TRABAJO PRACTICO N 3: Preparacin de fantasmas de eritrocitos y protenas de citoesqueleto.

Objetivos: a) Estudiar la funcin y composicin del citoesqueleto en clulas eucariontes animales. b) Describir y clasificar las protenas asociadas al citoesqueleto. c) Aplicar diferentes tcnicas que permiten el aislamiento de protenas del citoesqueleto. A) Introduccin El citoesqueleto es un entramado tridimensional de microtbulos y microfilamentos que proveen el soporte interno para las clulas, anclando las estructuras internas, es una estructura dinmica que mantiene la forma de la clula, facilita la movilidad celular (usando estructuras como los cilios y los flagelos), y desempea un importante papel tanto en el transporte intracelular (por ejemplo, los movimientos de vesculas y orgnulos) y en la divisin celular. Microfilamentos ( Actina y Miosina ) De unos 7 - 5 nm (nanmetros) de dimetro. Estn formadas por una protena globular llamada actina que puede presentarse de dos formas: -Actina no polimerizada: la actina se encuentra asociada a la profilina que evita su polimerizacin. Representa la mitad de la actina de la clula y es utilizada para polimerizar microfilamentos cuando es necesario. -Actina polimerizada: es una doble hlice dextrgira de dos hebras de actina no polimerizada. Esta actina se puede encontrar asociada a otras protenas: -Protenas estructurales: que permiten la unin de los filamentos de actina -Protenas reguladoras: la ms importante es la miosina que permite la contraccin muscular al permitir que la actina se desplace sobre ella. Las funciones de los microfilamentos de actina son la contraccin muscular, la formacin de pseudpodos, el mantenimiento de la morfologa celular y, en la citocinesis de clulas animales, forma un anillo contrctil que divide la clula en dos. Filamentos intermedios Son filamentos de protenas de unos 12 nm de dimetro, son los componentes del citoesqueleto ms estables, dando soporte a los organelos. La expresin de las protenas que conforman estos filamentos, citoqueratina, vimentina y desmina, entre otras, dependen del tejido en el que se hallen. Su funcin principal es la organizacin de la estructura tridimensional interna de la clula. Microtbulos Los microtbulos son estructuras tubulares de 25 nm de dimetro que se originan en los centros organizadores de microtbulos y que se extienden a lo largo de todo el citoplasma y

estn formados por la polimerizacin de un dmero de dos protenas globulares, la alfa y la beta tubulina. Cada microtbulo est compuesto de tres protofilamentos formados por los dmeros de tubilina. Intervienen en diversos procesos celulares que involucran desplazamiento de vesculas de secrecin, movimiento de orgnulos, transporte intracelular de sustancias, as como en la divisin celular (mitosis y meiosis). La membrana del eritrocito est formada por una bicapa lipdica plana, donde predominan en el 80 % los fosfolpidos y el colesterol y en menor medida los glicolpidos y aminofosfolpidos, distribuidos asimtricamente. La membrana y citoesqueleto de eritrocitos est formado por fibras de espectrinas y (240.000 y 220.000 Da) que se unen entre ellas a travs de un complejo de unin formado por actina (40.000 Da) y tropomiosina (35.000 Da). El complejo de unin se une a su vez a la membrana plasmtica a travs de la banda 3 (100.000 Da) y ankirina (210.000 Da), y las fibras de espectrina se unen a la membrana plasmtica a travs de la banda 4.1 (82.000 Da). Estas protenas pueden ser fcilmente visualizadas cuando se realiza una electroforesis en gel desnaturante de los componentes de los fantasmas. Entre las protenas ms abundantes observadas en el gel de electroforesis se encuentran las glicoforinas (A, B, C y D, con pesos moleculares entre 20.000-36.000 Da), protenas de transmembrana que no forma parte del citoesqueleto. Por lo tanto, la obtencin de fantasmas de eritrocitos es un manera fcil y rpida de purificar los componentes de este citoesqueleto. En el caso de otras clulas, la ruptura libera los componentes del citoesqueleto a la solucin acuosa impidiendo su purificacin fcil y simultnea. B) Trabajo experimental 1) Un voluntario de cada grupo deber donar 5 mL de sangre, la que ser extrada con ayuda de una jeringa y un tubo Venoject con anticoagulante. 2) Transferir la sangre desde el tubo Venoject a un tubo plstico de 15 mL (tubo Falcon), agregar 7 mL de PBS y centrifugar a 3.000 rpm durante 15 minutos. 3) Retirar el sobrenadante poniendo especial atencin en eliminar la banda blanca de glbulos blancos que se encuentran sobre el pellet de eritrocitos. 4) Resuspender con suavidad el pellet en 15 mL de PBS y centrifugar a 3.000 rpm durante 15 minutos. 5) Extraer el sobrenadante, tomar 2 mL de eritrocitos con un gotario plstico y resuspenderlos en 5 mL de tampn de lisis (10 mM fosfato pH=7.4) agitando suavemente por aspiracin con el gotario.

6) Dejar la suspensin de eritrocitos durante 2 minutos en hielo para completar la lisis. Es importante que la incubacin se realice en hielo ya que esto ayuda a que la hemoglobina no se adhiera a los fantasmas. 7) Traspasar 1 mL de los eritrocitos lisados a un tubo Eppendorf y centrifugar a 4C a 14.000 rpm durante 30 minutos. 8) Retirar el sobrenadante, resuspender en 1 mL de tampn de lisis y centrifugar nuevamente a 4C a 14.000 rpm durante 30 minutos. 9) Si el sobrenadante est an rosado se debe lavar nuevamente en 1 mL de tampn de lisis y centrifugar a 14.000rpm durante 30 minutos. 10) Agregar 50 uL de tampn de carga de protenas (desnaturante) al pellet de fantasmas y calentar a 100C durante 10 minutos. 11) Almacenar la muestra a -20C hasta el prctico siguiente.

TRABAJO PRACTICO N 4: Anlisis de las protenas del citoesqueleto de eritrocitos Objetivos:

a) Adquirir nociones bsicas sobre la separacin de protenas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturante y no desnaturante. b) Comparar los componentes proteicos que constituyen el citoesqueleto de eritrocitos, mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. A) Introduccin En el prctico anterior, los fantasmas de eritrocitos fueron calentados a 100C con tampn de carga de protenas (desnaturante) para asegurar la denaturacin de las protenas. Este tampn de carga contiene B-mercaptoetanol (agente reductor que rompe los puentes disulfuro de las protenas y libera los polipptidos que las componen) y el detergente desnaturante SDS (el dodecil sulfato de sodio tiene carga negativa y se unen a las protenas. Confirindoles carga negativa para que puedan migar hacia el polo positivo durante la electroforesis). Para analizar las protenas de los fantasmas desnaturados con tampn de carga, se preparar un gel desnaturante de poliacrilamida. Este gel se prepara entre dos placas de vidrio y est compuesto por dos geles superpuestos, uno inferior y otro superior. El gel inferior, tambin llamado gel separador, contiene SDS y est preparado en tampn pH=8.8 y el gel superior o concentrador contiene SDS y est preparado en tampn pH=6.8. La diferencia de pH entre el gel superior e inferior permite que las protenas se aglomeren en la interfase de ambos geles (stacking) y comiencen la migracin dentro del gel inferior a partir de un mismo punto. Las protenas se separarn entonces slo por tamao y no por carga (ya que todas estn cargadas negativamente por efecto del SDS). La polimerizacin de un gel de poliacrilamida se induce por adicin de persulfato de amonio, que entrega radicales libres, y de TEMED (N, N, N, N tetrametiletilendiamina), que acta como catalizador ayudando la propagacin del sistema de polimerizacin. Una vez que el gel est preparado entre las placas de vidrio, se introduce el sistema en una cmara de electroforesis y se recubre con tampn de electroforesis desnaturante. Las muestras desnaturadas deben ser depositadas en los pocillos del gel de poliacrilamida as como un estndar que contiene protenas de peso molecular conocido (ste servir para determinar el tamao de las protenas presentes las muestras). La migracin electrofortica se realiza aplicando un voltaje de 180 Volts y se detiene cuando el colorante azul de cada muestra llegue hasta el lmite inferior del gel. Luego, se retira el gel de la cmara, se sacan las placas de vidrio, se tie el gel con un colorante para protenas (azul de Coomassie) y se destie para visualizar slo las protenas teidas. El tamao de cada una de las protenas se obtiene por comparacin con aquellas del estndar de peso molecular.