Resumen Supresores de la sealizacin de citoquinas (SOCS) protenas regulan la transduccin de seales, pero su papel en las respuestas a quimiocinas permanece

mal entendida.Nos informan de que las clulas que expresan SOCS1 y 3 de la adhesin exhibicin mejorada y reduccin de la migracin hacia la quimiocina CCL11. Quinasa de adhesin focal (FAK) y la GTPasa RhoA, la adhesin de control y la migracin celular y muestran la presencia de SOCS1 o 3 regula la expresin y la fosforilacin de la tirosina FAK, al tiempo que aumenta la activacin de RhoA. Nuestros nuevos hallazgos sugieren que SOCS1 y 3, pueden controlar la quimiotaxis y la adhesin mejorando de forma significativa tanto FAK y la actividad de RhoA, por lo que la localizacin de las clulas inmunes al sitio de la inflamacin alrgica.

Abreviaturas SOCS, supresores de la sealizacin de citoquinas, FAK, la quinasa de adhesin focal, el GM-CSF, granulocitos y macrfagos factor estimulante de colonias, IL, IL, IFN, el interfern, JAK, Janus quinasa, STAT, transductor de seal y activador de la transcripcin, el FMAM, guanina nucletido intercambio de factores de riesgo; GAP, GTPasa de la activacin de protenas; MEF, fibroblastos de embriones de ratn, HEK, de rin embrionario humano; DMEM, Dulbecco Modificado guila medios de comunicacin, FCS, de suero de ternera fetal; BMDM, los derivados de mdula sea macrfagos, WT, de tipo salvaje; RT , a temperatura ambiente Palabras clave La quimiotaxis, la transduccin de la seal; citoquinas, las clulas hematopoyticas 1. Introduccin La extravasacin de leucocitos de los vasos sanguneos en el tejido es fundamental para el desarrollo de una efectiva respuesta inflamatoria alrgica. Las quimioquinas son una familia de protenas secretadas que regular la migracin de los leucocitos y mediar su efecto biolgico a travs de receptores acoplados a protenas G-en la superficie de sus clulas diana. Las quimiocinas son tambin responsables de la contratacin anormal y excesiva de leucocitos en la enfermedad inflamatoria alrgica, tales como el asma y la dermatitis de contacto, que ha aumentado los intentos de manipular teraputicamente sus efectos [1]. CCL11 es una quimioquina originalmente identificado como un quimioatrayente eosinfilos, pero ahora se sabe que quimiotctico para muchas clulas que expresan su receptor, CCR3, incluyendo los macrfagos y neutrfilos [2] y [3]. CCL11 seales a travs de la activacin de las protenas de sealizacin, incluyendo las protenas quinasas activadas por mitgenos, las cinasas reguladas por seales extracelulares, y la protena quinasa C [4] y hemos demostrado que CCL11 utiliza supresores de la sealizacin de citoquinas (SOCS) para bloquear la induccin de granulocitos y macrfagos factor estimulante de colonias (GMCSF) y la interleucina (IL) -4 de sealizacin y por lo tanto regulan la diferenciacin de clulas dendrticas [5]. Sin embargo, la regulacin especfica de

CCL11 sealizacin intracelular o la migracin no se ha investigado. SOCS son una familia de protenas (8 citoquina inducible SH2 que contiene protenas y SOCS1-7) que actan en un bucle de retroalimentacin negativa, las respuestas a la inhibicin de citocinas y una serie de productos microbianos, entre ellos el interfern (IFN)-, IL-6 y lipopolisacrido [6]. SOCS fueron descubiertos como inhibidores de la quinasa Janus / transductor de seales y activador de la transcripcin (JAK / STAT) va [7] y [8], sin embargo son cada vez ms cree que el control de otras vas, como la quinasa de adhesin focal (FAK) va de sealizacin [9], [10] y [11]. FAK es una tirosina quinasa, que es crucial en la sealizacin de las integrinas y los receptores de tirosina kinasas durante la migracin y la adhesin. FAK es reclutado a los sitios de la agrupacin de la integrina, que induce la fosforilacin de la tirosina-397 y crea un sitio de unin para las quinasas Src que conducen a la activacin de Rho GTPasa. Rho GTPasas se plasma unida a la membrana las protenas G que controlan la formacin y el desmontaje del citoesqueleto de actina y por lo tanto la movilidad celular directa.GTPasas ciclo entre una forma inactiva (PIB-bound) y activa (GTP) del Estado y su actividad es regulada positivamente por factores de intercambio de nucletidos de guanina (GEFS) y negativamente regulado por la GTPasa de la activacin de las protenas. FAK aumenta la actividad de RhoA a travs de asociaciones con GEFs y por lo tanto controla la actina y la polarizacin de los microtbulos [12]. Mientras SOCS1 y 3 se han mostrado a asociar con FAK e inhiben su actividad quinasa, sus efectos sobre Rho GTPasas no se conocen. Este estudio demuestra que SOCS1 y 3 fuertemente mejorar la adhesin de las clulas e inhibir la migracin hacia CCL11. La presencia de estos SOCS mejorado tanto FAK expresin y fosforilacin, mientras que tambin aumenta la actividad de RhoA, que puede ser responsable del aumento en la adhesin y la inhibicin de la quimiotaxis.Nuestras observaciones implican directamente SOCS1 y 3 en la regulacin de la movilidad celular mediada por FAK y RhoA, que es crucial para comprender inflamatoria mediada por la migracin. Materiales y mtodos 2,1. Cultivo de clulas Murinos fibroblastos embrionarios (MEFs) y el rin embrionario humano (HEK) 293T clulas fueron cultivadas en medios de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina / estreptomicina. Las clulas se cultivaron a 37 C en CO2 al 5% y el 95% de humedad. SOCS-1-/ - MEFs fueron retro-viral infectados con SOCS1 PMX-IRES-EGFP y SOCS3-/ - MEFs con SOCS3 PMX-IRES-EGFP como se describe anteriormente [13]. Las clulas fueron tratadas con 100 ng / ml humana CCL11 (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Derivados de mdula sea (macrfagos BMDMs) se prepararon a partir C57/BL6 de tipo salvaje (WT) y LysM + / fl creacin SOCS3 / fl los ratones y se cultivaron durante 1 semana en DMEM, suplementado como antes.Proliferacin fue impulsado por el GM-CSF derivado de sobrenadante de clulas L929.

2,2. Migracin de ensayo La migracin celular hacia la CCL11 se evalu a travs de cmaras de Boyden con membranas transwell ms de 12 horas (6,0 mm de dimetro, tamao de poro de 8 um [Tecnologas del receptor]) como se describi previamente [14]. La migracin 293T se midi como el recuento de clulas a partir de imgenes confocal. MEF y migracin BMDM se midi mediante la fijacin de las clulas durante 10 minutos en metanol y tincin con solucin de violeta cristal (0,05% de cristal violeta y 25% de metanol) durante 20 min. Las membranas se destieron durante 20 minutos con solucin decolorante (1:1, etanol: citrato de sodio 0,2 M) y la densidad ptica se midi a A570. 2,3. El anlisis por inmunotransferencia Expresin de protenas se evalu a partir de clulas lisadas en tampn de lisis Brij (0,05 M Tris-HCl pH 7,4, NaCl 0,15 M, 1 x 10-3 M EDTA, pH 8, 1% de Brij 97) suplementado con aprotinina (5 mg / ml), se leupeptina (5 mg / ml), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM) y Na3VO4 (1 mM). Los extractos se sedimentaron a 12 000 xg, 4 C durante 10 min. Los lisados fueron analizados por electroforesis en gel de poli-acrilamida. SOCS1 (Invitrogen), SOCS3 (Santa Cruz biotecnologas, CA), pY397FAK y FAK (Biosource), 1 integrina (la seal de la clula), y -tubulina (Sigma) fueron detectados utilizando los anticuerpos adecuados. 2,4. Confocal de imgenes Las clulas fueron sembradas y transfectadas en Labtek II, CC2 tratado cmara de diapositivas. Las clulas fueron fijadas con paraformaldehdo al 4% en 1XPBS durante 20 min. Las clulas se permeabilizaron entonces en 0,5% de Triton X-100 en 1XPBS durante 5 min, se lav en 1XPBS y bloqueado en solucin de bloqueo (1% de BSA, 10% suero burro en 1XPBS) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las clulas se tieron con pY397FAK o pY925FAK (seal de la clula) y AlexaFluor 488 anti-conejo anticuerpo secundario (Molecular Probes), Talin (Sigma) y AlexaFluor 568 anti-ratn anticuerpo secundario (Molecular Probes) y tambin faloidina FITC-(Sigma) para F -actina. Las diapositivas fueron sellados con una hoja de cubierta y anti-fade medio de montaje (Invitrogen) y se analizaron con un microscopio confocal y la Liga de AF de software (Leica). 2,5. La adhesin de ensayo Placas de 96 pocillos se revistieron con el fibringeno (20 g / ml) durante 1 ha temperatura ambiente antes de 100 l de clulas (1 x 105/ml) se aadieron a 0-60 min.Las clulas adheridas se tieron con solucin de violeta cristal (como arriba) durante 20 min, antes de ser lavadas con 1XPBS y destieron durante 20 minutos en solucin decolorante (como anteriormente) y la densidad ptica se midi a A570. 2,6. GTPasa ensayos de activacin Activacin de RhoA se midi por GTP tirar de ensayo como se ha descrito anteriormente [15]. Las clulas fueron lavadas con 1XPBS y se lisaron en tampn de lisis (50 mM Tris pH 7,2, NaCl 500 mM, 1% (v / v) de Triton X-100, 5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT) que contena inhibidores de proteasa (como

anteriormente). Los lisados se incubaron a 4 C durante 1 h con protena de fusin GST-Rhotekin acoplado a glutatin-Sefarosa (Amersham Biosciences). Despus de la incubacin, las perlas se centrifugaron a 8 000 xg y se lav en tampn de lisis. Las perlas se hirvi en tampn de Laemmli. GTPasas activos se detectaron por inmunotransferencia con anti-RhoA de anticuerpos (Santa Cruz) y lisado fue analizada para cuantificar el total del Rho. 2,7. El anlisis estadstico Datos sobre la migracin y la adhesin fueron representados en forma de grficos de barras, creados a partir de los datos en bruto en Microsoft Excel. Los grupos fueron comparados usando la t de Student prueba de significacin estadstica (P * 0,05, ** P 0,01 y *** P 0,001). 3. Resultados 3,1. SOCS1 y 3 de la expresin de inhibir la quimiotaxis hacia la CCL11 SOCS1 y 3 se han relacionado con un bloque en la fibronectina mediada por la movilidad [10] y [11], pero su funcin en la migracin inducida por las quimiocinas permanece inexplorado. Por lo tanto, se analiz el efecto de la SOCS1, 2 y 3 sobre la quimiotaxis hacia la CCL11. CCR3 y SOCS1, 2 o 3 fueron transfectadas en clulas HEK293T, antes de la migracin hacia CCL11 se midi utilizando una cmara de Boyden. CCR3 niveles fueron confirmados por citometra de flujo y de expresin SOCS por inmunotransferencia (datos no presentados). SOCS2 tuvo ningn efecto sobre CCL11 inducida por la migracin, pero ambos SOCS1 y 3 redujo significativamente la movilidad celular (fig. 1A). Una vez identificados SOCS1 y 3 como potentes inhibidores de la migracin, nos cercioramos de su participacin especfica mediante el anlisis de la migracin inducida por CCL11 en WT, SOCS1 y nulos 3 y expresar MEFs.Hemos encontrado que WT, SOCS1 y 3 clulas nulas migrado hacia CCL11 significativamente ms que las clulas que expresan SOCS (Fig. 1B, C y D).Curiosamente, SOCS3 clulas nulas migrado ms de SOCS1 nulos. La expresin de SOCS fue confirmado por Western Blot (Fig. 1E). La migracin de WT y BMDMs SOCS3 nulos hacia la CCL11 tambin fue investigado. BMDMs que carecen de SOCS3 mostr una migracin hacia la mejora de forma significativa CCL11, en comparacin con las clulas de los ratones WT (Fig. 1F). Estos hallazgos apoyan la hiptesis de que tanto SOCS1 y 3 respuestas quimiotcticas de control para CCL11 y por lo tanto regulan el movimiento celular durante la inflamacin alrgica.

Fig. 1. SOCS1 y 3 de regular la migracin hacia la CCL11. HEK293T clulas se transfectaron con 5 g de CCR3 y construcciones SOCS1-3, antes de la quimiotaxisutilizando 100 ng / ml CCL11 (A). La quimiotaxis se analiz utilizando SOCS1 y nulos 3 y estable y MEFs WT hacia CCL11 (5 ng / ml) (D-D). Los datos son la media S.E.M. (n= 3). SOCS1 y 3 de expresin fue confirmada por inmunotransferencia (E) (n = 3). La migracin de WT y SOCS3 nula BMDMs hacia CCL11 (5 ng / ml) se midi (F).

3,2. SOCS1 y 3 mejorar la adhesin Despus de haber descubierto que inhibe la SOCS CCL11 inducida por la migracin de clulas epiteliales, fibroblastos y macrfagos, se investig el efecto de la SOCS1 y 3 en la adhesin celular. Se analiz la adhesin al fibringeno de la WT, null SOCS ySOCS MEFs que expresan, a los 0, 5, 15, 30 y 60 min. Hemos encontrado WT MEFstenido la adherencia mxima a los 20 min. Las clulas que expresan SOCS3 adheridosignificativamente ms que las clulas que carecen SOCS3, con la adherencia mximase observa entre 30 y 60 min. SOCS1 clulas que expresan tambin se adhiri de manera significativa ms que sus homlogos nulos y la adhesin alcanz su punto mximo entre 20 y 30 min (Fig. 2A). Tambin se encontr que BMDMs WT ceidomucho ms al fibringeno que las clulas sin SOCS3, reafirmando positivo papel regulador SOCS3 en la adherencia (Fig. 2B). Juntos, nuestros resultados indican que tanto SOCS1 y 3 reducen CCL11 mediada por la migracin, sino mejorar la adhesin, al presentar un nuevo mecanismo de regulacin de quimiotaxis.

Fig. 2. SOCS1 and 3 enhance cell adhesion. WT, SOCS1 and 3 null and stable MEFs were incubated for 060 min on fibrinogen coated 96-well plates. Cells were stained with crystal violet and the optical density of the detaining solution was correlated to cell adhesion (A). Adherence of SOCS3 null BMDMs was also measured for 0 and 60 min (B). Data are means S.E.M. (n = 3).

3,3. SOCS1 y 3 mejoran la expresin de FAK y la fosforilacin de la tirosina Como nos encontr SOCS1 y 3 para inhibir CCL11 mediada por la migracin ymejorar la adherencia, estbamos interesados en explorar las protenas intracelularesque se vieron afectados. Dado que la activacin de FAK promueve la adhesin celulary la migracin [16], se analiz la expresin y la fosforilacin, en respuesta a CCL11, enSOCS1 y 3 nulos y las clulas que expresan. Hemos encontrado que SOCS1 y 3clulas nulas expresado bajos niveles endgenos FAK y careca de la tirosina-397fosforilacin (fig. 3A y B). Sin embargo, las protenas y fosforilacin de la tirosina se upregulated por CCL11 estimulacin (Fig. 3 A y B). En contraste, la expresinconstitutiva FAK y la fosforilacin se mejoraron tanto en SOCS1 y 3 expresar MEFs(fig. 3A y B). WT MEFs expresaron bajos niveles de FAK y la fosforilacin de FAK bajaendgena se ha mejorado en CCL11 tratamiento (Fig. 3C). Para investigar ms a fondo la fosforilacin de FAK, se analizaron pFAK por microscopa confocal en WT, estable y nula SOCS1 y 3 MEFs. Confirmando los resultados obtenidos por inmunotransferencia, pY397FAK (Fig. 3D) y pY925FAK (Fig. suplementaria. 1) tena la expresin constitutiva de alta en las clulas que expresan SOCS, en comparacin conlos bajos niveles de SOCS WT o equivalentes clulas nulas. pFAK tambin localizada en las superficies celulares que sobresale con la protena marcadora adherencia, talinay la protena del citoesqueleto, la F-actina, en SOCS1 y 3 clulas que expresan, indicando la activacin de FAK reforzada en los sitios de adhesin focal (Fig. 3D y la figura suplementaria. 1). Al igual que con FAK, los niveles basales de la integrina 1fueron menores en WT, SOCS1 y 3 clulas nulas en comparacin con las clulas que expresan SOCS. expresin de la integrina 1 mostr un patrn similar de induccin para pFAK y se regul en SOCS1 clulas nulas por CCL11, pero se mantuvo bajo enSOCS3 clulas nulas (Fig. 3E). Estos resultados indican que SOCS1 y 3 potencian la expresin FAK endgeno y la activacin en los sitios de adhesin celular, proporcionando un mecanismo molecular de aumento de la adhesin y por lo tanto la migracin reducido.

Fig. 3. SOCS1 and 3 regulate FAK activation and expression, 1 integrin expression and RhoA GTPase activation. SOCS1 (A) and 3 (B) null, stable and WT (C) MEFS were stimulated with CCL11 (100 ng/ml) for 060 min before lysates were analysed for pFAK, FAK and -tubulin by immunoblotting. pFAK (green), talin (red) and F-actin (red) were analysed in WT, SOCS1 and 3 null and stable cells by confocal microscopy (D). 1 Integrin levels were analysed by Western blotting lysates from WT, SOCS1 and 3 null and stable MEFs stimulated for 0, 30 and 60 min with CCL11 (100 ng/ml) (E). SOCS1 and 3 stable and null MEFs were treated with CCL11 (100 ng/ml) for 0, 5 and 15 min and the activation of RhoA assessed by pull down assay using GST-Rhotekin. Proteins extracted by pull down and whole cell lysates were immunoblotted with anti-RhoA antibody (F).

3,4. SOCS1 y 3 mejoran la activacin de RhoA GTPasa GTP RhoA es responsable de la remodelacin de la actina y por lo tanto esencial para la adhesin y la migracin [17]. Por lo tanto, habiendo observado que tanto SOCS1 y 3 pFAK mayor expresin, se analiz la activacin de RhoA por CCL11 tanto en SOCS1 y 3 nulos y estable MEFs. Descubrimos que GTP RhoA es basal alta en SOCS1 y 3 clulas que expresan y CCL11 inducida por la activacin de las clulas ms SOCS3 estables. Sin embargo, los niveles basales de RhoA fueron atenuados en la ausencia de cualquiera de SOCS (Fig. 3F). Estos resultados sugieren que SOCS1 y 3 de expresin conduce a la activacin de RhoA, que puede aumentar la adhesin celular.Tomados en conjunto nuestros resultados sugieren que SOCS1 y 3 de estabilizar la expresin de FAK protenas y mejorar su fosforilacin de la tirosina, mientras que tambin aumenta la activacin de RhoA, que puede aumentar la adhesin celular y reducir la migracin. 4. Discusin Este estudio revela un nuevo papel para SOCS1 y 3 en la regulacin del movimiento celular mediada por FAK y RhoA. Hemos demostrado que SOCS1 y 3 de expresin migracin hacia bloques CCL11, posiblemente a travs de la adhesin celular aumentado. Los efectos observados sobre la movilidad de la clula puede ser regulado por los niveles elevados de FAK activada y RhoA. Nuestro inters en SOCS-controlado la migracin fue impulsada por la infiltracin masiva de linfocitos T, macrfagos y eosinfilos en los rganos principales, tales como el hgado corazn y el pncreas se observa en SOCS1-/ - ratones [7], [18] y [19] ylesiones granulomatosas crnicas e infiltrados de linfocitos, macrfagos, eosinfilos y neutrfilos en los pulmones, piel, intestino y los rganos abdominales en SOCS1-/-IFN--/- ratones [20]. Este fenotipo se pensaba que era de IFN- mediada, sin embargo, nuestro estudio revela que la adhesin SOCS control de las protenas y la migracin hacia la quimioatrayentes, tales como CCL11, y que esto puede ser un aspecto fundamental del control inflamatorio. Estudios anteriores han demostrado SOCS1 y 3 para interactuar con FAK, promover su

degradacin y por lo tanto reducir la migracin a la fibronectina [10], [11] y [21]. En contraste, hemos descubierto una mayor expresin y la fosforilacin de tirosina de FAK en presencia de SOCS1 o 3. Nos fuimos a encontrar que estas clulas, con mayor expresin pFAK, ha aumentado la adhesin celular que puede explicar la reduccin de la migracin inducida por las quimiocinas. Si bien es un hallazgo comn SOCS-mediada por la reduccin de la migracin, la discrepancia en la expresin de FAK y la activacin puede ser el tipo de clulas o de una especie especfica, ya que los estudios previos empleaban hepatoma humano y las lneas de clulas de rin de mono y de nuestras investigaciones se llevaron a cabo con las clulas de rin humano, de ratnfibroblastos y macrfagos. El papel exacto de la FAK en la migracin celular es motivo de debate. FAK / - fibroblastos muestran movilidad reducida [22], [23] y [24], pero siRNA desmontables en HeLa aumenta la migracin de colgeno [25] y la sobre-expresin de FAK en clulas de ovario de hmster chino tambin aumenta la migracin de clulas [26] . Por lo tanto, parece que la actividad FAK puede variar entre las clulas y de estmulo migratorio. La activacin de FAK transitoria es necesaria para la IL-8 mediada por la migracin, sin embargo, la desensibilizacin de los niveles de IL-8 fosforilacin de FAK causa constitutiva [27], similar a nuestros hallazgos en SOCS1 y 3 expresan MEFs. Hemos demostrado que la IL-8 induce la expresin tanto SOCS1 y 3 [28], lo que explica la desensibilizacin a la IL8. Fosforilacin de FAK constante hace que los leucocitos no pueden desplazarse entre apego y desapego, esenciales para el movimiento celular.Por lo tanto, la activacin de FAK coherente, tal como la observada con el exceso de IL-8 o en SOCS1 o 3 expresar MEFs pueden promover la adhesin excesiva, lo que resulta en la migracin reducida. Este estudio demuestra por primera vez que SOCS1 y 3 mejorar FAK y la activacin de RhoA, dando lugar a la adhesin celular y la migracin aument reducida hacia CCL11. Nuestros nuevos hallazgos son importantes en el contexto tanto de la migracin normal de las clulas y la inflamacin alrgica y descubrir nuevas dianas teraputicas para el control de las respuestas inflamatorias excesivas o inapropiadas. Agradecimientos Damos las gracias al Profesor Aki Yoshimura para SOCS1 y 3 nulos y WT MEFs y vectores SOCS1 y 3; Collins Aideen y Keogh Catalina por su ayuda en la generacin de BMDM y Bourke Nollaig de asistencia tcnica. Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Investigacin y Desarrollo, Irlanda del Norte y la Fundacin Britnica del Corazn.