fsicos Criterios Qumicos Criterios Estructurales Criterios Funcionales En este para el desarrollo de este informe se centrar n los criterios Fsicos, los cuales se encuentran determinados por la solubilidad de las protenas. Criterio Fsico. El criterio fsico ms utilizado es la solubilidad. As se distinguen:

1.

Albminas: protenas que son solubles

en agua o en disoluciones salinas diludas 2. Globulinas: requieren concentraciones salinas ms elevadas para permanecer en disolucin 3. Prolaminas: solubles en alcohol 4. Glutelinas: slo se disuelven en disoluciones cidas o bsicas 5. Escleroprotenas: son insolubles en la gran mayora de los disolventes PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Tome 5 mL de la solucin acuosa del aminocido (cido glutmico) 0,01 M. 2. Determine el pH inicial de la solucin del aminocido.
1

3. Adicionar cantidades conocidas de HCl y NaOH (0,01 N) y medir el pH. 4. Determinar los valores de pKa y calcular el punto isoelctrico a partir de la curva de titulacin. 5. Elabora las cuervas de titulacin de pH versus miliequivalentes de HCl y NaOH adicionados. 5. Analizar e interpretar los datos. Primera parte: Trabajo terico 1. Consulte los valores para el pK de los grupos carboxilo y amino correspondientes al aminocido, calcule el pI y el pH de una solucin 0,01 M. 2. Haga los clculos para la titulacin de 5 mL de solucin 0,01 M del aminocido, considerando que adiciona alcuotas de 1 mL de HCl 0,01M hasta pH 1,5. 3. Haga los clculos para la titulacin de 5 mL de solucin 0,01 M del aminocido, considerando que adiciona alcuotas de 1 mL de NaOH 0,01M hasta pH 12,5. 4. Haga una grfica de la curva de titulacin para el aminocido y dibuje las estructuras del aminocido a pH 1,5, en el pI y a pH 12,5. Segunda parte: Trabajo experimental 1. Curva de titulacin experimental para el aminocido. 2. Clculos de los valores de pK y del pI a partir de las curvas de titulacin para el aminocido. 3. Muestra de clculos: Clculo de la fraccin ionizada de los diferentes grupos a pH 7. Utilice la ecuacin de Henderson-Hasselbalch.

Montaje

Figura No. 3Montaje experimental para la medicin de los pH de la solucin de aminocido.

RESULTADOS Volumen de solucin de cido glutmico: 5 mL Concentracin de solucin de cido glutmico: 0,01 M
Vol NaOH (mL) [0,01 ] N 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,3 2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6 pH Vol HCl (mL) [0,01] N 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,1 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 4,9 5,1 pH

3,65 3,66 3,7 3,84 3,95 4,02 4,1 4,21 4,32 4,44 4,58 4,77 5,17 5,66 6,37 7,85 8,31 8,63

3,65 3,44 3,28 3,14 3,01 2,9 2,78 2,7 2,62 2,57 2,49 2,43 2,39 2,36 2,32 2,29 2,27 2,26
2

3,8 4 4,2 4,4 4,5 4,7 4,8 5 5,2 5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 6 6,2 6,4 6,6 6,8 7,1 7,3 7,5 8 8,2 8,4 8,5 8,7 8,9 9 9,1 9,2 9,4 9,5 9,6 9,8 10 10,2 10,5 10,7 11 11,2

8,82 8,93 9,07 9,17 9,19 9,26 9,32 9,38 9,46 9,52 9,55 9,58 9,61 9,62 9,66 9,68 9,74 9,77 9,84 9,89 9,95 10 10,04 10,13 10,18 10,22 10,24 10,26 10,3 10,31 10,33 10,34 10,37 10,38 10,4 10,41 10,47 10,5 10,53 10,57 10,63 10,68

5,3 5,5 5,7 5,9 6,1 6,4 6,6 6,8 7 7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 10,2 10,4 10,6 10,8 11 11,4 11,8 12,2 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

2,24 2,23 2,2 2,19 2,18 2,16 2,15 2,14 2,13 2,12 2,11 2,1 2,09 2,08 2,07 2,07 2,06 2,05 2,03 2,03 2,02 2,02 2,01 2,01 2 1,99 1,99 1,99 1,98 1,97 1,96 1,95 1,94 1,93 1,92 1,91 1,89 1,87 1,86 1,85 1,85 1,84

11,4 11,6 11,8 12 12,2 12,4 12,6 12,8 13,1 13,3 13,5 13,7 13,9 14,1 14,3 14,6 15 15,6 15,9 17,1

10,71 10,75 10,79 10,82 10,84 10,86 10,88 10,91 10,95 10,96 10,97 10,99 11,01 11,03 11,04 11,06 11,1 11,15 11,15 11,22

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

1,83 1,83 1,82 1,81 1,8 1,8 1,8 1,8 1,79 1,79 1,78

CLCULOS Primera parte: Trabajo terico 1. cido glutmico ionizado

O O
-

O NH2 O O O
+ NH3

O H O NH3
+

O H O NH3
+

9,67

4,25

2,19

(-2)

(-1)

(0)

(+1)

pI pKa1(COOH) pKaR(COOH) pKa2(NH2)

3,22 2,19 4,25 9,67

3

Los valores de pKb se pueden calcular de la siguiente manera: pKb = 14 pKa [ cido conjugado COOH COOH ( grupo R) NH3+ pKa 2,19 4,25 9,67 Base conjugada COOCOO
-

pKb 11,81 9,75 4,33 [ ] [ ] [ ]

NH3+

Debido a que el grupo amino es una base ms fuerte que los iones carboxilato, el pH de la solucin depende del grado de ionizacin del grupo amino. Para el grupo amino: 2.Titulacin con HCl 0.01M Partiendo desde un pH=7, se obtienen los

O O
-

O NH2 O O
-

NH3

siguientes clculos de pH a medida que se agrega 1mL de HCl 0.1M a 5mL 0.1M de cido glutmico. (moles de Acido glutmico: 5x10O

H OH

9,67
O
-

HO

L x 0.1M = 5x10-4 moles; moles de HCl: 1x10-3L x 0.1M = 1x10-4 moles) A pH=7, el pKa de las especies decrece a 4.25con el decrecimiento del pH, donde las especies predominantes son AA0, AA-1 y AA-2 Entonces: 1mL de HCl
[ [ )
4

(-2)

(-1)

[ [

][ ]

] (

( )( ) )

) ]

2 mL de HCl

( )

[ [

] ) ]

3 mL de HCl
( ) ( )

8 mL de HCl

4 mL de HCl
( )

9 mL de HCl

Al tener exceso de acido en la titulacin, el valor en el pH depender principalmente de la concentracin de protones H+, proporcionados por el HCl. Entonces: 5 mL de HCl
( [ [ [ ] ) ] ]

10 mL de HCl

3.Titulacin con NaOH 0.01M Partiendo desde un pH=7, se obtienen los siguientes clculos de pH a medida que se agrega 1mL de NaOH 0.1M a 5mL 0.1M de cido glutmico. (moles de Acido glutmico: 5x10-3L x 0.1M = 5x10-4 moles; moles de NaOH: 1x10-3L x 0.1M = 1x10-4 moles) A pH=7, el pKa de las especies aumenta a 9.67, con el aumento en el pH, donde las especies predominantes son AA-1 y AA-2 Entonces: 1mL de NaOH

6 mL de HCl
[ ]

Dado el valor del pH, ahora se obtienen los clculos por medio de la ltima constante de acidez del cido glutmico: 2,19, con las nuevas especies dadas AA0 y AA+1 7mL de HCl

[ [ )

] ) ]

acidez del cido glutmico: 2,17, con las nuevas especies dadas AA0 y AA+1 7mL de NaOH
[ ]

2 mL de NaOH

8 mL de NaOH
[ ]

3 mL de NaOH 9 mL de NaOH

4 mL de NaOH
( )

10mL de NaOH
[ ]

Al tener exceso de base en la titulacin, el valor en el pH depender principalmente de la concentracin de hidroxilos OH-, proporcionados por el NaOH. Entonces: 5 mL de NaOH
([ [ ] ])

Para llegar a un pH de 12.5, se necesita un volumen de NaOH considerable para producir dicho cambio, esto es debido a la estabilidad del buffer que se produce por las especies presentes en la solucin, posterior al ltimo valor de pKa: 9.67. 4. Estructura a ciertos pH Estructura a pH 1,5 Estructura en el punto isoelctrico
O
NH3
+

6 mL de NaOH
[ ]

Estructura pH 12,5
O

O H

H
O H

NH3

Dado el valor del pH, ahora se obtienen los clculos por medio de la ltima constante de

O
O O
-

NH2 O O
-

4 3 2 1 0 0 0.0001

0.0002

Equivalentes de HCl
0.0003

0.0004

Curvas de titulacin con HCl y NaOH

Segunda parte: Trabajo experimental 1. Curva de titulacin experimental para el cido glutmico Curva de titulacin con NaOH [0,01] N. pH vs mL NaOH
11.5 10.5 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 0.0000

11.5 10.5 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0 5 10 15 Volumen de titulante

2. Clculo de pK y pI experimental para el cido glutmico En las curvas de titulacin experimentales no es posible apreciar de un buen modo los cambios en el pH a medida que aumenta el volumen de NaOH y HCl. Para la curva del NaOH es posible apreciar un cambio cercano entre los pH 3,5 y 4,5, adems de otro cambio grande por encima de un pH por encima de 7; el pH inicial es 3,65 as que no es posible ver el cambio cercano al pH de 2,19 en el cual se encontrara 50 % del cido glutmico cargado (+1) y el 50% del cido no cargado (0).
7

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

Equivalentes de NaOH

Curva de titulacin con HCl [0,01] N. pH vs mL HCl

pH

Se esperara que cerca de pH 4,25 hubiera poca variacin de pH al igual que cerca al pH de 9,67, como lo es notorio en la tabla de datos, cabe notar que en las grficas no es muy notoria esta pequea variacin. Para la curva de HCl solo es posible apreciar cambios menores a un pH de 3,65 en el cual solo se puede apreciar un cambio entre 1,80 y 2,20 en el pH. 3. Clculo de la fraccin ionizada a pH 7 Segn el valor de pH establecido, se encuentra entre los valores de pKa2 y pKa3 del cido glutmico, es decir, en medio de 4.25 y 9,67, donde las formas inicas predominantes de este aminocido son el [AA-1] y el [AA-2]. El equilibrio de estas dos especies se describe mediante Ka3. Entonces a una concentracin de 0.1 M: ANLISIS DE RESULTADOS De las dos grficas no se puede tener medidas certeras de pK ya que las medidas no son muy parecidas a las que se esperaran tericamente. No es notorio en las curvas experimentales un pH que pueda corresponder a los pK, solo se pueden hallar rangos de pH lo cual no da un valor aceptable y da cuenta de que hubieron varios errores sistemticos en la titulacin del aminocido ya sea por montaje, variaciones en la medicin del titulante (cido y/o base) y valores errneos por descalibracin del pHmetro. Como se logra apreciar a partir de las curvas de titulacin, tanto con HCl y NaOH para el cido glutmico, existen tres puntos donde el pH vara muy poco, esto se debe a que el cido glutmico se esta protonando, en el caso de la titulacin con cido o se est desprotonando, si es el caso de la titulacin de la base, de ah los valores de las constantes de acidez o de basicidad (pKa o pKb). Por medio de estas constantes se puede observar cuales son los grupos que son ms cidos al momento de la titulacin con base o cuales son ms bsicos ante la titulacin con cido. Ahora, en primera instancia, se puede detallar que: Al momento de agregar volmenes de cido de 4.2, 4.4 y 4.5 mL, se obtuvieron valores de pH de 2.20, 2.19 y 2.18. Ya que el valor en el pH no cambi mayormente, se piensa que el valor de pKa1 se encuentra en este intervalo. Mediante la curva de titulacin con HCl se
8

[ [

] ) ] ] ) ] ] ) ] ( [ [ ] ) ] ] ) ]

[ [ [ [

[ ( [ [ [ ] ]

] ) ] ( ( ) )

[ ( [

determina que el valor aproximado de pKa1 es de 2.19. Desde este valor, empez la menor variacin de pH.Este pKa determina que el grupo carboxilo del cido glutmico es desprotonado para pasar de la forma (AA+1) a la forma (AA0). Se debe tener en cuenta que ya que se titul con cido, el grupo carboxilo tiene un valor de pKb = 14-2.19 = 11.81, lo cual significa que es dbilmente bsico y realmente lo que sucedi fue que el carboxilo cargado negativamente fue protonado para pasar de la forma (AA+1) a la forma (AA0) Por otro lado, al momento de agregar un volumen de base de 1.2, 1.4 y 1.6 mL, se obtuvieron valores de pH de 4.10, 4.21 y 4.32; dado que no hubo un cambio notable en el valor del pH del aminocido durante la adicin de valores de volmenes de base ms grandes que el establecido, entonces el valor la constante de acidez pKa2 se encuentra en este intervalo. Mediante la curva de titulacin con NaOH se determina que el valor aproximado de pKa2 es de 4,25. Desde este valor, empez la menor variacin de pH. Este pKa determina que el grupo amino de la cadena R del cido glutmico es desprotonado para pasar de la forma (AA0) a la forma isoelctrica (AA-1). Por ltimo, al momento de agregar un volumen de base de 5.7, 5.8 y 5.9 mL, se obtuvieron valores de pH de 9.61, 9.62 y 9.66, respectivamente. Dado que no hubo un cambio notable en el valor del pH del aminocido durante la adicin de valores de volmenes de

base ms grandes que el establecido, entonces el valor la constante de acidez pKa3 se encuentra en este intervalo. Mediante la curva de titulacin con NaOH se determina que el valor aproximado de pKa3 es de 9.67. Desde este valor empez la menor variacin en el pH. Este pKa determina que el grupo amino adyacente del cido glutmico es desprotonado para pasar de la forma (AA-1) a la forma isoelctrica (AA-2). CONCLUSIONES Cuando un aminocido est en solucin, el grupo carboxilo se comporta como un cido, cede un protn mientras que el grupo amino se comporta como una base captando un protn. La consecuencia del fenmeno descrito conduce a la formacin de un dipolo. Los aminocidos pueden existir como sal interna, llamada zwitterin. Esto ocurre porque el protn del grupo carboxilo es abstrado por el grupo amino NH2 que est en posicin alfa y quedando este como grupo amonio NH3+ Cuando el pH de una solucin es bajo, los grupos ionizables del aminocido estn protonados, y la carga neta del aminocido mismo es de signo positivo. Cuando el pH es alto, los grupos ionizables estn desprotonados, y la carga neta es de signo negativo. Entre ambas zonas, habr un pH en el cual la carga neta del aminocido es nula, la cual es denominada punto isoelctrico. Teniendo en cuenta los valores de pKa de los grupos de los aminocidos, se obtiene la
9

informacin de cul de los grupos que contiene el aminocido mismo va a reaccionar preferiblemente ante una valoracin con una base, ya que a menores valores de pKa el grupo tender ser ms cido.

BIBLIOGRAFA [1] BIOQUMICA: La ciencia de la vida. Gmez Georgina. Pgina 40. [2] BIOQUMICA. TITULACIN DE AMINOCIDOS. Universidad Interamericana de Puerto Rico. Dpto. De Ciencias y matemticas. Harry Alices-Villanueva. [3] Arilla E. Preparacin de disoluciones. En: Gonzlez de Buitrago JM, Arilla E, RodrguezSegade M, Snchez A (eds): Bioqumica Clnica, 1 ed. Editorial Alhambra (Madrid, Espaa), pp. 529 552 [4] IRWIN H. SEGEL. Clculos de Bioqumica. Universidad de California, Davis California Editorial Acribia, Zaragoza Espaa, 1982. [5]BUTLER J. N. calculations. Addison Company, Inc. 1964 Solubility and Ph Wesley Publishing

10