PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGA INDUSTRIAL AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS HUMANO Escherichia coli

y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE

LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO SANDRA PATRICIA VALENCIA CRDENAS Directora: ADRIANA MATIZ VILLAMIL BACTERIOLOGA M. Sc.

Codirectora: MARA MERCEDES MARTNEZ MICROBILOGA M. Sc.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL BOGOT D.C. DICIEMBRE DE 2007

NOTA DE ADVERTENCIA Artculo 23 de la resolucin No. 13 de julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y la moral catlica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGA INDUSTRIAL AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE

LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO SANDRA PATRICIA VALENCIA CRDENAS

Aprobado:

___________________________ Dra. Adriana Matiz Villamil Directora __________________________ Dra. Andrea Aguirre Jurado

_______________________ Dra. Mara Mercedes Martnez Coodirectora _______________________ Dr. David Gmez Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE

LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO SANDRA PATRICIA VALENCIA CRDENAS

Aprobado:

_________________________________ Dra. ANGELA UMAA MUOZ.,M.Phil Decano Acadmico Facultad de Ciencias

____________________________ Dra. Janeth Arias Directora Carrera de Microbiologa

A Dios por brindarme apoyo para alcanzar todas mis metas. A mi mama por ser compaera y amiga por su apoyo y compaa durante la elaboracin de este trabajo de grado A mi papa por ser la inspiracin de todo lo que hago A mis tios por la confianza y apoyo constante a pesar de la distancia A mis amigas por su amistad y por compartir conmigo esta gran experiencia Leidy Andrea Cepeda Patio

A Dios por haberme acompaado en el transcurso de mi carrera. A mi mami por darme apoyo en los momentos mas difciles y por infundirme paciencia cuando cre que esto no sera posible. A mi papi por darme ejemplo de no desfallecer y luchar por lo que se quiere. A mis amigos que me brindaron una sonrisa y sus palabras en el momento justo. Por ltimo a mis compaeros de laboratorio por su ayuda incondicional en los momentos de desesperacin. Sandra Patricia Valencia Crdenas.

AGRADECIMIENTOS A Bioagrcola del Llano S.A. E.S.P., empresa de aseo de Villavicencio por la colaboracin prestada durante el desarrollo de este proyecto. A la Dra. Adriana Matiz directora del presente proyecto, por su dedicacin e infinita paciencia, aportando sus conocimientos para el desarrollo de este trabajo. A la Dra. Maria Mercedes Martnez codirectora del presente proyecto, por el aporte de sus conocimientos y su paciencia para concluir con xito este trabajo. A todos aquellos que de una u otra forma colaboraron con nuestro trabajo e hicieron posible que este se llevara a cabo.

DICIEMBRE DE 2007

TABLA DE CONTENIDO Pg. 1.-INTRODUCCIN 2.- MARCO TERICO COMPOSTAJE 2.1.1 Beneficios del Uso del Compost 2.1.2 Factores de Importancia

1 2 2 2 3 3 4 5 6 6 7 7 7 8 8 8 8 9 9 10 12 12 14 14 16 17 PATGENOS

Equilibrio carbono/nitrgeno Temperatura Humedad pH Aireacin Tamao de partcula Ambiente Porcentaje de lquido efectivo (% LE)

2.2 PROPIEDADES FSICO QUMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES 2.2.1 Propiedades Fsicas. 2.2.2 Propiedades Qumicas. 2.3 ESTRUCTURA DE LPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS

Lpidos simples Lpidos complejos

2.4 LIPASAS 2.4.1 Mtodos de Determinacin de Lipasas 2.4.2 Enzimas Termoestables 2.4.3 Enzimas en el Tratamiento de Residuos 2.4.4 Importancia Industrial de las Enzimas Lipolticas 2.4.5 Microorganismos reconocidos Biotecnolgicamente como Productores de Lipasas 2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLGICOS. 2.6 19 MICROORGANISMOS

3.- JUSTIFICACIN 4.- OBJETIVOS 4.1 Objetivo General. 4.2 Objetivos Especficos. 5.- METODOLOGA 5.1 REACTIVACIN DE CEPAS 5.2 FASE DE LABORATORIO 5.2.1 MUESTREO 5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipoltica 5.2.2.2 Identificacin microscpica y macroscpica de las colonias 5.3 BANCO DE CLULAS PRIMARIO (Conservacin de Cepas) 5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO 5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO 5.5.1 Produccin del inculo 5.5.2 Fermentacin Discontinua LIPOLTICA 5.6.1 Curva Patrn de p-nitrofenol 5.6.1.1 Evaluacin y estandarizacin cuantitativa de actividad lipoltica 5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimtica Salmonella sp 5.7.1 Determinacin de microorganismos patgenos Salmonella sp 5.7.2 Determinacin de Escherichia coli 5.8 34 5.8.1 Determinacin de pH y Temperatura 5.8.2 Anlisis Fsico Qumico de las muestras 6. RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1. Procesamiento de las muestras 6.1.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipoltica 6.1.2 Identificacin macroscpica y microscpica de las cepas FASE DE

21 23 23 23 24 24 24 24 25 25 26 26 26 28 28 28 28 28 29 29 31 32 33 CAMPO 34 34 36 36 36 38

5.6 TCNICA COLORIMTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA ACTIVIDAD

5.7 DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS Escherichia coli y

6.1.3 Criopreservacin de cepas 6.1.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO 6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO 6.3 CURVA DE CALIBRACIN 6.3.1 Actividad Lipoltica 6.3.1.1 Estandarizacin del tiempo de contacto entre sustrato y extracto crudo 6.3.1.2 Estandarizacin de diferentes concentraciones de sustrato

40 40 42 45 45 45 46 49

6.3.1.3 Estandarizacin con diferentes volmenes de extracto crudo 20 ul, 500 ul y 700 ul 6.4 Toma de muestras 6.4.1 Determinacin de pH y temperatura 51 52 55 6.5.1 NMP de Salmonella sp con medio Rappaport Vassiliadis semislido modificado 6.5.2 NMP Escherichia coli 6.6 ANLISIS FSICO QUMICOS 7.- CONCLUSIONES 8.- RECOMENDACIONES 9.- REFERENCIAS Anexos 56 59 61 64 65 66 75

6.5 ANLISIS DE MICROORGANISMOS PATGENOS Escherichia coli y Salmonella sp

LISTA DE TABLAS Pg. Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminacin de patgenos comunes en materiales orgnicos. Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas Tabla 3.Tabla gua para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp Tabla 4 Cepas presuntivas lipolticas Tabla 5. Identificacin macroscpica y microscpica de las colonias Tabla 6. Promedio de resultados de las pruebas antagnicas Tabla 7 a,b,c Promedio de No de colonias caractersticas en medio XLT4 y BS Tabla 8. Promedio de resultados de Escherichia coli materias primas Tabla 9. Promedio de resultados de Escherichia coli muestras finales 5 17 32 37 39 41 57 60 60

LISTA DE FIGURAS Pg. Figura 1. Mecanismos de accin de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000). Figura 2 a. Cepa aislada L1 Figura 2 b. Cepa aislada L2 Figura 2 c. Cepa aislada L3 Figura 3 a. Cepa L1 Bacilos Gram negativos Figura 3 b. Cepa L2 Bacilos Gram negativos filamentosos Figura 3 c. Cepa L3 Bacilos Gram negativos Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolticas sin halo de inhibicin Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolticas con las cepas del inculo Figura 6. Curva de produccin de biomasa en funcin del tiempo Cepa L3 Figura 7. Curva de crecimiento Cepa L2 Figura 8. Tiempo de Contacto Figura 9. Evaluacin de las diferentes concentraciones de sustrato Figura 10. Curva de UL al 1 y produccin de biomasa en funcin del tiempo Figura 11. Segunda evaluacin de diferentes concentraciones de sustrato Figura 12 Curva UL al 1.5 y produccin de biomasa en funcin del tiempo Figura 13. Estandarizacin de los diferentes volumenes de extracto crudo Figura 14. Estandarizacin de los diferentes volumenes de extracto crudo Figura 15. Conformacin de las pilas Figura 16. Medicin de temperatura de residuos orgnicos Figura 18. Medio semislido Rappaport V con halo de aclaramiento Figura 19. Medio XLT4 con colonias presuntivas. Figura 20. Medio BS con colonias presuntivas Figura 21. Resultados de bioqumicas para identificacin de Salmonella sp Figura 22. Turbidez e indol positivo Figura 23. Fluorescencia positiva 11 38 38 38 39 39 40 41 42 43 44 46 47 47 48 48 50 50 52 52 53 56 57 57 58 59 60

Figura 17. Resultados de pH y temperatura vs tiempo durante el proceso de compostaje

LISTA DE ANEXOS Pg. Anexo 1. Medio Leche- Almidn al 1% Medio Lquido TSB Medio Rappaport Vassiliadis Modificado Medio Lecitina Anexo 2. Promedios de Temperatura y pH de las 3 rplicas Anexo 3. Preparacin de Buffer Fosfato Concentracin 1 M Anexo 4. Curva Patrn p-nitrofenol Anexo 5. Promedio de absorbancias de actividad enzimtica Anexo 6. Recuentos de las cepas aisladas Anexo 7. Resultados pruebas de antagonismo Anexo 8. Pruebas Bioqumicas de las Colonias Positivas para Salmonellla sp Anexo 9. Requisitos especficos de fertilizantes o abonos orgnicos minerales Y enmiendas orgnicas segn NTC 5167 (Icontec 2004) Anexo 10. Anlisis estadstico Anexo 11. Metodologa 92 97 98 77 77 77 78 79 83 84 85 89 90 91

RESUMEN La Empresa Bioagrcola del Llano S.A E.S.P ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposicin de residuos slidos urbanos (RSU) generados en esta regin, como residuos de plaza, industria pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de transformacin de estos residuos mediante el compostaje aerbico, produciendo un bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones segn la norma NTC 5167. Esta empresa ha venido desarrollando un importante proyecto de aprovechamiento y transformacin de residuos urbanos slidos mediante el proceso de compostaje enriquecido con inoculantes microbianos termfilos, compuestos por 14 cepas amilolticas y proteolticas. Este proyecto de investigacin se fundamenta en el aislamiento de microorganismos lipolticos, a partir de 3 replicas de pilas de compostaje de residuos orgnicos (plaza 55%, poda, contenido ruminal y cascarilla de arroz). Igualmente se estandariz la tcnica que permiti la evaluacin y determinacin de la actividad lipoltica generada por la cepa 3, mediante el manejo de diferentes tiempos de contacto entre la enzima producida y el sustrato (p-nitrofenil), como fueron 30 minutos y 60 minutos, as como tambin fueron utilizados diferentes concentraciones de sustrato 0.08% (p/v), 0.5% (p/v), 1% (p/v), 1.5% (p/v) y 2%(p/v). Los resultados determinaron como tiempo ptimo de contacto 30 minutos pero en las diferentes concentraciones de sustrato y volumen demuestra, no se presentaron diferencias significativas. De la misma manera, la cepa 3 obtuvo UL del orden de 30.73UL corroborando una actividad muy baja relacionada con su biomasa que fue de 30*10 9 UFC/ml. As mismo se llev a cabo un anlisis de microorganismos patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp al inicio y al final del proceso arrojando resultados positivos al inicio y al final y un NMP de Salmonella sp < a 0.006473 NMP/4g. Igualmente se hizo una caracterizacin fisicoqumica al producto obtenido (bioabono) en Agrilab, el cual arrojo resultados de relacin C/N de 8 %, humedad de 42.03%, N 1.86%,

P 1.32%, K 2.53%; N orgnico 1.59% y metales pesados como Cobre 28.6 ppm y Zinc 118.3 ppm valores cercanos a lo exigido a la norma Icontec.

ABSTRACT "Bioagrcola del Llano SA ESP" located in Villavicencio (Meta) has been developing since 2003 a comprehensive plan regarding the provision of municipal solid waste (MSW) generated in this region, such as waste plaza, livestock industry, kitchens , among others. That is why, now being carried out processing of this waste through aerobic composting, producing a bioabono rich in nutrients and good conditions under the rule NTC 5176. The company has been carrying out a major project for the use and conversion of municipal solid waste through composting process enriched inoculators microbial thermophilic, composed of 14 strains amilolityc and proteolityc. This research project is based on the isolation of microorganisms lipollitycs, from the assembly of 3 replicas of bacteria composting of organic waste (plaza 55%, pruning, rumen contents and cascarilla). They also standardized technique that permitted the evaluation and determination of the activity lipolityc generated by the strain 3, through handling different times of contact between the enzyme and substrate produced (pnitrofenil), as were 30 minutes and 60 minutes, they were used as well as different concentrations of substrate 0.08% (w / v), 0.5% (w / v), 1% (w / v), 1.5% (w / v) and 2% (w / v). The results identified as optimum time to contact 30 minutes but in different concentrations of substrate and volume shows there was no significant difference. In the same way, the strain 3 obtained UL order 30.73 UL corroborating a very low related to biomass that was 30 * 109 CFU / ml. It also took out an analysis of human pathogens Escherichia coli and Salmonella sp at the beginning and end of the process yielding positive results at the beginning and end and an MPN Salmonella sp <a 0.006473 NMP/4g. They also made a physicochemical characterization on the product (bioabono) Agrilab, which results daring relationship C / N 8% moisture 42.03%, N 1.86%, P 1.32% K 2.53%, organic N 1.59% heavy metals such as copper 28.6 ppm and zinc 118.3 ppm values near what is required by Icontec.

1.-INTRODUCCIN La generacin de residuos slidos municipales, vara en funcin de diferentes factores asociados a los niveles de ingreso, hbitos de consumo, desarrollo tecnolgico y calidad de vida de determinada poblacin, es por esto, que en la actualidad se busca una eliminacin segura de dichos residuos para evitar problemas de salud pblica y ambiental. La Empresa Bioagrcola del Llano S.A E.S.P. ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposicin de residuos slidos urbanos (RSU) generados en esta regin, como residuos de plaza, industria pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de transformacin de estos residuos mediante el compostaje aerbico, produciendo un bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones segn la norma NTC 5176 (Anexo 10). Este sistema ha sido optimizado, mediante el uso de un inoculante biolgico acelerante, compuesto por 14 cepas nativas termoflicas con actividad proteoltica y amiloltica (Galindo et al., 2005). Este inoculante ha sido evaluado con diferentes porcentajes de materias primas utilizadas, en la bsqueda de la optimizacin del proceso y por ende, en la calidad del producto obtenido (bioabono), gracias a la actividad enzimtica proteoltica y amiloltica de los microorganismos del inoculante. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigacin, fue aislar microorganismos nativos con actividad lipoltica, con el fin de potencializar la eficiencia del inoculante utilizado en la Empresa Bioagrcola del Llano, identificando as mismo patgenos humanos, para que de esta manera se logre obtener un compost con mejores caractersticas fisicoqumicas, libre de patgenos, que pueda ser utilizado en cultivos propios de la regin, contribuyendo de esta manera al desarrollo agroindustrial.

2.- MARCO TERICO 2.1 COMPOSTAJE El compostaje es la descomposicin biolgica y la estabilizacin de sustratos orgnicos, bajo condiciones controladas que desarrollan temperaturas termfilas como un resultado del calor producido biolgicamente, y genera un producto final que es estable, libre de patgenos y semillas de plantas y puede ser aplicado benficamente al suelo (Stefan et al., 2006). En el compostaje la fase slida del material orgnico sirve de soporte fsico, matriz de intercambio de gases, fuente de nutrientes orgnicos e inorgnicos, vertederos para los productos residuales metablicos y aislamiento trmico (Sylvia et al., 1998). Los principales objetivos del proceso son estabilizar materia orgnica putrescible, conservar la mayor cantidad de nutrientes y materia orgnica como sea posible, y generar un producto uniforme y relativamente seco conveniente para usar como acondicionador de suelo y suplemento para jardines o para disponer en tierra. 2.1.1 Beneficios del Uso del Compost

El compost se obtiene industrialmente por la transformacin biolgica de la materia orgnica. De esta transformacin resulta un bioabono o acondicionador de suelos, apto segn las caractersticas fisicoqumicas y microbiolgicas, para la fertilizacin, tanto por la mejora del suelo como soporte fisicoqumico, como en relacin con la capacidad de retencin de agua, y presencia de agregados y microorganismos (MacGregor et al., 2001). Los cidos resultantes de los procesos de degradacin de la materia orgnica disuelven parte de los productos minerales del suelo y los hacen aprovechables para la nutricin de las plantas. Los organismos actan como promotores de crecimiento, controladores biolgicos y remediadores de suelo. El nitrgeno contenido en el compost se encuentra en forma asimilable por las races y puede ser retenido en el horizonte A - B (capa cultivable del suelo), evitando ser

arrastrado por las aguas de lluvia o de riego a capas ms profundas fuera del alcance del sistema radicular (Macgregor et al., 2001). Igualmente, la modificacin de las caractersticas fsico - qumicas del terreno hace que se incremente el grado de disponibilidad del fsforo y potasio para la planta. El compost incorpora al terreno micro y oligo elementos (cobre, magnesio, zinc, manganeso, hierro, boro, etc.) que son muy necesarios para la actividad y desarrollo vegetativo de las plantas. Otra caracterstica importante es que reduce la necesidad de pesticidas qumicos al producir plantas saludables que son menos atacables por plagas de insectos, enfermedades y heladas (Trautmann y Olynciw, 1999). Fsicamente, la aplicacin de compost reduce la erosin y mejora la estructura del suelo, la retencin de agua y el drenaje (Vsquez, 2003). 2.1.2 Factores de Importancia

Hay varias condiciones crticas para la elaboracin ptima de compost. Debe haber una humedad adecuada (50-60% de contenido de agua), evitando el exceso (70% o superior), puesto que interfiere con la aireacin y reduce el autocalentamiento. La relacin carbononitrgeno no debera ser mayor de 40:1(Atlas y Bartha, 2001). Equilibrio carbono/nitrgeno

En la composicin elemental del sustrato, se encuentra la cantidad relativa de carbono, nitrgeno, fsforo, azufre y otros nutrientes. Adems de la composicin, es necesario conocer la calidad de los sustratos para determinar el rango de descomposicin (Silvya, et al 1998). Conviene mezclar materiales de origen vegetal y animal para procurar un contenido aceptable de todos los nutrientes esenciales. Es importante mantener un buen equilibrio entre los materiales ricos en carbono y los ricos en nitrgeno, para que la relacin C/N se mantenga entre 25 y 35. Una relacin elevada retrasa la velocidad de humificacin y un exceso de N ocasiona fermentaciones no deseables. La mezcla debe ser rica en celulosa, lignina (restos de poda, pajas y hojas muertas) y en azcares (hierba verde, restos de

hortalizas y orujos de frutas). El nitrgeno ser aportado por el estircol, el purn, las leguminosas verdes y los restos de animales de mataderos. Todo se debe mezclar de manera tan homognea como sea posible materiales pobres y ricos en nitrgeno, y materiales secos y hmedos (Vsquez, 2003). Un contenido menor de nitrgeno no permite la formacin de biomasa microbiana suficiente. Una proporcin excesiva de nitrgeno (C:N= 25:1 o menos) causa la volatilizacin del amonio, produce malos olores, y baja el valor fertilizante del compost resultante (Atlas y Bartha, 2001). Temperatura

Al inicio del proceso de desprende gran cantidad de calor, etapa termfila, la temperatura en el material a compostar puede subir hasta los 60 70C, la actividad bacteriana aumenta rpidamente. Debido al aumento de temperaturas, una gran cantidad de agua del material se evapora. El oxgeno tiene que llegar a todo el material, por lo que el material requiere de una buena ventilacin. En esta etapa los microorganismos atacan la materia ms fcilmente biodegradable (Roder, 1998). La actividad metablica de los microorganismos, al actuar sobre los sustratos orgnicos, libera energa. Parte de la energa generada al interior de la pila de compostaje es utilizada por los microorganismos, y otra parte es liberada al ambiente en forma de calor, es por esto que el incremento de la temperatura es reflejo de la actividad microbiana sobre la materia orgnica. Uno de los efectos de la temperatura sobre la pila de compostaje es la eliminacin de microorganismos patgenos (Fundases, 2006). Es importante tener en cuenta que para determinado grupo de microorganismos existen rangos de temperatura y tiempos de exposicin (tabla 1). Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminacin de patgenos comunes en materiales orgnicos.
Microorganismo Salmonella sp. Escherichia coli Brucela Abortus Corynebacterium diphtheriae Tiempo 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora Temperatura 55C 55C 55C 55C

Fuente: EPA, 1992 El diseo de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destruccin de patgenos, ya que la presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura. Estos organismos prefieren temperaturas por debajo de los 42C, ya que normalmente viven a la temperatura corporal del hombre y animales, o a la temperatura ambiental de las plantas. En la fase termoflica del compostaje se busca eliminar patgenos con el fin de minimizar focos de contaminacin y establecer un bioabono ptimo para ser aplicado a cultivos de consumo directo. Las tcnicas para la preparacin de compost se les sealan como muy efectivas para el control de microorganismos patgenos y la tasa de mortalidad de estos microorganismos esta en funcin del tiempo y de la temperatura. Cuando el proceso de compostaje funciona correctamente se pone de manifiesto que la mayora de los organismos patgenos mueren cuando se exponen todas las partes de la pila a temperaturas de 55 C (Luque, 1997). Humedad

El agua es requerida por los microorganismos para desarrollar sus funciones metablicas, adems, es utilizada como vehculo de trasporte de nutrientes y productos de desecho. En la pila de compostaje, el balance de la humedad es importante, ya que bajos valores afectan el metabolismo microbiano, mientras que altos valores de humedad, conllevan a la acumulacin de agua en las cavidades intersticiales, dificultando la difusin de O2 y favoreciendo las condiciones de anaerobiosis. As pues, la humedad de la pila de compostaje debe oscilar entre el 60 al 70% (Fundases, 2006). pH

El valor del pH no slo determina la existencia de una ecologa microbiana particular sino que su nivel y sus variaciones pueden inhibir fuertemente la actividad de las bacterias.

Un pH entre 5.5 y 8.5 es ptimo a los microorganismos del compost. En las fases tempranas del proceso los cidos orgnicos excretados por los hongos y bacterias aumentan, hay un crecimiento fngico y se empieza la degradacin de lignina y celulosa. Si el sistema se vuelve anaerbico la acumulacin cida puede bajar el pH hasta 4.5 y limitar la actividad microbiana; en estos casos la aireacin es importante para volver el pH hasta sus rangos ptimos (Trautmann y Olynciw, 1999). As mismo es importante resaltar como se menciona en estudios recientes que la actividad enzimtica lipoltica se ve afectada por factores como el pH, la temperatura, la composicin del medio y la aireacin, mostrando mayor afinidad por pHs alcalinos debido a que se presenta una mejor solubilizacin de los productos de hidrlisis formados (Chahinian et al., 2005). Aireacin

Se trata de un proceso aerobio (requiere oxgeno) por lo que es importante mantener una aireacin adecuada. Para ello, se han de mezclar materiales pastosos (lodos de depuradora, estircol) con otros que aumenten la porosidad (paja, virutas, etc). Los materiales de excesivo tamao (restos de poda), es conveniente triturarlos previamente para que descompongan ms fcilmente. Una forma de mantener una adecuada aireacin durante el compostaje es mediante volteos peridicos o con aireacin forzada. El material de los materiales a compostar debe variar entre los 35 y los 75 mm (Trautmann y Olynciw, 1999). Otra forma de oxigenar las pilas de compost son los mtodos de aireacin directa, ya sea por succin o por presin (Roder, 1998). Tamao de partcula

La actividad microbiana generalmente ocurre en la superficie de las partculas orgnicas. Por consiguiente, el tamao de la partcula menor, con mayor rea de superficie, aumentar la actividad y sucesivamente la proporcin de descomposicin. Por otro lado

cuando la partcula es demasiado pequea se unen inhibiendo la circulacin de aire en el compost, y por ende el oxgeno disponible para los microorganismos, minimizando su actividad (Trautmann y Olynciw, 1999). Es importante tener en cuenta el tamao de las partculas, todos los tipos de residuos verdes con excepcin del pasto deben ser triturados para optimizar el proceso de degradacin ya que sta otorga propiedades como agrandar la superficie para que el microorganismo pueda actuar, reduciendo el material original a un volumen del 30 % (Stock, 2002). Ambiente

En climas fros y hmedos conviene situarlo al sol y al abrigo del viento, protegindolo de la lluvia con una lmina de plstico o similar que permita la oxigenacin. En zonas ms calurosas es mejor situarlo en un lugar sombreado para evitar la desecacin (Vsquez, 2003). Porcentaje de lquido efectivo (% LE)

Este parmetro se utiliza cuando hay presencia de lpidos (grasas y aceites) en los materiales a compostar debido a que ellos son lquidos a las temperaturas de tratamiento y causan interferencia en la medicin de humedad. Se ha encontrado que el porcentaje LE debe estar entre el 68% y el 70 % de acuerdo con diversos estudios (Prez, 1999).

2.2 PROPIEDADES FSICO QUMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES 2.2.1 Propiedades Fsicas. La descomposicin es llevada a cabo esencialmente en un ambiente acuoso. Los componentes solubles de los sustratos slidos y residuos del metabolismo microbiano se difunden a travs de una pelcula de humedad sobre el compost slido, el contenido de humedad ptimo para el compostaje, est generalmente entre 40 y 60%, es decir, se sita en el orden del 15 al 35% (Sztem y Pravia, 1999). Adems es importante para mejorar la

estructura y estabilidad del suelo, la textura y su permeabilidad ya que regula el balance hdrico del suelo y reduce el riesgo de erosin porque los suelos compactos se sueltan y los arenosos se compactan por la accin de la materia orgnica (Vsquez, 2003). 2.2.2 Propiedades Qumicas. La aplicacin de residuos orgnicos y desechos de una amplia variedad de actividades humanas a suelos arables ha recibido atencin alrededor del mundo por una potencial mejora en la fertilidad del suelo e incremento en el contenido de materia orgnica. Los residuos orgnicos son raramente aplicados al suelo en estado fresco o crudo. Generalmente, ellos son procesados para obtener materia orgnica estabilizada, madura, con produccin de sustancias hmicas (Gigliotti et al., 2002). En la materia orgnica procesada, una parte de las sustancias orgnicas es soluble en agua, por esta razn, un impacto inmediato de la aplicacin de materiales orgnicos sobre los suelos agrcolas es la liberacin de materia orgnica dentro de la solucin del suelo (Gigliotti et al., 2002). 2.3 ESTRUCTURA DE LPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS Los lpidos (del griego, lipos, grasa) se encuentran en todos los organismos vivos y desempean un papel indispensable en el mantenimiento de la vida. Sin embargo a diferencia de las protenas y los carbohidratos, los lpidos son en extremo polimrficos y difciles de definir estructuralmente (Horton, 2003). Aunque las estructuras de los lpidos son con frecuencia complejas, comparten en su estructura partes similares. Los lpidos ms sencillos son los cidos grasos, cidos monocarboxlicos de la frmula general R-COOH, en donde R representa una cola de hidrocarburo. Los lpidos se pueden clasificar de diferentes maneras, aunque en general se dividen en: Lpidos simples: son los que contienen uno o dos tipos de molculas diferentes, e incluyen, entre otros, a los hidrocarburos, los alcoholes, aldehdos y cidos grasos, los

eicosanoides, los polihidroxialcanoatos, las cutinas, las suberinas, los cianolpidos, los acilgliceroles (o acilglicridos), las ceras, las ceramidas, los lipoaminocidos y lipopptidos, los lpidos fenlicos, los terpenos, los alcaloides isoprenicos, las quinonas lipidicas y los esteroides (Rivera y Garca, 2007). Lpidos complejos: son aquellos que contienen glcidos en su estructura, y los que estn formados por tres o ms tipos de molculas diferentes. Incluyen a los gliceroglicolpidos, los glicerofosfolpidos, las esfingomielinas, los ganglisidos, los cerebrsidos, los lipoaminocidos glicosdicos, los acilglicsidos, los lipopolisacridos y los proteolpidos, entre otros (Rivera y Garca, 2007). De los lpidos mencionados, los cidos grasos y los acilglicridos son de especial inters. Los cidos grasos estn formados por cadenas hidrocarbonadas saturadas o insaturadas que contienen al menos un grupo carboxlico en uno de sus extremos. Estas molculas intervienen en mltiples funciones biolgicas, y estn en la base de la biosntesis del resto de lpidos (Rivera y Garca, 2007). Una variedad de lpidos anfipticos, que incluyen los glicerofosfolpidos y los esfingolpidos, son componentes de importantes de todas las membranas biolgicas (Horton, 2003). Los acilglicridos estn formados por uno, dos o tres cidos grasos esterificados a una molcula de glicerol (mono, di y triacilglicridos, respectivamente), y estn, implicados en varias funciones biolgicas: reserva energtica, aislamiento, sealizacin intra e intercelular, etc. Estos compuestos pueden ser hidrolizados mediante soluciones alcalinas (saponificacin), o mediante la actividad de unas enzimas llamadas lipasas que liberan un cido graso (Cheetham, 2005). Por otra parte, los lpidos estn envueltos en diferentes procesos biolgicos. La estructura de la membrana celular depende de la combinacin de ciertas protenas y lpidos especficos. Las enzimas lipolticas juegan un rol importante en la movilizacin de lpidos entre clulas individuales de los organismos como tambin en la transferencia de los lpidos de un

organismo a otro (Beisson et al., 2000). Los microorganismos han sido la principal fuente de extraccin de diversas enzimas. Las lipasas son parte de la familia de las hidrolasas, catalizan la hidrlisis de triacilglicridos en la interfase lpido-agua. Adems de su rol fisiolgico en la hidrlisis de grasas neutras, las lipasas catalizan la hidrlisis o sntesis enantio- y regio-selectiva de una amplia variedad de sustratos naturales tales como soya, aceite de pescado, ricino y frutas ctricas (Bjrkling et al., 1991), as mismo pueden llevar a cabo la esterificacin, interesterificacin y transesterificacin en medios no acuosos (Houde et al., 2004). Estas enzimas presentan su pH ptimo entre 8 y 9, tambin se han reportado lipasas con pH ptimo cido. En cuanto a la temperatura, la mayora trabaja apropiadamente en el rango de 30-40C, algunas son activas a temperaturas bajas como 29C. El calcio parece estimular la actividad de la mayora de las lipasas, mientras que los agentes quelantes y los iones de metales pesados las inhibe (Lpez, 1999). 2.4 LIPASAS Son usadas para hidrolizar lpidos produciendo cidos grasos y glicerol, las reacciones ms importantes en las cuales las lipasas estn implicadas son reacciones quirales debido a la posibilidad de resolver mezclas racmicas (Snchez, 1999). El mecanismo de accin de las lipasas consiste en la hidrlisis de un cido graso en presencia de alcohol obteniendo un ster y liberando agua (Figura 1). As mismo el mecanismo cataltico de las lipasas se basa en un sistema de intercambio de cargas que consta de 4 etapas. Tras la unin del sustrato, se produce el ataque nucleoflico por parte del grupo hidroxilo de la serina cataltica sobre enlace ster del lpido, lo que lleva a la rotura del enlace y a la formacin de un intermediario entre el cido graso y la serina nucleoflica. Posteriormente se libera el alcohol y se produce un segundo ataque nucleoflico por parte de una molcula de agua que ataca el enlace ster del intermediario transitorio, lo que produce la liberacin del cido graso y la regeneracin del centro cataltico (Bornscheuer, 2002).

En algunos organismos, las grasas y los aceites (triacilgliceroles) funcionan como depsitos de reserva de energa metablica. En algunos casos, los lpidos llevan a cabo funciones biolgicas como molculas individuales; en otros interactan con otras biomolculas para realizar una funcin como parte de un complejo o a un agregado. Los complejos lipdicos comprenden las lipoprotenas (partculas compuestas de lpidos y protena), y los agregados lipdicos incluyen las membranas biolgicas (capas delgadas compuestos de lpidos, protenas y algunas veces carbohidratos) (Horton, 2003). Las lipasas son una clase de enzimas de rpida produccin, poseen actualmente nuevas aplicaciones en la industria de hidrocarburos en sntesis orgnica y han expandido su penetracin en la produccin farmacutica. El primer objetivo son las lipasas bacterianas y fngicas porque stas son ms fciles de producir, modificar por tecnologa de DNA recombinante (Snellman y Cowell, 2004). Ambientalmente las lipasas son utilizadas en inoculantes como depurador de tratamientos cloacales y como tratamiento para hidrolizar grasa en residuos slidos y lquidos como una alternativa de sustitucin de productos de origen qumico (Snchez, 1999).

R1C------ OR 2 + H2O----------------- R1C-------OH----R2OH

Figura 1. Mecanismos de accin de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000). 2.4.1 Mtodos de determinacin de lipasas Las dificultades que conlleva el hecho de que las lipasas sean enzimas solubles en medio acuoso que actan sobre sustratos hidrofbicos ha llevado al desarrollo de una gran cantidad de mtodos para determinar la actividad de estas enzimas y su inhibicin, como ensayos en placas con triacilglicridos, ensayos espectrofotomtricos con sustratos naturales, derivados del p-nitrofenol o steres de resorufina, ensayos espectrofluorimtricos con anlogos de acilglicridos que contienen fluorforos como la 4metilumbeliferona (MUF) o la resorufina, ensayos cromatogrficos para la deteccin de molculas como los cidos grasos, el -naftol o el p-nitrofenol liberados por las lipasas al

hidrolizar los acilglicridos o sus correspondientes anlogos, mtodos, basados en la neutralizacin de la acidez generada por los cidos grasos libres, mtodos tensiomtricos que miden cambios en la tensin superficial de las monocapas lipdicas, mtodos radiomtricos que utilizan sustratos marcados radiactivamente, y otros mtodos para la deteccin de la actividad lipoltica o de las propiedades fisicoqumicas de estas enzimas tales como ensayos conductimtricos, turbidimtricos, resonancia magntica nuclear, microscopia de fuerzas atmicas, cristalografa, etc. (Beisson et al., 2000). Por otro lado, estas enzimas son caracterizadas por tener una amplia actividad ya que catalizan un gran rango de reacciones, usando as para ser evaluadas la tcnica de pnitrofenil laurato (sustrato), la cual en estudios recientes ha demostrado que dichas enzimas lipolticas tienen en su mayora un alto contenido de cidos hidrofbicos (60.2%) (Neerupmaa y Jagdeep, 2006). As mismo, la mayora de las enzimas lipolticas han sido estudiadas segn sus propiedades qumicas. Entre estas se encuentran la dependencia a la actividad de los iones Ca2+, pH y temperatura (Arpigny y Jaeger, 2000). 2.4.2 Enzimas Termoestables Las enzimas son los catalizadores de las reacciones de los sistemas biolgicos cuyas dos principales caractersticas son la extrema especificidad y la ptima velocidad de reaccin. La estructura de la membrana celular depende de la combinacin de ciertas protenas y lpidos especficos (Rivera y Garca, 2007). Las enzimas estables se encuentran generalmente en organismos adaptados a vivir en condiciones hostiles. Actualmente, hay un gran inters en las enzimas de organismos ya que se han realizado gran cantidad de estudios sobre la relacin estructura-estabilidad de las enzimas provenientes de dichos microorganismos (Hubble, 1990). En cuanto al crecimiento microbiano a temperaturas elevadas se pueden destacar las adaptaciones que estas han venido desarrollando a lo largo de la evolucin. Estos microorganismos para sobrevivir a temperaturas elevadas comprenden, entre otras, una

gran proporcin de lpidos saturados en las membranas, lo cual impide la fusin a esas temperaturas (Atlas y Bartha, 2001). Muchos microorganismos termfilos producen enzimas que no se desnaturalizan a altas temperaturas. A veces, las protenas de los termfilos presentan secuencias de aminocidos poco frecuentes que estabilizan dichas protenas a temperaturas elevadas. Cuando se sobrepasa el mximo de temperatura de crecimiento, los ribosomas se funden y cesa la sntesis de protenas. Muchos termfilos tienen proporciones muy altas de guanina y citosina en su ADN, que eleva el punto de fusin y aade estabilidad a la molcula de cido nuclico del organismo (Atlas y Bartha, 2001). Las termoenzimas son aquellas que se producen a temperaturas aproximadas de 60C y 80C (hipertermfilos). Son resistentes a la denaturacin irreversible y ptimamente activas a altas temperaturas (60-120C), por lo cual son usadas en muchos procesos industriales (Zeikus et al., 1998). Estas formas termfilas de vida son de inters, no solo desde el punto de vista biolgico sino porque poseen ventajas industriales y biotecnolgicas. Las enzimas de termfilos son capaces de catalizar reacciones bioqumicas a altas temperaturas y son generalmente ms estables; esto se debe a la presencia de los puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas, intercambio inico, unin a metales y puentes disulfuro; lo que prolonga la vida til de las enzimas (Pez et al., 2000). De la misma manera, los microorganismos extremfilos han despertado un gran inters durante los ltimos aos, debido a la elevada estabilidad trmica, resistencia a desnaturalizantes qumicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente adecuadas para su uso en procesos de biotransformacin en condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termfilos crecen a temperaturas superiores a 45C, y en algunos casos (hipertermfilos) incluso por encima de 90C. La disponibilidad de lipasas termoflicas permitira operar a altas temperaturas, con el lgico incremento de la velocidad de reaccin y una ms fcil solubilizacin de los sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas, por ejemplo reacciones de sntesis en medios con bajo contenido en agua ( Rivera y Garca, 2007).

2.4.3

Enzimas en el tratamiento de residuos

La aplicabilidad de grupos enzimticos depende de la capacidad de hidrolizar polmeros complejos para incrementar su posterior degradacin microbiana. Dentro de stas se incluyen empleo de lipasas asociados a cultivos bacterianos para eliminar depsitos de grasa procedentes de diversas industrias, como embutidos o lctea, entre otras. As mismo en estudios recientes se ha demostrado que combinando microorganismos aislados del agua residual de una industria de alimentos con microorganismos lipolticos termfilos se acelera el proceso de compostaje al ser utilizados stos, mezclados en un inoculante (Tsai et al., 2006). Otras enzimas degradadoras de polmeros utilizadas en forma similar son las celulasas, amilasas y proteasas. Adems de esta hidrlisis de materiales polimricos existen tambin aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos txicos que podran ocasionar la inhibicin de procesos fundamentados en el desempeo microbiolgico. 2.4.4 Importancia industrial de las enzimas lipolticas Pocas enzimas lipolticas son las que han sido aisladas en forma pura y cristalizada, y poco se conoce acerca de su estructura y funcin. Las enzimas lipolticas han cobrado gran atencin por su potencial aplicacin en biotecnologa (Benjamn y Pandey,1998). Muchas son las aplicaciones que se han encontrado para las lipasas, en la industria del aceite, la produccin de farmacuticos, agroqumicos y componentes aromticos (Jaeger, 1999). Las lipasas son usadas en dos distintos mbitos. Ellas son usadas en la catlisis para la manufactura de otros productos (como ingredientes alimentarios) y por sus aplicaciones (produccin de qumicos). Todas ellas presentan una gran eficiencia cuando son empleadas en la industria (Cheetham, 2005). Las lipasas han pasado a ser una parte integral en la actual industria alimentaria. Se ha potenciado el uso de enzimas para mejorar procesos qumicos tradicionales en la

manufactura alimentaria y, las lipasas, se usan actualmente en la produccin de una variedad de productos como quesos y alimentos preparados (Ashok et al., 1999) En la mayor parte de los casos la produccin de enzimas debe ser inducida por la adicin de aceites y grasas. Aunque se reconocen casos en que las grasas no tienen efecto sobre la produccin de estas. Las lipasas estn generalmente unidas a las clulas por tanto inhiben la superproduccin pero mediante la adicin de un catin como magnesio; las lipasas se liberan y esto conduce a un ttulo mayor de enzimas en el proceso de produccin (Snchez, 1999). Entre otras aplicaciones, estas enzimas se utilizan en la industria alimentaria (produccin de aromas, emulgentes, etc.), en qumica orgnica (sntesis de antibiticos, pesticidas, produccin de compuestos enantiopuros, etc.), en detergencia (aditivos en detergentes, produccin de surfactantes para jabones y productos de limpieza, etc.), en la industria papelera (eliminacin del pitch, de tintas, etc.), as como en el tratamiento de productos residuales o txicos, en biosensores, en la produccin de biodiesel, etc (Bornscheuer, 2002). La importancia de estas aplicaciones ha llevado a la optimizacin de las reacciones catalizadas por las lipasas, a mejoras en la produccin y purificacin de estas enzimas, as como a la obtencin de lipasas con nuevas propiedades catalticas o una mayor estabilidad, lo que se ha conseguido mediante la modificacin de enzimas ya existentes, o mediante el aislamiento de nuevas lipasas (Wiseman, 1995). 2.4.5 Microorganismos reconocidos biotecnolgicamente como productores de lipasas Las lipasas han sido aisladas de una gran variedad de microorganismos pero una de las primeras fuentes ha sido la especie Bacillus, la cual adems de la produccin de lipasas, produce otras enzimas de inters industrial como son las celulasas, amilasas, elastasas, etc. Las lipasas difieren en varias de sus propiedades, stas dependen de su origen (el cual puede ser fngico, bacteriano, de mamferos, etc.), ellas catalizan la hidrlisis o sntesis

de una gran variedad de esteres carboxlicos y liberan cidos orgnicos y glicerol. Todas ellas muestran una alta especificidad sobre los sustratos (Rivera y Garca, 2007). En aos recientes, ms de 30 lipasas fueron asiladas de cepas de Rhizopus y muchas de ellas han sido caracterizadas (Rivera y Garca, 2007). Las lipasas de Rhizopus estn relacionadas con las lipasas de Rhizomucor miehei (existe una homologa >55%), stas tienen una alta especificidad en la posicin 1,3 de triglicridos, las cuales las hacen muy verstiles en la modificacin de lpidos. En estudios recientes en la ciudad de Suiza se determin en la fase termoflica del compost el gen Thermus perteneciente a Bacillus stearothermophillus, aislado de un proceso de compostaje con residuos de cocina y de poda. Este compost alcanz una temperatura mxima reportada de 80C la cual es ptima para el crecimiento de este microorganismo (Beffa et al., 2006). Las enzimas termoestables pueden ser obtenidas de organismo mesoflicos y termoflicos; se han obtenido algunas enzimas termoflicas a partir de organismos psicrfilos (Imamura y Kitaura, 2000). Los principales organismos de los cuales se han extrado enzimas de inters industrial son hipertermfilos Pyrococcus furiosus y Thermotoga sp (Adams et al., 1995). Otros organismos como hongos son productores de lipasas termoestables (Tabla 2). Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas Organismo Candida Antarctica Candida curvata Mucor miehei Temperatura ptima C 70 50-60 40 pH ptimo 6.5 6.5 7.0

Fuente: (Rivera y Garca, 2007). As mismo, las lipasas son producidas por muchos microorganismos, siendo las fuentes tradicionales para la produccin comercial: Pseudomonas sp, Serratia sp, Rhizopus sp, Mucor sp, Aspergillus spp y Candida. Algunos de los microorganismos producen varias lipasas cuya especificidad vara con respecto a los cidos grasos y a la posicin en el triglicrido (Lpez 1999).

Entre los microorganismos reportados como mayores productores de enzimas lipasas termoflicas se encuentra el gnero de Bacillus sp, siendo la especie mas destacada B. thermocatenolatus, stos producen dos lipasas extracelulares termoestables las cuales dependen de la edad del cultivo (Nerupmaa y Jagdeep, 2006). Se han encontrado estudios recientes de levaduras productoras de lipasas como: Candida rugosa la cual produce lipasa extracelularmente y es ampliamente utilizada para propsitos industriales. Una preparacin comercial de lipasa de esta levadura puede separase en varias izoenzimas, con varios mecanismos como: diferente contenido de carbohidratos, punto isoelctrico, substrato especfico y secuencia primaria (Neerupma, 2006). 2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLGICOS. Los inoculantes biolgicos estn clasificados como: biofertilizantes, biocontroladores y acelerantes. Los biofertilizantes o abonos biolgicos tienen como principio activo microorganismos vivos (bacterias y hongos) que promueven y benefician la nutricin y el crecimiento de las plantas. Desde el punto de vista de una agricultura sostenible, el uso de biofertilizantes representa una importante alternativa para limitar el uso de abonos qumicos, reduciendo su negativo impacto ambiental y econmico, y mejorando la productividad de los cultivos enfocado al ptimo crecimiento vegetal permitiendo as un mejor aprovechamiento de los recursos naturales del suelo, por estas razones la produccin de bio-insumos agrcolas ha cobrado importancia (Cuevas et al., 2000). Es evidente que un desarrollo exitoso de esta tecnologa debe ir ligado a la generacin de conocimiento bsico que conduzca a una mayor comprensin de los fenmenos asociados al proceso de nutricin vegetal promovidos por los inoculantes (Lozano, 2005). En la actualidad la implementacin de inoculantes termoflicos es una alternativa viable en el tratamiento de residuos slidos orgnicos. La gran estabilidad que presentan las enzimas de estos microorganismos, frente a temperaturas extremas, garantiza una capacidad de degradacin mayor que la obtenida por gneros microbianos mesoflicos. La

utilizacin de inoculantes biolgicos a partir de microorganismos mesfilo - termfilos ha trado grandes beneficios en compostacin de residuos domsticos, industriales y hospitalarios. En estudios recientes en una industria lctea, se realiz una prueba de compostaje de campo, comparando un inoculante comercial con un inoculante que tena cepas nativas, observando al final del proceso, la eficiencia de las bacterias nativas y la ptima utilizacin de estas en la degradacin de diversos desechos producidos por la industria en estudio (Moreno et al.,2001). De la misma forma, otro proyecto de investigacin fue el realizado en la ciudad de Sogamoso (Boyac), donde se evalu la accin de un inculo termoflico con actividad enzimtica proteoltica, amiloltica, lipoltica y celuloltica, acelerador del proceso de compostaje en residuos slidos municipales. En la prueba de campo se verific la eficiencia del inoculante aplicado sobre la pila experimental, se evidenci la reduccin del tiempo de degradacin a ocho semanas, ya que el tiempo del proceso de compostaje era de 16 semanas. Por otra parte, este proceso garantiz el mejoramiento de las caractersticas fisicoqumicas y la eliminacin de patgenos en el producto final (Palomino et al., 2002). En diversos proyectos se ha obtenido un rendimiento ptimo a partir de inoculantes correspondiente a la tasa de degradacin de cada tipo de residuo a tratar, sin alterar de modo alguno la calidad del producto final; por el contrario se ha logrado la produccin de un compost con alto contenido de elementos como nitrgeno, fsforo y potasio, que ayudan a aumentar la viabilidad de los suelos (Moreno et al., 2001).

2.6 MICROORGANISMOS PATGENOS

El control sanitario del compost es de vital importancia, ste debe ser tratado de manera adecuada debido a que ser utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en agricultura orgnica o inorgnica, dando lugar a la contaminacin de los productos y/o de las fuentes de aguas, por lo que su aplicacin descontrolada constituye un peligro para la salud pblica y una amenaza para el medio ambiente por la exposicin a microorganismos patgenos que esto representa (Fundases, 2006). Los patgenos son causantes de enfermedades y pueden pertenecer a cualquiera de las clases de microorganismos, bacterias, hongos, virus, ricketsias y protozoos. El diseo de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destruccin de patgenos, ya que la presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura (Islam et al., 2004). A lo largo del proceso de compostaje, se espera una reduccin total de los agentes patgenos por accin de diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad, sustancias antibiticas, entre otros. Salmonella sp. es una bacteria Gram negativa, predominantemente mvil, anaerobia facultativa, que al ser un microorganismo patognico de tipo entrico causa salmonellosis en animales y humanos (EPA Mtodo 1682, 2006). De igual manera Salmonella sp. puede causar una deshidratacin crnica y muerte en los nios mientras que en el ganado puede causar abortos. Una vez la vaca es infectada con Salmonella su erradicacin es difcil ya que hay cepas resistentes a antibiticos. Adems, puede transmitirse por contacto directo de animales (Islam et al., 2004) As mismo, Salmonella sp, es uno de los patgenos entricos ms estudiados encontrados en el compost. Es conocido que la temperatura de 55C por 15 das es letal para los miembros de este grupo (EPA, 1682). Por otra parte Escherichia coli, es una bacteria Gram negativa, que causa infecciones de tipo intestinal, es por esto que la presencia de este microorganismo patgeno en el compost y su diseminacin en el medio ambiente (suelo, agua, superficie de las plantas) merece especial atencin por las severas consecuencias que puede traer un mal manejo de este producto para la salud y la higiene ambiental, por lo que es necesario que los productores apliquen buenas prcticas agrcolas para manipular estos fertilizantes naturales con el fin de reducir al mnimo los peligros microbiolgicos ( Islam et al., 2004).

3.- JUSTIFICACIN.
Bioagrcola del Llano S. A. E.S.P ubicada en el Departamento del Meta (Villavicencio); es una empresa creada a travs del Acuerdo 004 de 1995 del Concejo Municipal y

constituida el 17 de agosto de 1995, a fin de atender a la necesidad surgida de la Ley 142 de 1994, que aplica a aquellas entidades que realizan actividades prestadoras de servicios pblicos domiciliarios, alcantarillado, aseo, entre otros. De sta manera la empresa se ha orientado en una gestin que promueve el mejoramiento continuo de los procesos y la satisfaccin de los usuarios. Por esta razn, se han obtenido reconocimientos por los avances efectuados en materia de disposicin final y compensacin ambiental efectuada en el relleno sanitario Don Juanito, el cual en la actualidad es el Parque Ecolgico Reciclante en esta ciudad. As mismo, esta empresa es la encargada de realizar la recoleccin y transporte de residuos slidos domiciliarios y comerciales. En la actualidad se reciben 308 toneladas/da de residuos de la cuales aproximadamente 285 toneladas corresponden a la disposicin de Villavicencio y 23 toneladas corresponden a la disposicin de otros municipios. En cuanto a los residuos orgnicos generados se utilizarn como recurso para eliminar focos de contaminacin y optimizar la higiene pblica. Actualmente, se ha venido desarrollando un inoculante biolgico acelerante compuesto por 14 cepas nativas termoflicas con actividad proteoltica y amiloltica (Galindo et al., 2005) el cual ha contribuido a la reduccin del tiempo de produccin y a la obtencin de un compost de buena calidad. Por lo anterior, se buscar potencializar la eficiencia del inculo ya existente compuesto por cepas termoflicas amilolticas y proteolticas, aislando microorganismos nativos con actividad lipoltica que sern adicionados al inoculante microbiano termoflico con el fin de optimizar su accin en el proceso de degradacin de residuos orgnicos. As mismo, debido a la importancia que ha alcanzado este compost producido (bioabono) se plantea el anlisis de patgenos humanos E.coli y Salmonella sp. al inicio y al final del proceso para garantizar su calidad. Por ultimo, la finalidad de este proyecto es poder obtener resultados favorables mediante el aislamiento de las bacterias anteriormente mencionadas, para mejorar la eficiencia del inculo con el que se ha venido trabajando en la Empresa Bioagrcola del Llano, el cual aportar ptimos resultados al momento de obtener el bioabono producido.

4.- OBJETIVOS 4.1 Objetivo General.

Aislar bacterias lipolticas y determinar patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. a partir de residuos orgnicos domiciliarios en compostaje. 4.2 Objetivos Especficos.

Aislar bacterias con actividad lipoltica a partir de los residuos orgnicos a compostar. Evaluar la capacidad antagnica de las cepas en estudio. Evaluar cualitativamente y cuantitativamente actividad enzimtica lipoltica de las cepas seleccionadas. Estandarizar la tcnica de p-nitrofenol para la evaluacin cuantitativa de las cepas. Determinar patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. en compost, al inicio y final del proceso de compostaje.

5.- METODOLOGA Este proyecto fue realizado en el relleno sanitario Don Juanito en la ciudad de Villavicencio manejado por la empresa Bioagrcola del Llano S.A. E.S.P, en donde se llev

a cabo el montaje de tres replicas de compostaje, utilizando 55% de residuos de plaza, contenido ruminal, poda y cascarilla de arroz, para el aislamiento de bacterias lipolticas y para llevar a cabo la determinacin de patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. Las muestras fueron procesadas y analizadas en los laboratorios de Microbiologa Ambiental y Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. La determinacin de los parmetros fisicoqumicos del producto inicial y final se realiz en AGRILAB, laboratorio certificado por el ICA (Anexo 12). 5.1 REACTIVACIN DE CEPAS Se llev a cabo la reactivacin de 14 cepas nativas termofilicas, con actividad proteoltica y amiloltica provenientes de residuos orgnicos domiciliarios del relleno sanitario Don Juanito de la ciudad de Villavicencio, las cuales fueron conservadas en glicerol al 25%(v/v), en el banco de clulas del laboratorio de Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana (Galindo et al; 2005). El proceso de reactivacin de las 14 cepas se llev a cabo en medio lquido leche-almidn al 1%(p/v) (Anexo1) hasta obtener una concentracin de 1020 UFC/mL a una temperatura de 55C. A partir de estas, se produjo la cantidad de inoculante necesaria para aplicar a las pilas de compostaje. Para comprobar la produccin de biomasa de las cepas reactivadas se determin mediante tcnicas cualitativas (formacin de halos de hidrlisis) en agares especficos (leche-almidn al 1%), se realizaron recuentos en placa para determinar biomasa, fueron incubadas a 55C por 24 horas. La cantidad de inoculante a preparar se calcul de acuerdo a los metros cbicos de residuos orgnicos que se compostaron y a la concentracin final deseada de 1020 UFC/mL, siendo 2.5 litros por metro cbico la cantidad destinada para cada tonelada (Galindo et al., 2005).

5.2 FASE DE LABORATORIO 5.2.1 MUESTREO

A partir de las 3 rplicas de compostaje, se tomaron de las materias primas y del compost final 5 muestras de 100 g cada una para completar 500 g, utilizando un tubo de PVC de 70 cm de largo por 3 de dimetro, para esto se retir el material de tal forma que la materia qued al descubierto, de dicha pared se tomaron las 5 muestras de diferentes alturas y distancias (Universidad de los Andes, 2003). Posteriormente, se trasladaron en bolsas plsticas de cierre hermtico dentro de una nevera plstica al laboratorio de Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. El anlisis realizado a estas muestras primero fueron anlisis fsico qumico y segundo screening de bacterias lipolticas y patgenos. 5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipoltica A partir de 500g de muestra homogenizada se tomaron 10 gramos y se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada al 1% (p/v) de 10-1 a 10-8. Luego se sembr en superficie y por duplicado 0.1 mL de las diluciones, en medio lecitina (Ramrez et al., 2004) (Anexo 1) se utiliz como control medio de cultivo tributirina. Algunos de los microorganismos aislados hidrolizaron el cido graso presente en el

medio, generando una zona de hidrlisis o aclaramiento alrededor de las colonias que se evidenci despus del tiempo de incubacin a 55C por 24 horas. Se tuvo como parmetro de seleccin, las cepas con halos 1mm de dimetro (Jaeger et al., 1999, citado por Moreno et al., 2001) Las siembras realizadas fueron sucesivas, mediante la tcnica de parcheo para purificar cada colonia, en donde se observ la actividad enzimtica, la cual se determin de forma cualitativa en mm de dimetro con la siguiente ecuacin (1): C = A B (ecuacin 1) En donde: A: Dimetro de la colonia ms el halo de hidrlisis en mm. B: Dimetro de la colonia en mm.

C: Dimetro del halo de hidrlisis (Rodrguez et al., 2002) 5.2.2.2 Identificacin microscpica y macroscpica de las colonias Para llevar a cabo la identificacin microscpica se realizaron montajes en lminas de cada una de las colonias seleccionadas y se realizaron tinciones de Gram para evidenciar morfologa celular (Madigan, 1997). En la identificacin macroscpica se tuvieron en cuenta caractersticas de las colonias como halos de hidrlisis, color, textura, tamao y elevacin de las colonias bacterianas. 5.3 BANCO DE CLULAS PRIMARIO (Conservacin De Cepas). La conservacin de las cepas seleccionadas se realiz mediante la tcnica de criopreservacin con glicerol al 30% (v/v). Para alcanzar la concentracin ptima de 108 UFC/mL del banco fue necesario realizar recuentos en placa en medio lecitina para confirmar la concentracin inicial. Cada cepa fue cultivada en 25 mL de caldo lecitina por 12 horas a 55C. Posteriormente se aadieron 25 mL de caldo lecitina ms glicerol al 60% (v/v). Finalmente se tom 1 mL de dicha suspensin y se almacen en tubos eppendorf a -70C (Poutou et al., 1994). Este procedimiento se llev a cabo con cada una de las cepas aisladas. 5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO Las 14 cepas existentes correspondientes al inculo utilizado en La Empresa Bioagrcola del Llano S.A E.S.P. se llevaron a cultivar de 48 horas a 55C en el medio correspondiente a cada cepa, para determinar el tiempo ptimo de crecimiento del microorganismo. (Galindo et al., 2005). Se realiz un inculo con una concentracin de 108UFC/mL en un erlenmeyer relacin 1/5 en caldo Almidn-leche al 1% (p/v) y lecitina bajo las siguientes condiciones 55C por 12

horas, despus de este tiempo se realizaron las pruebas de antagonismo para cada una de las cepas. Para la prueba se sembraron masivamente cada uno de los microorganismos en medio almidn-leche al 1%(p/v) y lecitina. A partir de la suspensin anterior se tomaron 20l y se dispusieron en pozos, como control se tom el microorganismo que se sembr masivamente, esta tcnica se realiz por triplicado enfrentando las 14 cepas existentes con las cepas lipolticas aisladas. Este antagonismo se evalu con el fin de evidenciar si las cepas lipolticas pueden ser adicionadas al inculo ya existente .Las 14 cepas ya existentes no presentan antagonismo entre ellas comprobado en estudios anteriores. (Galindo et al.,2005) El efecto antagnico se evalu midiendo el dimetro de los halos de inhibicin, tomando como antagonismo positivo a las cepas que enfrentndose entre s, inhibieron el crecimiento de las otras en 5mm de dimetro (Gauze, 1967). Adicionalmente, se realizaron pruebas antagnicas de las cepas lipolticas enfrentadas entre si obtenidas del screening, sembrando masivamente cada cepa lipolitica. De igual manera al iniciar las pruebas fue necesario que los microorganismos alcanzaran la misma concentracin (108UFC/mL) para evitar falsos positivos. Para esto se llevaron a cabo nuevamente recuentos en placa en medio lecitina, lo cual permiti determinar la concentracin inicial de cada microorganismo, posteriormente se realiz la metodologa anteriormente mencionada. 5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO Esta prueba se realiz con el fin de determinar el tiempo de la fase de crecimiento de cada una de las cepas aisladas y de esta manera saber, el tiempo ptimo para la produccin del inculo nativo termoflico, en el cual se genera mayor actividad enzimtica.

5.5.1 Produccin del inculo

Se prepar un inculo de 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial obtenido del banco primario de cada una de las cepas en un erlenmeyer de 500 mL (1/5), el cual dur en incubacin un tiempo aproximado de 24 horas. Transcurrido este tiempo para la fermentacin se transfiri a un erlenmeyer de 1000mL con 500 mL de medio lecitina, relacin (1/2) adicionalmente se realiz coloracin de Gram para corroborar pureza (Moreno et al., 2001). 5.5.2 Fermentacin Discontinua Se tom del inculo preparado en el numeral anterior la cantidad correspondiente a 0.5 mL para realizar diluciones de 10-1 a 10-10 para luego determinar biomasa mediante la tcnica de recuento en placa (UFC/mL) por triplicado, por un periodo de incubacin de 18 horas a 55C. Para la determinacin de biomasa de los diferentes tiempos de muestreo se ley absorbancia utilizando la tcnica de lavado con buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO
4

+ KH2 PO4) y adicin de Triton X-100 al 1%, debido a la turbidez del medio. Esta tcnica se ley a 540 nm (Otlora et al., 2003) la metodologa anterior se uso para bacterias, para actinomycetes utiliz nicamente la tcnica de recuento en placa. 5.6 TCNICA COLORIMTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA LIPOLTICA 5.6.1 Curva patrn de p-nitrofenol La curva de p-nitrofenol se realiz en tubos 13 x 100mm, utilizando una solucin buffer fosfato 1M (Anexo 3), el cual fue utilizado como blanco y como solucin buffer del pnitrofenil (Otlora et al., 2003). Para realizar la curva patrn (Anexo 4), se prepar una solucin stock de p-nitrofenil de 1umol/mL en buffer fosfato pH 7.0, a partir de esta solucin se determinaron las diferentes concentraciones para la construccin de la curva de p-nitrofenol, las cuales fueron ledas por duplicado en un espectrofotmetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrn et al., 2006). ACTIVIDAD

Las concentraciones de p-nitrofenol que arrojaron valores de absorbancias entre 0.1 y 0.9 fueron escogidos para realizar el trabajo de acuerdo con la Ley de Beer-Bouguer-Lambert (Otlora et al., 2003). 5.6.1.1 Evaluacin y estandarizacin cuantitativa de actividad lipoltica Para determinar la actividad lipoltica se prepar una solucin buffer fosfato 1M a pH 7 + o 2 (Na2HPO4 + NaH2PO4) con diferentes concentraciones de p-nitrofenil palmitato (0,08%(p/v), 0,5%(p/v), 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)) + 1% de TRITON X-100 (Shuen et al., 1996). A partir de esta solucin se tom 900l en tubos 16*150 y se le adicion diferentes volmenes de extracto crudo (20l, 500l y 700l). La solucin se incub por 30 y 60 minutos a 55 C. Transcurrido este tiempo se fren la reaccin con NaOH. Posteriormente cada una de las mezclas fue llevada a centrifugacin a 10000 rpm por 10 minutos, a partir del sobrenadante se tom 1mL y fue depositado en las celdas de cuarzo, para luego realizar la lectura usando como blanco la solucin buffer sin extracto crudo de la enzima en espectrofotmetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrn et al., 2006). Las unidades lipolticas fueron determinadas a travs de la curva patrn de calibracin donde una unidad de p-nitrofenol liberada corresponde a una unidad lipoltica por minuto (UL). (Kampen, 1999). 5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimtica Se realizaron pruebas preliminares de actividad enzimtica de las cepas escogidas, llevando a cabo una fermentacin discontinua, para lo cual se llev a cabo la produccin de un inculo en 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial de cada cepa obtenido del banco primario en un erlemmeyer de 500mL para alcanzar una relacin (1/5) con un pH inicial 7.5 y un tiempo de incubacin de 24h a 55C. Pasado el tiempo de incubacin se trasladaron 100mL del inculo a un erlenmeyer de 1000mL que contena 400 mL de caldo lecitina relacin (1/2) con pH 7.5 inicial, stos se cultivaron durante 12 horas, a 55C, posteriormente se retir el erlenmeyer, iniciando el muestreo en la hora 0, luego se realizaron muestreos cada media hora hasta llegar a la

hora y media, a partir de aqu se realizaron muestreos cada 2 horas de fermentacin hasta la hora 18, para corroborar pureza del cultivo se realizaron coloraciones de Gram en cada hora de muestreo (Otlora et al.,2003). En cada muestreo se tomaron del erlenmeyer 5mL de muestra, esta se centrifug a 150 rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante, es decir, el extracto crudo que contiene la enzima lipoltica como se mencion el numeral anterior. Por otro lado, se prepar una solucin de Buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO 4 + KH2 PO4), el cual fue mezclado con el p-nitrofenil palmitato mas Triton X 100 a una concentracin del 1% (Beltrn et al.,2006). A partir de esta solucin se tomaron las cantidades especificadas anteriormente de p-nitrofenil palmitato y extracto crudo en tubos 13*100. La solucin se incub por 30 y 60 minutos a 55C transcurrido este tiempo se fren la reaccin con 1575 ul de NaOH (Otlora et al., 2003). Luego se realiz la lectura usando como blanco la solucin de Buffer sin el extracto crudo de la enzima (Beltrn et al., 2006). Para realizar la tcnica de cuantificacin de la actividad enzimtica, se formula que una unidad lipoltica se define como la cantidad de enzima capaz de liberar una micromol de p- nitrofenol por minuto por litro (Moreno et al., 2001). 5.7 DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS. Escherichia.coli y Salmonella sp. 5.7.1 Determinacin de microorganismos patgenos. Salmonella sp. Las muestras iniciales fueron tomadas de la primera y ltima semana de residuos del proceso de compostaje, stas fueron recolectadas en bolsas plsticas de cierre hermtico y llevadas a refrigeracin a 4C hasta el momento de su anlisis. Para la presencia de Salmonella sp se us el mtodo de NMP (nmero ms probable). A partir de 500g de muestra se tomaron 25g para diluirlo en 225mL de agua peptonada al 0.1%(p/v), enseguida se homogenizo por inmersin (EPA, 1682, 2005). Seguido a esto se

realizaron tres diluciones: el primer juego se realiz con frascos de vidrio, con 10mL de medio lquido TSB (Anexo 1) mas 20mL de muestra homogenizada, el segundo juego se realiz en tubos tapa rosca (16x150mm) con 5mL de medio lquido TSB ms 5mL de muestra homogenizada y finalmente el tercer juego con tubos tapa rosca (16x150mm) con 10mL de medio liquido TSB mas 1mL de muestra homogenizada. Cada juego correspondi a las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 respectivamente. Se incub 24h a 36C (EPA, 1682-2006), para cada una de las diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) se prepar el medio Rappaport Vassiliadis (semislido) (Anexo 1). Sobre cada caja se distribuyeron cinco puntos equidistantes y se depositaron 30l de cada juego de diluciones. Esto se llev a incubar a 42C por 24h. De cada una de las gotas depositadas (5) en el medio semislido Rappaport Vassiliadis correspondiente a cada dilucin, se repicaron a medios selectivos XLD y Sulfito Bismuto (EPA, 1682-2006). De los aislamientos se escogieron colonias caractersticas de Salmonella sp y de estas se hicieron pases a: TSI, LIA y UREA (Tabla 3), seguido de esto se escogieron las colonias que presentaron reaccin metablica positiva, y se realiz la prueba serolgica con solucin salina y antisuero polivalente o``, esta prueba consiste en obtener una muestra de la superficie inclinada del tubo de cada una de las bioqumicas, emulsionando sobre una lmina con suero fisiolgico estril, evidenciando aglutinacin en caso de un resultado positivo (EPA, 1682-2006). Tabla 3.Tabla gua para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp Medio Tripticasa soya Medio Rappaport Vassialiadis modificado Resultados Salmonella Positivo Positivo Mtodo 1682 Reaccin Positiva Turbidez Clulas que migran en el medio alrededor del halo donde se realiz la inoculacin de color blanco grisceo rosado a rojo con colonias que presentan centro negro Viraje de rojo a Mtodo 1682 Reaccin Negativa No turbidez Medio de color igual al inicial sin halo

XLT4

Positivo

TSI

Positivo

Otro color con centro negro ejm: E.coli: colonias amarillas con el centro negro Otro tipo de color

LIA

Positivo

amarillo con o sin produccin de H2S Columna vertical y superficie inclinada color violeta, formacin de H2S

REA Polivalente O

Negativo Positivo

Color Rosado Aglutinacin

Otra combinacin de colores ejm: E.coli presenta color rojo o variacin entre rojo y morado sin produccin de H2S No hay cambio de color ( Salmonella es ureasa negativo) No Aglutinacin

Fuente: EPA 2006 United States Enviromental Protection Agency Method 1682: Salmonella in Sewage Sludge (Biosolids) by Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) Medium La determinacin de NMP se realiz a partir de los tubos originales de TSB con resultados positivos para Salmonella sp en MSRV, XLD, Hecktoen, Sulfito Bismuto, TSI, LIA, urea negativo y antisuero polivalente positivo, se leyeron en la tabla de NMP. Para la determinacin de slidos totales se tomaron 15g de la muestra a 100C por 24 horas. El porcentaje de peso seco se calcul utilizando la siguiente ecuacin (1)

g de la muestra seca (1) % peso seco = g de la muestra Para la determinacin de Salmonella sp como NMP/15g peso seco se utiliz la siguiente ecuacin (2): NMP/ ml (peso hmedo) * 15 (2) NMP/15g (peso seco) = Porcentaje de slidos totales * 100%

5.7.2 Determinacin de Escherichia coli.

Las muestras para el anlisis fueron tomadas de la primera y ltima semana de la mezcla del compost, stas fueron recolectadas en bolsas plsticas de cierre hermtico y llevadas a refrigeracin a 4C hasta el momento de su anlisis. Para la presencia de Escherichia coli se us el mtodo de NMP (nmero ms probable). A partir de 500g de muestra se tomaron 10g para diluirlo en 90ml de agua peptonada al 0.1%(p/v), enseguida se homogeniz por inmersin (EPA, 1680, 2006). Seguido a esto se realizan tres diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Alternamente se preparan 9 tubos, cada uno con 9ml de caldo LMX ,los cuales cada serie de tres sern inoculados con 1ml de las diluciones ya preparadas, que correspondern la primera serie de tres a la dilucin 10 -1, la segunda serie de tres ala dilucin 10-2, y la ultima serie de tres a la dilucin 10-3. Se tom como resultados positivos para Escherichia coli aquellos tubos que presentaran tres reacciones positivas como lo son: Indol positivo, fluorescencia y presencia de glucoronidasa (EPA, 1680, 2006). Para la determinacin de NMP/4g se revis en la tabla establecida por la EPA, 1680, 2006. 5.8 FASE DE CAMPO 5.8.1 Determinacin de pH y Temperatura La temperatura fue analizada mediante un termmetro de punzn de 70 cm de largo con receptor digital, las mediciones se realizaron diariamente. Estas temperaturas se registraron de las 3 replicas de compostaje para luego ser promediadas y encontrar el valor medio. Este procedimiento se realiz diariamente los resultados fueron registrados para su posterior anlisis. El pH se determin semanalmente en el laboratorio de Biotecnologa Aplicada por medio del mtodo de pasta de saturacin, que consiste en tomar cinco submuestras de cada pila hasta completar 500g y agregar 500mL de agua destilada; se debe mezclar y pasados de 5 a 10 minutos, se toma el valor del pH sobre el extracto liquido superficial (Galindo et al., 2005).

Finalmente se calibra el potencimetro con las soluciones reguladoras de pH 7.0 y 4.0 (soluciones buffer) y se introduce el electrodo de vidrio en la pasta saturada y se registra la lectura (ICONTEC, 2004).

5.8.2 Anlisis Fisicoqumico De Las Muestras Se tomaron 500 g del compost final y fueron destinadas para el anlisis de los parmetros fisicoqumicos realizados por AGRILAB, laboratorio registrado ante el ICA, con el fin de establecer parmetros fisicoqumicos: Relacin C/N Humedad, Cenizas. Carbobo orgnico oxidable, Capacidad de Intercambio Catinico, Nitrgeno orgnico, Fsforo total, Potasio total, Calcio total, Magnesio Total, Azufre total, Hierro total, Manganeso total, Cobre total, Zinc total.

5.9 ANLISIS ESTADSTICO De acuerdo a los registros de actividad enzimtica se que se obtendrn, con las diferentes cantidades de sustrato y de extracto crudo, se llevara a cabo un anlisis de ANOVA, para el posterior anlisis en el programa JUMP. Planteamiento de Hiptesis. Ho: No existen diferencias entre la actividad lipoltica obtenida a partir de microorganismos nativos de compost en los tiempos de contacto, los volmenes de extracto y las diferentes concentraciones de sustrato. Ho: H1 = H2 = H3 Hi: Al menos una de las variables analizadas presenta diferencias significativas. Hi: H1 H2 H3 Por otra parte, segn los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo se realiz un estudio de tipo descriptivo en el que se plantearon las siguientes hiptesis Ho: Las cepas enfrentadas presentan antagonismo

Hi: Las cepas enfrentadas no presentan antagonismo

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

Bioagrcola del Llano S.A. E.S.P, ubicada en Villavicencio (Meta) se ha convertido en un puente entre la civilizacin y la biodiversidad, debido al Parque Ecolgico Reciclante, en el que se encuentra ubicado el Relleno Sanitario Don Juanito. Este parque a travs del tiempo ha dado respuesta a la necesidad de brindar una nueva imagen a la comunidad demostrando una excelente gestin ya que brinda un adecuado manejo de los residuos slidos logrando as un ecosistema benfico ( Galindo et al., 2005). Por lo anterior, se demuestra la importancia de la obtencin de estos resultados ya que se le proporcionar a Bioagrcola del Llano avances en cuanto a las posibilidades del inoculante acelerante ya desarrollado con cepas amilolticas y proteolticas con una actividad de 114.5 UA y 98.5 UP respectivamente (Rodrguez et al., 2005) las cuales permitirn un mejoramiento continuo para optimizar la calidad del bioabono que se comercializa en cultivos de la regin. 6.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 6.1.1 Aislamiento de Bacterias con Actividad Lipoltica Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza, contenido ruminal y cascarilla de arroz. A partir del screening inicial en medio lecitina despus de realizar las respectivas diluciones, siembras en superficie e incubacin a 55C por 48 horas, se obtuvo un total de 9 cepas presuntivas (Tabla 4) debido a la presencia de un halo de hidrlisis, como consecuencia de la utilizacin de la fuente de carbono del medio (cidos grasos contenidos en la lecitina) estas se les realizo tcnicas de agotamiento para obtener cepas purificadas. Luego de las siembras sucesivas se obtuvieron 3 cepas denominadas: L1, L2 y L3 (Figura 2a, b y c). Se debe tener en cuenta que la lecitina es el nombre comn para un determinado tipo de fosfolpidos, estos son componentes importantes que se encuentran en la estructura de todas las membranas celulares. De la misma manera la lecitina, es una importante fuente de fosfolpidos, la cual es necesaria para todas las clulas vivas. Las membranas de las clulas que regulan los nutrientes que pueden penetrar o no en la clula, estn compuestas en gran medida de lecitina (Rivera y Garca, 2007).

Tabla 4. Cepas presuntivas lipolticas Halo de hidrlisis en mm Cepa Lipoltica de dimetro 1L 1,5 2L 1,3 3L 1,2 4L 1,0 5L 1,0 6L 1,1 7L 1,0 8L 0,5 9L 0,8 Fuente: Autores, 2007 Cabe anotar que de las cepas aisladas nicamente tres presentaron un halo > de 1 mm de dimetro se seleccionaron aquellas cepas que tenan un halo de hidrlisis entre 1.2mm y 1.5 mm ya que estos fueron los mayores dimetros. Sin embargo, en los mismos procesos algunas lipasas son reportadas con una alta especificidad por cidos grasos. El ms amplio ejemplo es la lipasa extracelular aislada de la cepa Geotrichum candidum, la cual es reportada por poseer una alta especificidad por los cidos grasos insaturados (Strnsk et al., 2006). En la preparacin del inculo para Geotrichum se utilizaron medios de cultivo que tenan al igual que el lecitina MgSO 4 y KCL lo que otorga al microorganismo un sustrato favorable para su desarrollo, diferencindose nicamente en la fuente de carbono (Aceite de Oliva), utilizado como inductor de lipasas (Strnsk et al., 2006).

Figura 2a. Cepa aislada L1. Medio lecitina

Figura 2b. Cepa aislada L2. Medio lecitina

Figura 2c. Cepa aislada L3. Medio lecitina Fuente: Autores, 2007 Figuras 2. a,b,c Cepas Purificada con un tiempo de incubacin de 48 horas a 55C. En estudios recientes se ha encontrado que la mayora de microorganismos lipolticos y sus enzimas se obtienen del suelo, donde se encuentran bacterias muy activas en el reciclaje de nutrientes como las pertenecientes al gnero Bacillus y otros gneros relacionados. Estos gneros estn considerados como una de las mayores fuentes de enzimas con aplicacin industrial debido a que, en general, son microorganismos no patgenos, bien estudiados y fciles de manipular, que producen y secretan grandes cantidades de enzimas como lipasas, celulasas, entre otros ( Snellman, 2004). 6.1.2 Identificacin macro y microscpica de las cepas De acuerdo al aislamiento, se identificaron morfologas macro y microscpicas de las 3 cepas, siendo 1 actinomycete y 2 bacterias (Tabla 5). Al realizar coloraciones de Gram, se determino la presencia de bacilos gram positivos filamentosos para el actinomycete y bacilos Gram negativos para las dos bacterias (Figura 3 a,b y c) Tabla 5. Identificacin Macro y Microscpica de las colonias Cepa Origen Morfologa Microscpica Morfologa Macroscpica

Cepa L1 Cepa L2

Pila No 3 Pila No 3

Bacilos Gram negativos Bacilos Gram negativos

Colonias cremosas de color amarillo Colonias rugosas de color blanco

Cepa L3

Pila No 3

filamentosos Bacilos Gram negativos

Colonias cremosas de color amarillo

Fuente: Autores 2007.

Cepa L1. Bacilos Gram negativos

Cepa L2. Bacilos Gram negativos filamentosos Cepa L3. Bacilos Gram negativos Fuente: Autores, 2007. Figura 3 a,b,c . Coloraciones de Gram 6.1.3 Criopreservacin Cepas de

En total fueron criopreservadas 3 cepas con glicerol al 30 %(v/v). Cada cepa fue almacenada en 35 viales a -70C para un total de 105 viales. 6.1.4 Pruebas de Antagonismo Esta prueba se realiz con las 3 cepas seleccionadas como lipolticas, con el fin de evaluar la posible inhibicin en el crecimiento. Se llevo acabo enfrentando las tres cepas entre s. Los resultados no evidencian antagonismo entre las cepas seleccionadas (Figura

4), lo que favorecera su actividad en el inoculante, ya que estas pruebas tienen como propsito evaluar la ausencia de inhibicin de crecimiento entre las cepas. El hecho de no presentar inhibicin de crecimiento entre los microorganismos puede atribuirse a que probablemente no liberan sustancias que impida el crecimiento de la cepa enfrentada o las liberan en cantidades que no alcanzan a afectar su desarrollo. Tambin puede deberse a que la produccin de sustancias inhibitorias se vea estimulada por condiciones de estrs, como falta de nutrientes y en este caso el medio en el cual se desarrollaron (agar lecitina) contena los nutrientes en cantidades necesarias para su crecimiento. (Duran, 1996). As mismo cabe destacar que estas cepas posiblemente no presentan antagonismo al ser aisladas de la misma fuente (residuos orgnicos) donde conviven sin presentar ningn tipo de competencia por sustrato debido a que esta fuente muy posiblemente cuenta con todos los requerimientos ptimos para su desarrollo. Las pruebas se realizaron en agar lecitina, por triplicado; los resultados reflejan un posible efecto de sinergismo que podra acelerar la degradacin de los residuos slidos presentes en el compost, constituidos por lpidos, disminuyendo el tiempo del compostaje. (Tabla 6). Tabla 6. Promedio de Resultados de las pruebas antagnicas. (Dimetro de Halos en mm) Cepa No L1(R1) L2(R1) L3(R1) L1 0 0 L2 0 0 L3 0 0 -

Fuente: Autores, 2007.

Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolticas sin halo de inhibicin Fuente: Autores, 2007 Las pruebas antagnicas tambin se realizaron enfrentando las cepas aisladas lipolticas con las cepas del inculo, para evaluar si las cepas seleccionadas como lipolticas, tienen efecto antagnico frente a las cepas del inculo. La cepa L1 (Figura 5) present efectos antagnicos con las cepas 3P (Proteoltica), 4 A (Amiloltica), 5AP ( Actividad compartida: Amiloltica y Proteoltica), 8AP ( Actividad compartida: Amiloltica y Proteoltica) y 14AP (Actividad compartida: Amiloltica y Proteoltica) . Se tomo como dimetro de halo representativo o inhibitorio (> 5mm). Los resultados reflejan que la cepa L1 tiene efecto antagnico. Las pruebas antagnicas fueron realizadas en un medio que contena tres fuentes de carbono para cumplir con las exigencias nutricionales de los microorganismos evaluados. El medio contena 1%(p/v) leche, 1%(p/v) almidn y lecitina (Anexo1). La pequea inhibicin presentada por la cepa 1 (Anexo 7) muy seguramente se present debido a que en este caso si hubo una competencia por sustrato, tambin se puede deber a que esta bacteria Gram negativa secreta sustancias que inhiben el crecimiento de las cepas 3 P, 5AP, 8 AP y 14P es por esto necesario que en futuros estudios se realice una identificacin bioqumica de dicho microorganismo para descartar una cepa patgena, ya que sera perjudicial si se tuviera en cuenta al momento de ser adicionado en el inculo debido a que este compost como ya se ha mencionado anteriormente es utilizado en cultivos propios de la regin.

Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolticas con cepas de inculo Fuente: Autores, 2007

6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO Cabe resaltar que se hizo un estudio preliminar realizando una curva de 12 horas, y al observar que el microorganismo, correspondiente a la cepa L3 no lleg a su fase de muerte, se decidi realizar una curva de 18 horas. As mismo, en la curva de 12 horas se tom como medio control el medio tributirina, para realizar los respectivos recuentos (Anexo 6), arrojando resultados de ausencia de crecimiento en las primeras horas de la 0 a la 1 y , demostrando que el medio ptimo para su crecimiento es el medio lecitina. Este medio contiene cidos grasos simples los cuales son de fcil asimilacin por los microorganismos. De la misma manera se debe tener en cuenta que estos microorganismos se encontraban en caldo lecitina, y es probable que al momento de realizar la siembra a medio tributirina este pudo haber presentado estrs. Para esto se determin un recuento inicial el cual report un recuento inicial de 10*10 5 UFC/ml en caldo lecitina y se evalu su crecimiento, produccin de biomasa en funcin del tiempo (Figura 6). Es importante resaltar que el microorganismo no presenta una fase de adaptacin debido a lo mencionado anteriormente, presentando la fase exponencial desde la hora 0 a la 5

aproximadamente, observando luego su fase estacionaria hasta la hora 13, descendiendo as hasta su fase de muerte en la hora 18.

12 10 Log UFC/mL 8 6 4 2 0 0 5 10 Tiempo (Horas) 15 20

Figura 6. Curva Produccin de biomasa en funcin del tiempo Cepa L3. La cepa L3 no present fase de adaptacin, sino que el microorganismo comienza la fase exponencial aproximadamente a la hora 0 de fermentacin debido al pre inculo realizado, alcanzando su mximo punto en la hora 8, evidencindose una pequea fase estacionaria, para luego comenzar a descender hasta llegar a fase de muerte en la hora 18. Segn microscopia se observaron bacilos Gram negativos, este tipo de morfologa se evidencia en gran parte de las bacterias aisladas del suelo ya que estn involucradas en el reciclaje de nutrientes, es por esto que en el presente proyecto se obtuvieron dos cepas con estas caractersticas. Posteriormente se realiz una curva de crecimiento en caldo lecitina en donde se determin la formacin de biomasa (Anexo 6) por un tiempo de 18 horas del actinomycete aislado, para este al igual que la bacteria se realiz un inculo en 100 ml de caldo lecitina bajo las siguientes condiciones 55C, 12 horas a 150 rpm, para esto se determin un recuento inicial que report un valor de 25*107 UFC/ml.

14 12 10 Log UFC/mL 8 6 4 2 0 0 5 10 Tiempo (Horas) 15 20

Figura 7. Curva de crecimiento cepa L2. Actinomycete Fuente: Autores: 2007. Como se observa en la figura 7 de la hora 0 a la 8 se observa la fase de crecimiento denominada trofofase que es donde se producen metabolitos secundarios, en este caso lipasas. La ideofase se evidencia desde la hora 10 hasta la muerte que se da a la hora 18. Por ultimo, la produccin de biomasa de los dos microorganismos evaluados present un comportamiento ascendente en la produccin de biomasa. El descenso durante las curvas de crecimiento puede deberse al agotamiento gradual de nutrientes presentes en el medio lecitina (Ramrez et al., 2004). De la misma manera se debe tener en cuenta que en procesos de fermentacin el crecimiento de los microorganismos se ve relacionado con el tipo del medio, la temperatura, el pH, la composicin del medio, el volumen de inoculacin, la aireacin entre otros ( Snellman, 2004). 6.3 CURVA DE CALIBRACIN La curva de calibracin (Anexo 4) reporto un factor de correlacin (r2) de 0,996 indicando la estrecha relacin entre los valores del eje X y los de Y, que finalmente se ve representada en la distribucin lineal de la curva y por ende el comportamiento normal de los datos. Sabiendo que el valor de r2, en los casos de la curva de calibracin, debe estar cercano a 1 (Otlora et al., 2003).

6.3.1 ACTIVIDAD LIPOLTICA La fermentacin de la cepa 3 tuvo un perodo inicial de 12 horas, bajo las siguientes condiciones 150rpm a 55C, luego al observarse que el microorganismo no lleg a su fase total de muerte se realizaron pruebas de 18 horas, en total se tomaron14 muestras, las cuales fueron puestas a evaluacin enzimtica lipoltica por la tcnica de p-nitrofenol, reportando los valores en el Anexo 5. 6.3.1.1 Estandarizacin del tiempo de contacto entre el sustrato y el extracto crudo La primera evaluacin realizada fue la evaluacin del tiempo de contacto, en el cual se cuantificaran ms unidades lipolticas, esto se hizo evaluando 30 y 60 minutos. En los datos arrojados en la figura 14 si existen diferencias significativas entre estos dos tiempos de contacto con un p<0,05 aceptando la hiptesis nula. Sugiriendo que el mejor tiempo de contacto es el de 30 minutos pues es en este donde se ve mas la cuantificacin de la actividad lipoltica (Figura 8). As mismo cabe resaltar que segn estudios reportados por Gessesse et al., 2003, se tom un tiempo de contacto de 10 minutos, porque es en este tiempo donde se presenta una mayor actividad enzimtica. Aunque, Neerupma y Jagdeep, 2006 reportan un tiempo ptimo de 45 minutos.

30 25 20 UL 15 10 5 0 30 T. contacto 60

Figura 8. Tiempo de contacto

6.3.1.2 Estandarizacin de diferentes concentraciones de sustrato La estandarizacin de la tcnica, se realiz probando diferentes concentraciones de pnitrofenil palmitato (0,08%(p/v), 0,5%(p/v) ,1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)). Transcurrido el tiempo de fermentacin 24h/55C/150 rpm de las cepas seleccionadas, la enzima se obtuvo por centrifugacin, para la evaluacin cuantitativa de la actividad enzimtica de cada una de las cepas, utilizando las diferentes concentraciones de sustrato anteriormente mencionadas con el fin de determinar la concentracin ptima en relacin con la mxima actividad lipoltica. Para llegar a encontrar la concentracin en la cual se obtienen ms unidades lipolticas, primero se hizo un ensayo con las siguientes concentraciones 0,08%(p/v),0.5%(p/v),1%(p/v) y de este primer ensayo se obtuvo que no hay diferencias significativas (Anexo 10) entre las concentraciones de sustrato utilizadas, rechazando la hiptesis nula con un p > 0,05.(Figura 9). Sin embargo la concentracin del 1% se acerca ms al valor de la media por lo tanto, se decidi probar concentraciones ms altas para observar si as se logra encontrar la concentracin de sustrato en la cual cuantifique mas la actividad enzimtica. As mismo durante estas evaluaciones se realiz la evaluacin de la produccin de biomasa en funcin del tiempo (Figura 10).
18 16 14 12 UL 10 8 6 4 2 0 0,08 0,5 C. sustrato 1

Figura 9. Evaluacin de las diferentes concentraciones de sustrato.

Biomasa L3 vs UL al 1%
14 12 Log 10 UFC/ml 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiempo (horas) 14 12 10 UL 8 6 4 2 0
Log 10 UFC/ml UL

Figura 10. Curva de UL al 1% y produccin de biomasa en funcin del tiempo. La produccin de enzima se lleva a cabo desde la hora 0 hasta la hora 8, se observa de la misma manera un aumento en la produccin de biomasa, lo cual indica que esta se encuentra asociada con la produccin de enzima, como ya se ha reportado (Ra et al., 1997). De la misma manera la alta produccin de lipasa fue observada en la fase logartmica en estudios presentados por Strnsky, 2006. Por otra parte, en estudios realizados por Moreno et al., 2001 se evidencia una alta produccin enzimtica asociada a la fase de crecimiento de los microorganismos. Observando que este crecimiento es directamente proporcional a la produccin enzimatica, segn los estudios realizados por Janny en el 2001. En el segundo ensayo se evaluaron las concentraciones de 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v), y en esta segunda evaluacin tampoco se encontraron diferencias significativas entre estas concentraciones con un p>0,05 rechazando la hiptesis nula (Figura 11). De la misma manera se evalu la produccin de biomasa en funcin del tiempo (Figura 12).

30 25 20 UL 15 10 5 0 1 1,5 C.Sustrato 2

Figura 11. Segunda evaluacin de diferentes concentraciones de sustrato al 1%, 1.5% y 2%. >
Biomasa L3 vs UL al 1,5%
14 12 Log 10 UFC/ml 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiempo (horas) 35 30 25 UL 20 15 10 5 0
Log 10 UFC/ml UL

Figura 12. Curva de UL al 1.5% y produccin de biomasa en funcin del tiempo Segn lo observado, al igual que en la figura 14 hay un incremento en la produccin enzimtica conforme aumenta su biomasa, observando la ptima produccin en la hora 10 aproximadamente. Es importante tener en cuenta que en estudios recientes se ha demostrado que la produccin de las lipasas es afectada por el tipo del medio, la temperatura, el pH, la composicin del medio, el volumen de inoculacin, la aireacin entre otros. La composicin del medio de cultivo en particular la incorporacin de diferentes sustancias lipdicas, pueden resultar de diferentes fuentes de produccin de isoenzimas. Reportando en otros estudios que las lipasas y la especificidad por la

estereasa pueden ser modificadas variando las condiciones operacionales durante el crecimiento (Arpigny y Jaeger, 2000). 6.3.1.3 Estandarizacin con diferentes volmenes de extracto crudo 20l, 500l y 700l Adems de probar diferentes concentraciones de sustrato tambin se probaron diferentes volmenes de extracto crudo para ver cual volumen cuantificaba ms enzima. Transcurrido el tiempo de fermentacin 24h/55C/150 rpm de la cepa seleccionada, la enzima se obtuvo por centrifugacin, para la cuantificacin de la actividad enzimtica, as mismo en otros estudios para la extraccin de la enzima se manejaron parmetros similares al de este estudio; se centrifuga a 5000 g por 10 minutos a 4C , de aqu se obtiene el sobrenadante que es la fuente de la enzima, para determinar la actividad lipoltica utilizaron al igual que p-nitrofenil palmitato como sustrato y una solucin stock de p- nitrofenil a 20 mM fue preparada usando isopropanol. Trabajando con la solucin de sustrato la cual fue preparada diluyendo el p-nitrofenil con la solucin stock 1:20 utilizando 20 mM Tris HCL buffer (Gessese, 2003). Se utilizaron diferentes volmenes de extracto crudo (20l, 500l y 700l) con el fin de determinar el volumen ptimo en relacin con la mxima actividad lipoltica, encontrando que existen evidencias significativas (Anexo 10) entre los tres volmenes evaluados aceptando la hiptesis nula con un valor de p < 0,05 (Figura 13). Con este resultado los siguientes experimentos fueron realizados sin el volumen de 20 l. sta diferencia estadsticamente significativa demuestra que la cantidad de extracto es demasiado pequea para llevar a cabo la hidrlisis del ster p- nitrofenilo de propionato (sustrato) (Jenny, 2001).

30 25 20 UL 15 10 5 0 20 500 V. de extracto 700

Figura 13. Estandarizacin de los diferentes volmenes de extracto crudo. Luego de descartar el volumen de 20l, se realiz otro anlisis para ver si existan diferencias significativas entre las concentraciones de 500l y 700l, encontrando, que entre estos dos volmenes no existe diferencia significativa, rechazando la hiptesis nula con un valor de p >0,05 (Figura 14). Es as que con estos resultados para trabajos futuros se aconsejara utilizar el volumen de extracto crudo de 500l, ya que arroja resultados confiables y se disminuira volumen de extracto.

30 25 20 UL 15 10 5 0 500 V. de extracto 700

Figura 14. Estandarizacin de los diferentes volmenes de extracto crudo. Como se observa en la figura 16, no existen diferencias significativas entre los volmenes evaluados. Confirmando los estudios de Neerupmaa Nawani y Jagdeep Kaur, 2006, que

usaron un volumen de trabajo entre 500l y 700l para sus estudios de cuantificacin de lipasas extracelulares de Bacillus sp. La adicin de Triton-x100 al buffer y al nitrofenil palmitato, hace que en el momento de la cuantificacin de la actividad enzimtica, permita que la molcula de la enzima se disperse cuando entra en contacto con esta solucin, lo que facilita la degradacin de los lpidos (Shuen et al., 1996). Segn un estudio de Moreno et al., 2001 la produccin de unidades lipolticas en microorganismos aislados de una industria lctea arrojan valores entre 86,91-91,35 UL, comparando con los resultados del presente estudio las unidades lipolticas obtenidas oscilaron entre los valores de 28 y 31 UL, observando un nivel bajo de produccin de enzima. Puede deberse a que el sitio de aislamiento de microorganismos lipolticos del presente estudio no contiene niveles altos de grasa. Por otra parte en estudios realizados por Janny et al., 2001 se observan valores enzimticos mucho mas bajos (0.26 UL y 0.21UL) que los obtenidos en el presente estudio, debido a que su fuente de aislamiento fue la caa de azcar. Segn lo anterior, se corrobora que hay una relacin directa entre las caractersticas del halo de hidrlisis y la actividad enzimtica, ya que los halos obtenidos por Moreno et al., 2001 fueron de 9 mm de dimetro, a diferencia de este estudio que fueron de 1.5 mm. 6.4 Toma de muestras Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza, contenido ruminal y cascarilla de arroz (Figura 15). As mismo, se llevo a cabo la toma de muestras, correspondiente para el anlisis de patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. Sin reportes de temperatura al momento del montaje, debido a que estos se comenzaron a evaluar desde el da 3.

Figura 15. Conformacin de las pilas. Fuente: Autores 2007. 6.4.1 Determinacin de pH y Temperatura Durante las 8 semanas que dur el proceso de compostaje, se determin pH y temperatura a las 3 replicas (Figura 16). La temperatura se determin diariamente y el pH semanalmente. El proceso de compostaje, se describe comnmente como un proceso aerbico de degradacin de materia orgnica, donde el calor esta relacionado con el consumo de oxgeno debido al metabolismo microbiano, dando como resultado un incremento en la temperatura (MacGregor et al., 2001).

Figura 16. Medicin de Temperatura. Fuente: Autores 2007.

Un sistema de compostaje es dinmico cuando hay una intensa actividad biolgica, debido a los cambios en el sistema y a las condiciones del medio ambiente, en especial el incremento en la temperatura (Sundberg, 2005). De la misma manera el valor de pH vara en el compost con el tiempo durante el proceso, en este el pH inicial de la fraccin orgnica de los residuos slidos urbanos se encuentran en valores de 5 y 7. Se debe tener en cuenta que durante el proceso de compostaje se presentan tres fases de acuerdo a la temperatura y a su efecto sobre los microorganismos; la primera mesoflica o fase de temperatura moderada; hace que la temperatura se eleve rpidamente hasta los 40C; segunda, la termoflica, donde se alcanzan temperaturas de 65C, la cual puede durar pocos das o semanas y finalmente la fase de maduracin y de enfriamiento que tiene una duracin de semanas, obteniendo valores de temperatura de 40C hasta alcanzar la temperatura ambiente que indica que alcanz la fase de maduracin. Por lo anterior, fue importante llevar a cabo un monitoreo de la temperatura, cabe anotar que los resultados obtenidos son de los promedios alcanzados por las tres pilas, ya que estas corresponden a un solo tratamiento (Anexo 2) (Figura 17).

70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Semanas

10 8 pH 6 4 2 0 Temperatura (C) pH

Temperatura C

Figura 17. Resultados de pH y Temperatura vs. Tiempo durante el proceso de compostaje de residuos orgnicos, Fuente: Autores, 2007 De la misma manera, la energa liberada al inicio del proceso se emplea para elevar la temperatura de la masa en el proceso secando el material por evaporacin (Gmez, 1998), lo que permite el paso a la degradacin de diversos compuestos ya que a medida que aumenta la temperatura se transformaron en molculas ms sencillas para

que microorganismos presentes en bajas temperaturas sinteticen completamente hasta obtener compost. Teniendo en cuenta los resultados observados en la figura 4, se puede decir que las pilas comienzan a salir de la etapa mesoflica al tercer da, ya que se registra un valor de 50.21 C. En cuanto al pH, se observa un valor neutro lo cual indica que va en aumento para alcanzar la etapa termoflica. A partir de la segunda semana se evidencia igualmente un aumento de ambas variables, observando que el punto mximo se obtiene en la semana 6 cuando alcanza la etapa termoflica, encontrando una temperatura de 65.2C y un pH entre 8 y 9 debido a que se presenta un consumo de cidos orgnicos por parte de los microorganismos, adems en esta fase forman esporas a manera de resistencia (Trautmann et al., 1999). Por otro lado, el pH sufre cambios durante el proceso de compostaje, debido a los cambios en la composicin qumica. En general el pH cae por debajo de la neutralidad en el comienzo, durante la formacin de cidos orgnicos y mas adelante sube alrededor de la neutralidad porque los cidos orgnicos son consumidos y hay produccin de amonio, es por esto que durante el monitoreo se observ un aumento a medida que pasaban las semanas, hasta que se alcanz un pH cercano a la neutralidad. Sin embargo, mientras ocurre este cambio de acidez a neutralidad, se presentan alrededor de la semana 4 valores cercanos a la alcalinidad, esto debido a la adicin de cal (10 Kg/T de residuos) que corrigi la acidificacin (Galindo et al., 2005); esto a su vez evita presencia de vectores as como malos olores. De la misma manera se sabe que al adicionar cal o hidrxido de calcio se aumenta la velocidad de degradacin de materiales orgnicos, debido a la activacin de enzimas termfilas, que actan principalmente en pHs comprendidos entre 7 y 9; este uso a su vez tiene una desventaja ya que se presentan prdidas de nitrgeno en forma de amoniaco, debido al pH ligeramente bsico que favorece su formacin (Gmez, 1998). Finalmente en la semana 9 los resultados arrojados denotan una cada poco notoria tanto del pH como de la temperatura, alcanzando valores de 6,5 y 52.45C respectivamente. Lo anterior puede atribuirse a que probablemente hubo un largo perodo de termofilia (5 semanas) debido a que quiz ocurrieron desigualdades en la homogenizacin de los

residuos en el momento del volteo (Galindo et al., 2005) se present un alto porcentaje en la fuente de carbono, en este caso Residuos de Plaza (55%) (Sylvia et al., 1999). De la misma manera cabe resaltar que el pH en el proceso de compostaje es influenciado por el CO2, el cual se forma durante el proceso de descomposicin, el cual puede evaporarse como gas o disolverse en forma lquida como cido carbnico (H2CO3), bicarbonato (HCO3) y carbonato (CO3 -2). Este sistema tiene dos constantes de disociacin (pKa) 6.35 y 10.33 a 25C, las cuales tienden a neutralizar el pH en el compost, aumentando un pH bajo y reduciendo un pH alto (Sundberg, 2005). El amonio es formado cuando hay una descomposicin de las protenas durante la fase inicial del compostaje gran parte del nitrgeno es metabolizado y retenido por microorganismos que se encuentran en etapa de crecimiento (Sundberg, 2003). El amoniaco tiene un pKa de 9.24 a 25C, lo que hace que haya un incremento en los valores de pH. As mismo, como ya se mencion anteriormente, otro de los factores que afectan dichos valores son los cidos orgnicos, donde predominan el acido actico y el lctico, estos se han demostrado en estudios recientes que pueden disminuir el pH hasta valores de 4.14 (Sundberg, 2005). 6.5 ANLISIS DE MICROORGANISMOS PATGENOS Escherichia.coli y Salmonella sp. El control sanitario del compost es de vital importancia, ste debe ser tratado de manera adecuada debido a que ser utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en agricultura orgnica o inorgnica, dando lugar a la contaminacin de los productos y/o de las fuentes de aguas, por lo que su aplicacin descontrolada constituye un peligro para la salud pblica y una amenaza para el medio ambiente por la exposicin a microorganismos patgenos que esto representa (Fundases, 2006). 6.5.1 NMP de Salmonella con medio Rappaport Vassiliadis semislido modificado A lo largo del proceso se espera una reduccin de los agentes patgenos por accin de diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad, sustancias antibiticas, entre otras (Turner, 2001).

En cuanto a la tcnica despus del tiempo de incubacin de cada juego se tomaron los tubos con medio TSB que presentaron turbidez para llevar a cabo una siembra en microgota (30ul), en medio Rappaport Vassiliadis semislido modificado (Figura 18), el cual busca aislar cepas mviles de Salmonella sp.,detectando alrededor de la zona de inoculacin un halo de crecimiento. Despus del tiempo de incubacin, nicamente para las muestras iniciales, se repicaron en medios selectivos XLT4 y Sulfito Bismuto (Figuras 19 y 20) (EPA, 1682).

Figura 18. Medio semislido Rappaport modificado con halo Fuente: Autores, 2007

Figura 19. Medio XLT4 con colonias presuntivas Fuente: Autores, 2007

Figura 20. Medio BS. Con colonias presuntivas Fuente: Autores, 2007

Teniendo en cuenta el fundamento del medio, para XLT4 se seleccionaron aquellas cajas que presentaron colonias rosadas o rojas con centro negro y para Sulfito Bismuto, colonias del color del medio con centro negro (Tabla 7), para posteriormente llevar a cabo

la realizacin de las respectivas bioqumicas TSI, LIA y rea (Anexo 8) (EPA Mtodo 1682, 1996). Tabla 7 a, b,c Medios XLT4 y Sulfito Bismuto (Muestras Iniciales)
Promedio del No de Colonias Caractersticas Medio XLT4 2 1 1

Pila No 1 1. Juego serie de cinco tubos 2. Juego serie de cinco tubos 3. Juego serie de cinco tubos

Medio B.S 2 1 1

Fuente: Autores, 2007

Promedio del No de Colonias Caractersticas Medio XLT4 2 2 1

Pila No 2 1. Juego serie de cinco tubos 2. Juego serie de cinco tubos 3. Juego serie de cinco tubos

Medio B.S 2 1 1

Fuente: Autores, 2007

Promedio del No de Colonias Caractersticas Medio XLT4 1 1 1

Pila 3 1. Juego serie de cinco tubos 2. Juego serie de cinco tubos 3. Juego serie de cinco tubos

Medio B.S 2 1 1

Fuente: Autores, 2007

Luego de realizar las bioqumicas (Figura 21) estas tres arrojaron para algunos resultados negativos y para otros positivos para Salmonella sp, es por esto que se debe tener en cuenta que estas tres bioqumicas deben ser positivas (Anexo 9), informando tanto para muestras iniciales como finales: < 0,006473 NMP/4g, resultado ptimo y adecuado al comparar con el reportado por la NTC 5167 (< 1 NMP/4g).

Figura 21. Resultados de Bioqumicas para identificacin de Salmonella sp. (TSI, LIA y rea positiva) Fuente: Autores, 2007 Considerando los resultados anteriores, es importante tener en cuenta la relacin de los microorganismos patgenos con la temperatura de exposicin a la cual se presentar su respectiva destruccin. Debido a esto importante enlazar los resultados de temperatura obtenidos en las pilas para poder analizar la eliminacin de ste patgeno. Para llevar a cabo la destruccin de Salmonella sp. es necesario exponerla a temperaturas entre 55C y 60C temperaturas que se evidenciaron entre las semanas 2 y 4 del proceso de compostaje. As mismo, en algunos estudios se ha demostrado que organismos fecales son destruidos en el propio proceso, si las temperaturas en el rango termoflico se mantienen por un tiempo suficiente y todo el material es sujeto a dichas temperaturas. Las bacterias patgenas se destruyen rpidamente cuando todas las partes de la pila de compost estn sujetas a temperaturas de 60C durante 30 a 60 minutos (Islam et al., 2004). Cabe resaltar que este microoranismo a diferencia de Escherichia coli es termosensible, es por esto que probablemente se obtuvo una total eliminacin del patgeno (Turner, 2001).

La norma ICONTEC 5167, 2004, especifica la ausencia de Salmonella sp., y de acuerdo a los resultados se indica que los materiales con los que se elaboraron las pilas en ningn momento presentaron este indicador, por lo que el producto cumple con la norma colombiana en materia de patgenos humanos (Anexo 9).

6.5.2 NMP Escherichia coli Posterior a la incubacin a 37C por 24 horas, se tomaron como positivos (Tabla 8 y 9) aquellos tubos que presentaron turbidez, fluorescencia con Luz UV a 365 nm y prueba de indol positiva al adicionar reactivo de Kovacs (Figuras 22 y 23).

Figura 22. Turbidez e indol positivo

Figura 23. Fluorescencia Positivo

Tabla 8. Promedios Resultados Materias Primas MATERIA PRIMA Rumen Poda RESULTADO NMP/ 4 g >2400 1100

Cascarilla 1100 Residuos de plaza 4 Fuente: Autores, 2007.

Tabla 9. Promedios Muestras Finales RESULTADO Rplica NMP/ 4 g Pila 1 4 Pila 2 180 Pila 3 8 Fuente: Autores, 2007. Los resultados finales evidencian en la pila 2 que hubo una diferencia en el muestreo, ya que se observa un valor alto a diferencia de las otras dos pilas. De la misma manera los resultados arrojados muestran una disminucin al relacionar las muestras iniciales con respecto a las finales, aunque es importante resaltar que en estudios se ha demostrado que el tratamiento trmico provoca la reduccin de los indicadores fecales a niveles comparables a muchos patgenos, particularmente bacterias patgenas, pero la concentracin inicial de los indicadores es normalmente mayor en factores de 10 que la de los patgenos, por lo que aunque su nmero disminuya siempre sobrevivir una cantidad apreciable de estos microorganismos (EPA, 1992). Esto se debe a diferentes factores como el origen de los materiales de elaboracin de las pilas, el comportamiento, el tiempo de duracin de las fases, el pH, la humedad, la temperatura y la frecuencia de los volteos, entre otros. De igual forma, se puede considerar que la adicin inicial de cal en grandes proporciones durante la conformacin de las pilas, gener alcalinidad en el medio facilitando el crecimiento microbiano y estimulando su actividad enzimtica (Turner, 2001). As pues, se ha demostrado que en algunos casos se puede inducir la proliferacin de agentes patgenos, los cuales pueden emerger y causar infecciones por el manejo del material orgnico de uso agrcola. De igual forma, se ha encontrado resistencia y

supervivencia de Escherichia coli a temperaturas termoflicas de 60C de 2 a 21 meses, debido a que este microorganismo se mantiene en fase de latencia y al final se expresa nuevamente ( Lemunier et al., 2005). En la degradacin llevada a cabo en termofilia 60-70C se estimula el crecimiento de hongos y bacterias, los cuales sintetizan compuestos complejos, en este transcurso de degradacin se generan mezclas de antibiticos y sustancias txicas (Ciemat, 2000). De esta manera, la acidificacin del pH durante el proceso de compostaje depende de la produccin de sustancias antibiticas, cidos o fitotoxinas, que pueden llegar a destruir una gran parte de la poblacin patgena. 6.6 ANALISIS FISICOQUMICOS A partir de estos resultados se determin la calidad del bioabono obtenido. Los resultados fueron determinados por el laboratorio de referencia AGRILAB expresados en base seca (Tabla 10).

ANLISIS DE MATERIALES ORGNICOS -Composicin nutricional IDENTIFICACIN ANLISIS DE MATERIALES ORGNICOS Humedad CARACTERIZACIN Nitrgeno (Norg) IDENTIFICACIN Fsroro total Humedad (%) Potasio total Cenizas (%) Calcio total Perdidas por volatilizacin (%) Magnesio total Carbono Orgnico Oxidable (%) Azufre total Ph Hierro total Densidad (g/c.c) Manganeso total Conductividad Elctrica (Ds/m) Cobre total Capacidad Retencin Humedad (%) Zinc total Capacidad Intercambio Catinico Boro total (Norg) (%) Nitrgeno Sodio total C/N Residuo insoluble en cido (Promedio de tres replicas de pilas de compostaje) (Promedio de tres replicasSECA de RESULTADOS EN BASE de pilas compostaje) RESULTADOS EN BASE SECA Fuente: AGRILAB, 2007

INICIAL 66,9 1,86 INICIAL 1,126 66,9 2,1 38,9 3,37 61,1 1,01 25,36 0,3 8,13 0,77 0,45 43,13 7,16 30 231 127 55,9 30,33 1,86 4350 13,6 29,26

FINAL 42,03 1,62 FINAL 1,03 42,06 2,01 56,86 3,31 43,13 1,04 13,2 0,28 7,57 0,84 0,67 431 11,9 28,6 103 118,3 49,1 31 1,62 4516,6 8 48,76

La humedad es uno de los factores ms importantes en el proceso de compostaje. Si su contenido es muy bajo, se detiene la actividad microbiolgica del proceso; y si es muy alto se dan condiciones anxicas porque el agua desplaza al aire de los espacios libres existentes (Soto, 2003). Para que un proceso de compostaje sea exitoso es necesario que la humedad de la materia orgnica inicial se encuentre entre el 40 y 60%(Sylvia et al.,1999) , sin embargo este parmetro comparado con la humedad inicial de las replicas de pilas de compostaje se acerca poco a la norma, observndose que durante el transcurso del proceso este disminuy considerablemente. El porcentaje de humedad al finalizar el proceso fu alto (42,3%) de acuerdo al lmite establecido en la NTC 5167, 2004 reportando que el lmite mximo de humedad es 35% este hecho evidencia la necesidad de alargar el tiempo de la etapa de maduracin. Segn otros reportes para que un compost sea comercialmente aceptable debe tener una humedad < 40%. (Pal et al., 1996). Esto hace pensar que la humedad se pudo ver influenciada por las materias primas empleadas, sabiendo que los residuos de plaza y el contenido ruminal son los que presentan cantidades altas de humedad.

Por otra parte la densidad (g/c.c) se encuentra asociado a la porosidad, el cual se define como el espacio del material orgnico que no es ocupado por la matriz slida, que permitir el flujo de aire y de agua. Segn los resultados obtenidos (0.67%), este valor se acerca considerablemente a la norma ICONTEC (0.6%). Las altas porosidades (mas del 50 %) se consideran favorables para el adecuado desarrollo de las especies vegetales (Gmez, 1998). El carbono orgnico oxidable determina el contenido de materia orgnica, y la materia orgnica da ciertas propiedades al suelo, este valor debe aumentar mnimo al 15% para cumplir con lo establecido en la norma ICONTEC 5167 del 2004. El valor obtenido en este estudio cumple con lo que se establece en la norma puesto que se obtuvo un valor final de 13,2%. La capacidad de intercambio catinico (C.I.C) es la capacidad que tiene la materia

orgnica de extraer cationes del suelo como K+, Ca++, Mg++ aportndole nutrientes a la planta. Para abonos orgnicos esta debe ser mnimo de 30% .Se encontr un valor final de 49,1% obteniendo un resultado ptimo para lo que establece la norma ICONTEC 5167 del 2004. Este valor obtenido indica una alta capacidad de atraer cationes de la solucin de suelo, evitando su lixiviacin o prdida y mantenindolos para que la planta pueda tomarlos (Galindo et al., 2005) Por otra parte estn los parmetros que estn directamente influenciados por elementos como el carbono y el nitrgeno. La relacin C/N, obtuvo un resultado final de 8 .Este resultado, comparado con otros estudios realizados en un compost producido a partir de residuos urbanos slidos en la cuidad de Sogamoso de 4,26 es bajo , determinando que el origen de las materias primas usadas est directamente relacionado con la fuente de nitrgeno que es este caso es elevada, permitiendole a las bacterias que lo agoten rapidamente dejando el nitrgeno no utilizado en forma de amonio. De igual forma, se expres el porcentaje de nitrgeno total, dentro del cual se encuentra el nitrgeno mineral y orgnico. El orgnico es el elemento que forma parte considerable del suelo ya que supera el 98%. Por esta razn un abono de buena calidad debe estar reportado entre el 2% y 3% (Gmez, 2000). Es por esto que segn los resultados

obtenidos (1.63%) se observa un valor relativamente bajo lo cual puede deberse como un consumo excesivo de la fuente de nitrgeno para la sntesis de compuestos de carbono. Tambin se tuvo en cuenta el anlisis inicial y final de dos metales pesados cobre y zinc, la evaluacin de estos metales pesados en el compost es importante puesto que estos pueden aumentar su concentracin en las cosechas y ser txicos para los seres humanos. Estos dos metales no estn contemplados en NTC 5167, 2004. Sin embargo segn Labrador, 2001 el lmite permisible de estos metales son para cobre 450 ppm y zinc 1.100 ppm. Se observ que en los resultados obtenidos por el laboratorio de referencia se obtuvieron valores que estn en los rangos permisibles para estos metales en el tratamiento evaluado. En cuanto al contenido de macro y micronutrientes estos deberan aumentar al finalizar el proceso. Se espera que estos lleguen a valores superiores del 1% segn lo establecido en la norma ICONTEC 5167, muchos de estos nutrientes cumplieron este parmetro. El compost obtenido se clasifica segn la NTC 5167, 2004 en abono orgnico que es un producto solido obtenido a partir de la estabilizacin de residuos animales o vegetales.

7.- CONCLUSIONES Se aislaron 3 cepas L1, L2 y L3, de las cuales L1 present antagonismo. A partir de la cepa L3 con actividad enzimtica lipoltica se logr estandarizar una tcnica cuantitativa para detectar lipasas utilizando como sustrato principal el pnitrofenil palmitato utilizando concentraciones de sustrato desde 0.08% y un volumen de extracto crudo desde 500ul.

La cepa lipoltica L3 present una actividad mxima entre 29 y 30 UL definiendo una UL como la cantidad necesaria para liberar una una umol/min/L. El compost obtenido result con N orgnico1.59%, P 1.32%, K 2.53% y respecto a Escherichia coli y Salmonella sp presentaron una disminucin en la cantidad de probablemente porque las replicas alcanzaron una temperatura mxima de 65.2 en la semana 6.

8.- RECOMENDACIONES

Producir un inoculante biolgico con las 14 cepas que se han manejado en la empresa Bioagrcola del Llano adicionando las dos cepas lipolticas aisladas, con el fin de evaluar su actividad llevando a cabo un nuevo montaje de pilas.

Realizar curvas de actividad enzimtica manejando volmenes de extracto crudo entre 20 ul y 500 ul y tiempo de contacto entre 10 y 30 minutos. Caracterizar bioqumicamente las cepas aisladas y evaluar otras caractersticas como promocin de crecimiento vegetal y actividad enzimtica. Realizar estudios alternos para el aislamiento de microorganismos pectinolticos para potencializar la efectividad del inculo.

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Anexo 1

Medio Leche- Almidn al 1% Componentes Leche en polvo descremada Almidn Extracto de Levadura Peptona Universal Sulfato de Amonio Cloruro de calcio Fosfato monobsico de potasio Fosfato dibsico de potasio Agar Medio Lquido TSB Componentes en Peptona pancretica de casena Peptona de harina de soya Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Dextrosa Medio Rappaport Vassiliadis Modificado Componentes en g/l g/l 17g 3.0 5 2.5 2.5 g/l 10 10 2.5 2.5 0.5 0.5 0.1 0.1 15

Triptosa Cloruro de sodio Fosfato monopotsico Cloruro de Magnesio Verde Malaquita Agar Medio Lecitina Componentes Fosfato de amonio dibsico Cloruro de potasio Sulfato de Magnesio* 7 H2O Extracto de levadura Agar

4.59 7.34 1.4 10.93 0.037 2.7

g/100ml 0,10 0.02 0.02 0.3 2

Adicin de Yema de huevo: 1 yema en 100 ml de NaCl al 0.85% (p/v).

Anexo 2 Temperatura y pH de las 3 rplicas

REPLICA 1 DIAS
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

T C
47.3 48.5 50.1 51.3 51.8 52.4 53.6 N.R N.R 54.6 55.4 56.2 57.5 58.4 N.R N.R 60.9 59.2 54.8 50.9 52.3 N.R 52.8 53.1 53.4 53.9 54.7 54.9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 N.R N.R 55.6 50.3 52.8 54.5 57.3 N.R 61.7 64.2 63.1 60.7 58.5 58.6 N.R 60.2 59.3 60.5 61.2 N.R 60.7 N.R N.R 58.9 58.0 57.1 N.R 54.3 N.R N.R 51.2 50.7

FUENTE: BIOAGRICOLA, 2007

REPLICA 2 DIAS
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

TC 46.4 47.1 47.9 48.3 49.2 50.6 51.2 N.R N.R 53.8 54.5 55.9 56.7 58.7 N.R N.R 60.2 59.3 55.1 50.4 52.6 N.R 52.8 53.5 53.7 54.6 55.8 56.1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

N.R N.R 57.9 56.6 57.3 58.1 58.5 N.R 59.5 60.2 58.7 58.4 58.2 N.R N.R 58.7 60.3 60.3 60.7 60.5 60.2 N.R N.R 60.1 58.2 56.1 N.R N.R N.R N.R 52.1 50.3

FUENTE:BIOAGRICOLA, 2007

REPLICA 3 DIAS
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

TC 49.2 49.7 50.3 50.8 51.7 52.4 N.R N.R 54.8 55.9 60.8 61.9 63.2 N.R N.R 67.8 67.3 64.1 62.4 67.2 N.R 65.2 65.8 64.2 63.4 63.0 62.3 N.R
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

N.R 59.7 48.0 51.4 54.7 56.3 N.R 58.1 58.1 58.4 58.6 58.8 N.R N.R 60.3 61.5 62.4 62.0 60.1 60.1 N.R N.R 59.3 57.8 57.1 56.0 55.6 N.R 50.9 50.8 50.6 50

FUENTE: BIOAGRICOLA, 2007

Semana Junio 3 Junio 27 Julio 4 Julio 11 Julio 18 Julio 25 Agosto 9 Pila 1 7.3 8.06 8.17 8.16 8.4 8.32 6.8

Valores de pH Pila 2 7.2 8.07 8.35 8.41 8.4 8.1 7.04

Pila 3 7.5 8.0 8.0 8.25 8.17 7.75 6.96

Anexo 3 Preparacin de Buffer Fosfato Concentracin 1 M

1. Preparar 57.7 ml de Na2HPO4 concentracin 1M 2. Preparar 42.3 ml de NaH2PO4 concentracin 1M

3. Mezclar lentamente las dos soluciones 4. Ajustar pH a +- 7

Anexo 4 Curva Patrn p-nitrofenol Fueron elaboradas dos rplicas de la misma solucin stock de p-nitrofenil, con el fin de obtener datos significativos Concentracin (u mol/ ml) 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Ecuacin: Y: mx+b X: y-b/m m: 1.09 b:-0.06 r:0.99 Promedio de Absorbancias 0.175 0.267 0.346 0.486 0.577 0.717 0.829 0.918

Curva de calibracin p-nitrofenol. Fuente: Autores, 2007

Anexo 5

TABLAS DE DATOS DE LAS PRUEBAS REALIZADAS Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 12 horas de la cepa 3 con P-nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio lecitina .Con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos y Unidades Lipoliticas (umol/min/l)

Hora

Absorbancia 0.08% 0.037 0.138 0.180 0.196 0.251 0.272 0.342 0.305 0.292 0.281

UL (umol/m in/l) 2.9 6 7.3 7.8 9.53 10.16 12.3 11.16 10.66 10.43

Absorbancia 0.5% 0.044 0.128 0.222 0.313 0.354 0.364 0.388 0.378 0.364 0.351

UL (umol/mi n/l) 3.2 5.8 8.6 11.33 12.66 12.96 13.7 13.4 12.96 12.56

Absorbancia 1% 0.052 0.082 0.122 0.151 0.261 0.276 0.373 0.473 0.452 0.425

UL (umol/mi n/l) 3.4 4.4 5.6 6.5 9.83 10.2 13.23 16.26 15.58 14.8

0 1 1 2 4 6 8 10 12

Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 12 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio lecitina con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos

Hora 0 1 1 2 4 6 8 10 12

Absorbancia 0.08% 0.112 0.167 0.246 0.255 0.275 0.304 0.320 0.313 0.282 0.271

UL (umol/ min/l) 5.3 5.3 9.6 9.6 10.26 11.2 11.63 11.4 10.46 10.13

Absorbancia 0.5% 0.261 0.304 0.305 0.321 0.352 0.364 0.355 0.343 0.343 0.333

UL (umol/m in/l) 9.8 10 11.16 11.93 12.6 12.96 12.7 12.33 12.33 12

Absorbancia 1% 0.124 0.138 0.146 0.159 0.191 0.275 0.375 0.361 0.324 0.305

UL (umol/mi n/l) 5.6 6 6.2 6.73 7.7 10.26 13.3 12.86 11.73 11.16

Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos

Hora 0 1 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Absorbancia 1% 0.213 0.409 0.490 0.498 0.515 0.558 0.701 0.725 0.700 0.658 0.639 0.498 0.215

UL (umol/m in/l) 8,3 14.33 16.83 17.06 17.6 18.9 23.26 24 23.23 21.96 21.36 17.06 8.4

Absorbancia 1.5% 0.493 0.539 0.685 0.702 0.724 0.757 1.151 0.945 0.902 0.896 0.723 0.501 0.325

UL (umol/m in/l) 16.9 18.33 22.76 23.3 23.96 26.83 30.5 30.73 29.43 25.26 22 17.16 11.76

Absorbancia 2% 0.524 0.560 0.639 0.679 0.698 0.712 0.951 0.930 0.885 0.802 0.793 0.413 0.301

UL (umol/mi n/l) 17.86 18.96 21.36 22.6 23.16 23.6 30.93 29.43 28.9 26.36 26.1 14.46 11.3

Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos Hora 0 1 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbancia 1% 0.513 0.654 0.702 0.785 0.801 0.823 0.898 0.900 0.855 0.705 0.527 0.462 0.102 UL (umol/ min/l) 17.53 21.83 23.3 25.83 26.33 27 29.3 29.36 27.96 23.4 17.96 14.13 14.4 Absorbanci a 1.5% 0.637 0.750 0.778 0.785 0.793 0.824 1.155 0.906 0.899 0.878 0.756 0.585 0.398 UL (umol/min/ l) 21.3 23.16 25.63 26.13 26.93 28.26 29.33 29.53 29.33 28.7 23.13 19.73 11.76 Absorbancia 2% 0.542 0.650 0.679 0.702 0.750 0.785 0.998 0.899 0.795 0.755 0.746 0.520 0.415 UL (umol/mi n/l) 18.4 21.7 22.6 23.3 24.76 25.83 32.36 29.33 27.43 2.93 24.63 17.73 14.53

Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 60 minutos Hora 0 1 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorban cia 1% 0.541 0.560 0.585 0.602 0.689 0.791 0.802 0.850 0.799 0.658 0.499 0.205 0.125 UL (umol/min/ l) 9.18 9.48 9.86 10.11 11.45 13.01 13.18 13.91 13.13 10.98 8.55 4.05 2.83 Absorbancia 1.5% 0.610 0.650 0.692 0.701 0.710 0.761 0.787 0.859 0.865 0.899 0.823 0.639 0.539 UL (umol/mi n/l) 10.23 10.35 11.51 12.5 12.93 14.63 16.16 17.18 17.31 16.1 11.93 10.68 8.86 Absorbancia 2% 0.646 0.673 0.676 0.700 0.708 0.750 1.002 0.999 0.863 0.795 0.723 0.612 0.438 UL (umol/mi n/l) 10.78 11.2 10.11 11.61 11.75 12.38 16.23 16.2 14.11 13.06 11.96 10.28 7.61

Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 60 minutos Hora 0 1 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 UL (umol/mi n/l) 10.08 10.85 11.45 11.6 12.43 13.18 14.05 14.66 13.15 11.65 7.26 5.51 3.98 Absorbancia 1% 0.600 0.650 0.689 0.699 0.753 0.802 0.859 0.899 0.900 0.702 0.415 0.301 0.201 UL (umol/mi n/l) 11.15 12.68 12.95 13.21 13.4 15.7 18.33 17.83 16.33 14.33 11.55 9.85 5.88 Absorbancia 1.5% 0.670 0.770 0.787 0.805 0.817 0.867 0.878 0.889 0.893 0.895 0.855 0.620 0.598 UL (umol/ min/l) 10.78 12.01 10.93 11.85 13.18 13.58 17.78 16.38 14.7 14.63 13.38 10.38 8.41 Absorbancia 2% 0.605 0.726 0.655 0.782 0.802 0.827 1.103 1.012 0.901 0.897 0.815 0.619 0.490

Anexo 6 Recuentos de las cepas aisladas

CEPA L3 B HORA 0 30 1 1 y 30 2 4 6 8 10 12 14 16 18 RECUENTO UFC/ml 8,0E+05 3,00E+06 1,50E+07 2,00E+07 9,00E+08 1,20E+10 4,00E+10 1,80E+10 3,00E+10 2,10E+09 2,30E+08 8,00E+07 5,00E+05

CEPA L2 RECUENTO UFC/ml 3,0E+07 8,00E+07 5,00E+08 1,30E+09 2,80E+09 1,50E+10 2,30E+10 1,80E+12 1,50E+10 3,00E+09 1,00E+08 5,00E+06 2,00E+06

HORA 0 30 1 1 y 30 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Anexo 7 Resultados pruebas de antagonismo en mm

Fuente: Autores, 2007

Cepa No L1(R1) L1 (R2) L1(R3) L2(R1) L2(R2) L2(R3) L3(R1) L3(R2) L3(R3)

2P 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3P 1,0 0 1,6 0 0 0 0 0 0

4A 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0

5AP 1,3 1,5 1,0 0 0 0 0 0 0

6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8AP 1,5 1,3 1,0 0 0 0 0 0 0

9AP 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10AP 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11P 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12AP 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13P 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14P 1,4 1,2 1,5 0 0 0 0 0 0

Anexo 8 Pruebas Bioqumicas de las Colonias Positivas

Pila 1 Colonias presutivas Sulfito Bismuto y XLT4 1 Bioqumica Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Replica Negativo Positivo Positivo

2 3 4 5 Pila 2 1 2 3 4 Pila 3 1 2 3 4 5 6

Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea: Negativo TSI: Negativo LIA: Negativo Urea: Negativo TSI: Negativo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI:Positivo LIA:Negativo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA:Positivo Urea: Negativo TSI:Negativo LIA:Negativo Urea:Negativo TSI:Negativo LIA:Negativo Urea:Negativo TSI:Negativo LIA:Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA:Negativo Urea: Negativo TSI: Posititivo LIA:Positivo

Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo

Fuente: Autores, 2007