QUE SON LOS CLONES

Lineajes de clulas o de individuos que son homogneos genticamente En zootecnia se conoce como clones a los individuos que son genticamente idnticos

Clones producidos en forma natural

El armadillo se reproduce por Clonacin de si mismo

Gemelos monovitelinos o idnticos, se producen en todos los mamferos

TEORIAS DE LA FORMACION DE GEMELOS IDENTICOS (CLONES) EN FORMA NATURAL

Proceso de expansin y eclosin de las blstulas en bovinos

Mtodos desarrollados por el hombre para producir clones de mamferos de granja a voluntad
Biseccin embrionaria (clonacin verdadera) Disgregacin de embriones tempranos Transferencia Nuclear tomando como clulas donantes de ncleo:
Blastmeros de embriones tempranos Lneas de clulas somticas desarrolladas de
Clulas embrionarias Tejidos fetales Tejidos de animales adultos

Biseccin embrionaria o clonacin verdadera

Biseccin embrionaria
VIVANCO, H.W.; RANGEL, R.; LYNCH, P. and A. RHODES. 1991. Large scale commercial application of bisection of sheep embryos. Theriogenology 35 (1): 292. VIVANCO, H.W. and K.B. GRAENEY. 1992. Comparison of survival of bisected and whole sheep embryos transferred in-season and out of season. Theriogenology 37 (1): 316.

Multiplicacin de embriones sexados por biseccin o clonado verdadero

Sobrevivencia embrionaria de mitades embrionarias resultado Biseccin embrionaria su comparacin con embriones enteros y su impacto en el incremento de la sobrevivencia embrionaria total en ovinos
Tipo de embrin Nmero de embriones enteros originales Nmero de Nmero de semi fetos embriones generados y de embriones
transferidos

Sobre vivencia de los semi embriones (%) 50.3

Sobre vivencia de los embriones enteros (%) (%) 61.6

Sobre vivencia total de los embriones originales

Semi embriones 705 Embriones enteros 1252

1410

710

100.6 61.6

Fuente: 35 (1): 292. ; LYNCH, P. and A. RHODES. 1991. Large scale commercial application of bisection of sheep embryos. Theriogenology 35 (1): 292.

1252 771 Vivanco, et al. 1991Theriogenology

LambXL, New Zealand 1988-1992: 30 mil corderos generados a partir de 300 donantes. Promedio 20 cras por donante por ao. Australian Texel Corporation, Australia 1993-1995: 10 mil corderos generados a partir de 300 donantes en 18 meses, promedio 22 corderos por donante

Biseccin de embriones de bovino in vitro sexados

Vivanco et al. 1997. AgReseach Ruakura Research Station, NZ.
Nmero de embriones originales Embriones bisectados despus de sexado Embriones bisectados sin sexado 19 Nmero de mitades de embrin obtenidas 38 % de preeces logradas de las mitades (12/38) 31.57 % de preez de los embriones originales (12/19) 63.15

17

34

(12/34) 35.29

(12/17) 70.59

Considerando que el promedio de embriones in vitro, no bisectados produce 50.0% de preez, la biseccin sexada increment en 26% la produccin de terneros; la biseccin no sexada increment en 41% la produccin de terneros.

Grupo de recipientes con terneros nacidos de embriones clonados por biseccin embrionaria. Vivanco et al. 1997.AgResearch, Ruakura, NZ

Multiplicacin (clonado) de embriones por disgregacin de blastmeros en embriones tempranos

Multiplicacin (clonado) de embriones sexados por disgregacin de blastmeros en embriones tempranos

Tcnica que amerita mayor desarrollo por su potencial en clonacin secuencial

Clonacin de embriones por enucleacin de ovocitos (n) y transferencia nuclear de blastmeros (2n)
Mtodo abierto: sin zona pellucida Mtodo cerrado: con zona pellucida

Mtodo abierto en embriones in vitro

VIVANCO, H. W., M. Olifent, J. Forsyth, M. Berg, D. Saywell, N. Li and R. Tervit. 2000. Production of Live Normal Calves From Embryo Reconstructs Generated by Nuclear Transfer of Blastomeres from In Vitro Produced Embryos. 14th International Congress on Animal Reproduction. Stockholm, 2-6 July 2000. Abstracts Vol 2, 19:15.

Clonacin de Embriones por transferencia nuclear de blastmeros, mtodo abierto Vivanco et al. 2000

Blstula normal con zona pellucida y blstula reconstruida por TN sin zona pellucida

Paricin de recipientes portadoras de terneros procedentes de embriones clonados por transferencia nuclear de blastmeros. Ruakura NZ 2000

Eficiencia de clonacin de embriones in vitro por transferencia nuclear de blastmeros por el mtodo abierto. Vivanco et al.2000. 14th International Congress on Animal Reproduction. Stockholm, 26 July 2000. Abstracts Vol 2, 19:15.

Tipo de Embrin

N de sets para fusin

% de fusin

% de produccin embrionaria (82/521) 15.7 (33/180) 18.3

Numero de embriones transferidos 81

% de nacimientos de terneros vivos (8/81) 10.0 (1/25) 4.0

Fresco

584

(521/584) 89.2 (180/199) 90.4

Vitrificado 199

25

Clonacin de embriones por enucleacin de ovocitos (n) y transferencia nuclear de blastmeros (2n) Mtodo cerrado: con zona pellucida Enucleacin del ovocito

Clonacin de embriones por enucleacin de ovocitos (n) y transferencia nuclear de blastmeros (2n) Mtodo cerrado: con zona pellucida
Transferencia nuclear usando los blastmeros

Eficiencia de clonacin de embriones in vivo por transferencia nuclear de blastmeros por el mtodo cerrado. F.L. Barnes, C.R. Looney, M.E. Westhusin.1991. Revisin en Embryo Transfer Volumen 6, Nmero 1, Veterinary Learning Systems Co. USA. Tipo de embrin donante % de embriones de blastmeros logrados en base a fusiones realizadas % de preez lograda en base a embriones reconstruidos transferidos (88/280) 31.0 (35/111) 31.0 (15/48) 31.0

Embrin in vivo fresco

(337/1629) 21.0

Embrin in vivo (182/1375) congelado/descongelado 13.0 Embrin producido por clonacin serial (61/424) 14.0

Grupo de tres terneros clones producidos por transferencia nuclear de blastmeros, mtodo cerrado y usando sistema in vivo. Barnes, C.R. Looney, M.E. Westhusin.1991

CLONACION DE INDIVIDUOS

Mtodo de clonacin de individuos

Enucleacin de ovocitos (n) y construccin de embriones mediante Transferencia Nuclear (TN) de clulas somticas (2n). Fuentes de clulas donantes:
Clulas fetales Clulas de animales jvenes Clulas de animales adultos Clulas de animales muertos

Primer clon de mamfero adulto : Oveja Dolly (por el Roslin Institute, Dr. Ian Wilmut, Dublin, Escocia, 1996)

DOLLY, primer clon de mamfero producido en el mundo, nacida el 5 de Julio de 1996, copia de una oveja DorsetxFinn en base a clulas de la glndula mamaria de la donante.

Dolly al estado adulto, con una de sus cras (Bonnie) nacido en Abril de 1998. Luego Dolly tuvo 3 cras ms desde 1999. Dolly fue sacrificada el 14 de Febrero de 2003 a los 6 aos de edad debido a padecimiento de artritis

Clones de ovinos por transferencia nuclear. Ruakura Research Centre. NZ. D. Wells 1996

Sin fama ni gloria por haber nacido el 28/11/1996, 20 semanas despus de Dolly .

Primer vacuno clonado en el mundo: Clonacin de la vaca Lady produciendo LC 1 (Elsie 1) nacida el 31 de Julio de 1998 en Agresearch/arTech Ruakura Research Station, NZ. 1998
David N. Wells, Pavla M. Misica, H. Robin Tervit and William H. VIVANCO. Reproduction Fertility and Development 1998. 10(4) 369378.
WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; FORSYTH, J.T.; BERG, M.C.; LANGE, J.M.; TERVIT, H.R. AND VIVANCO, H. W. 1999. Theriogenology 51 (1): 217

GALILEO: Primer clon en el mundo de un toro probado, producido en Italia por CIZ-LTR Dr. Cesare Galli. Primer clon en el mundo obtenido de glbulos blancos del donante PRIMER TORO PRESO POR SER CLON Y ESPERAMOS SEA EL ULTIMO EN IR PRESO!!!

Galli, C., Duchi, R., Moor, R.M. and Lazzari, G. (1999). Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning 1: 161-170.

PROMETEA

Primer clon de equino producido en el mundo por el CIZ-LTR de Italia, Dr. Cesare Galli. La madre nodriza de Prometea es a la vez la vez donante de las clulas para la produccin de Prometea, es decir es su madre nodriza y su original de Prometea. Lagutina, G. Crotti, S. Colleoni, N. Ponderato, R. Duchi, G. Lazzari and C. Galli. (2003). Nuclear transfer in horses. Theriogenology 58 (1), 269.

Cronologa de la clonacin en mamferos

1997 Ovinos: La oveja Dolly, Escocia 1998 Vacunos: Elsie clon de Lady, NZ 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2009 Ratones Caprinos Cerdos Mouflon & Gaur Conejo & gato Mula, Rata & Yegua (Prometea) Venado Rojo & Gato monts Perro Mink Lobo & Bfalo Camello

El proceso de clonacin de individuos por transferencia nuclear

Cloned offspring

Clulas somticas

Enucleacin de ovocito (n) y transferencia nuclear (2n)

Enucleacin, sujecin del ovocito

Enucleacin, aspiracin del ncleo del ovocito con ayuda de epifluorescencia

Enucleacin, remocin del ncleo del ovocito

Transferencia nuclear, introduciendo el ncleo de la clula donante al ovocito enucleado

Transferencia Nuclear completada con ncleo 2n posicionado

Reprogramacin nuclear
Poner la clula somtica adulta al estado similar al de una clula embrionaria pre diferenciada.
Depende de la habilidad del citoplasma del ovocito de poder remodelar la estructura de la cromatina y apropiadamente reprogramar los patrones de expresin gentica de la clula donante

Fusin y Activacin
Fusin Obtenida por 2 pulsaciones elctricas de 2.25 kV/cm por 15 sec Activacin Obtenida qumicamente por incubacin en 5 M ionomycin seguida por cultivo en 2 mM dimethylaminopurine (6-DMAP)

Aparato de electrofusin

Eficiencia de la transferencia nuclear de clulas somticas para clonacin en bovinos

Clon actual % Blstulas Clon meta actual IVP

40 20 8%

50 50 25%

40 45 18%

% Sobrevivencia embrionaria Eficiencia total

Tasas de preez
100

80

Tasa de Preez

AI
60

IV P
40

NT
0 40 80 120 160

Gestacin (das)

Eficiencia de clonacin de bovino adulto vs. Dolly vs. IVP

Dolly Elsie Meta en clonaci n 50 50 Efic. De IVP

% Blastulas % Sobrevivencia embrionaria Eficiencia total

10 4

40 25

40 50

0.4%

10%

25%

20%

Factores que afectan la eficiencia de clonacin

Estado del ciclo celular
G0 vs G1

El tipo de clula
fibroblastos vs clulas foliculares

Acondicionamiento citoplasmtico Sistema de cultivo in vitro

Observaciones y problemas an por resolver sobre la clonacin de individuos por transferencia nuclear de clulas somticas

Problemas de la clonacin: Placentacin Anormal

Alantoides
retardado, no-existente, pobremente vascularizado

Desarrollo anormal del placentoma

Perdidas alrededor de la implantacin Algunos placentomas alargados Alargados vasos umbilicales Membranas edematosas hydroalantoides

Nmero de carnculas al da 100

160

Nmero de carnculas

120

80

40

AI

IV P

NT

Peso de las carnculas al da 100

6

Peso promedio de las carnculas Kg

AI

IV P

NT

TN

IA

Alrededor del 83% de los terneros G0 nacidos en AgResearch son saludables y sobreviven hasta el destete
Las perdidas estn asociadas con: Manejo del parto Peso al nacimiento incrementado Se piensa que un sub set de clones tiene una precaria expresin de IGF2/H19 y lactogeno placentario en el trofoblasto Variable incidencia de problemas de rin, corazn e hgado

Son todos los clones producidos por transferencia nuclear iguales?

Fenotipo = Genotipo + Ambiente

Diferencias en genotipo
mitocondrial DNA inactivacin del cromosoma X Cambios de genes y cromosomas en clulas en cultivo Reprogramacin nuclear: cambios epigenticos

Diferencias ambientales
Factores citoplasmticos del ovocito Utero de la recipiente

Ambiente post-natal

Reproduccin sexual normal entre clones

Aplicaciones de la clonacin en mamferos de granja y otras especies

La tecnologa de clonacin a su estado actual permite ya su uso estratgico en mejoramiento animal y permite la multiplicacin de animales transgenicos

Aplicaciones de la clonacin de mamferos de granja y otras especies animales

Rpida multiplicacin de animales de alto valor gentico para la produccin Incremento de la tasa de mejora gentica clonando individuos de alta produccin y clonando embriones de alto valor gentico estimado Clonacin de padrillos probados para uso en MN Establecimiento de hatos especiales Facilitacin de pruebas de progenie y del uso de machos selectos en sistemas de mejoramiento Cambio gentico y establecimiento de hatos lite rpidamente Uniformidad en la produccin (F = G + E) Preservacin de razas y/o especies en peligro de extincin. Produccin y multiplicacin de animales transgnicos

Primer vacuno clonado en el mundo: Clonacin de Lady con fines de rescate de raza ENDERBY en extincin en Nueva Zelanda

40S New Zealand

Enderby Is.

50S

Antarctic Circle Antarctica

Lady, Elsie (LC1), Derby, Drs. Wells y Vivanco, Ruakura NZ 1998

Copias adicionales de Lady: LC2, LC3,LC4,LC5,LC6 (Wells, Ruakura NZ 1999)

Anlisis Microsatelital de los clones de Lady

Lady cells Cloned calves Recipients

BMS2113

RM216

Clonacin de animales de alta produccin para formar hatos lite

Elizabeth, vaca campeona en produccin lechera de NZ, con el mayor nmero de copias nacidas (ms de 40 al ao 2000. Wells et al Ruakura NZ)

Efecto de la clonacin en la tasa de mejora gentica

Clonacin de machos lite para monta natural

De gran uso potencial en ovinos, vacunos de carne y alpacas en sistemas extensivos y/o comunidades Copias de machos probados o clonacin embrionaria de embriones selectos con marcadores genticos

NZ: clonacin de toro probado

- Clonacin del toro Holstein de mayor prueba gentica de NZ
Toro de ms alta prueba de progenie en NZ 3 copias del toro probado

Clonacin como instrumento en la generacin y multiplicacin de animales transgnicos

Promoter or driver Gene

Gene construct

Somatic cells

Combinando transgenesis y clonacin

Journal of General Virology, (2006), 87, G. Yu y Col. Instituto de Bioqumica y Biologa Celular, Shangai China Cabras clonadas y genticamente modificadas con disrupcin funcional del gen para produccin de priones

PRNP-/- terneros que no producen priones

J.A. Richt et al. 2007 USDA Ames IOWA

Nature Genetics (2004), Nature Biotechnology (2007)

Aplicacin de gene Targeting secuencial para eliminacin de genes: Produccin de los primeros vacunos genticamente modificados que no producen PRIONES y por lo tanto son inmunes a la enf. de la vaca Loca.

Clonacin para formacin de hatos o rebaos especiales: Incremento de la calidad nutricional y rendimeinto industrial de la leche,produccin de vacas clonadas genticamente modificadas para mayor produccin de casena AgResearch produjo el primer set a nivel mundial de vacas clonadas y geneticamente modificadas para la produccin de leche DISEADA con mayor nivel de caseina, mediante el aumento de copias del gen para produccin de caseina en la leche

Leche de las vacas con alto nivel de caseina VS. el control

control TG control TG

Leche entera

Leche descremada

Produccin de leche teraputica

AgResearch, NZ produjo los primeros clones transgnicos para la produccin de la protena humana recombinante mielina protena bsica( = rhMBP) para el tratamiento de mltiple esclerosis en humanos

Uso de clonacin en investigacin

Produccin de animales genticamente idnticos para estudios experimentales Trabajos cientficos en reprogramacin nuclear

El futuro
Optimizacin de la produccin de embriones in vitro y la clonacin Uso de marcadores genticos a nivel embrionario, reproducir solo los embriones que tienen el sexo y la composicin gentica deseada Modificacin de genes (transgenesis): produccin de protenas humanas en animales, incremento de genes para mayor produccin, eliminacin de genes no deseables Produccin de clulas Totipontes eternas ( Stem Cells) y gobernar su especializacin. Produccin de rganos humanos en animales ( Xenotransplantacion)

GRACIAS

Preguntas?

PREGUNTAS ?