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Bioquímica de Sistemas
Proyecto
Alumnos:
Álvarez Flores Jazmín
Chávez Maya Yesenia
Lozano Amado Daniela
Ortega Vilchis Cristhian Leonardo
Pérez Santiago América Jannine
Asesores:
Q.F.B Azucena Lee Mendoza
Q.F.B Gabriela Escalante Reynoso
Grupo: 1552
Portada ……………………………………………………………………………………………………………………………………1
Justificación de Problema…………………………………………………………………………………………………………3
Marco teórico…………………………………………………………………………………………………………………………..4
Generalidades de Sangre
Composición………………………………………………………………………………………………………………..4
Paquete Celular……………………………………………………………………………………………………………6
Plasma………………………………………………………………………………………………………………………….6
Eritrocito
Estructura…………………………………………………………………………………………………………………….7
Función-Hemoglobina………………………………………………………………………………………………….8
Metabolismo Funcional……………………………………………………………………………………………….9
Grupo Hemo………………………………………………………………………………………………………………13
Eritropoyesis…………………………………………………………………………………………………………………………..17
Técnicas………………………………………………………………………………………………………………………………….18
Hemoglobina……………………………………………………………………………………………………………..18
Hematocrito……………………………………………………………………………………………………………….18
Fragilidad Osmótica……………………………………………………………………………………………………19
Bilirrubina libre…………………………………………………………………………………………………………..20
Conteo de Reticulocitos……………………………………………………………………………………………..21
Objetivos………………………………………………………………………………………………………………………………..22
Hipótesis…………………………………………………………………………………………………………………………………22
Cronograma……………………………………………………………………………………………………………………………26
Resultados………………………………………………………………………………………………………………………………27
Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………………………..32
Referencias…………………………………………………………………………………………………………………………….33
2
Planteamiento del problema
Justificación de Problema
Este proyecto, tiene como finalidad, saber qué efectos causa la administración de
eritropoyetina recombinante humana (rHu-EPO) en lotes de ratas wistar macho; es importante
destacar la importancia que tiene el uso de animales de laboratorio en el desarrollo de la
investigación biomédica, en este caso, la rata, la cual es reconocida como un modelo en la
investigación, elegida por ciertas cualidades como son: el tamaño pequeño, corto tiempo de
reproducción, fácil alimentación y sobre todo, la gran similitud que tiene su metabolismo con
el del humano; debido a ello, es posible experimentar metodologías que tendrán, en un futuro,
una aplicación directa en el ser humano.
3
forma, se aseguran de que llegan mayores cantidades de energía a los músculos y de que la vía
anaerobia y, por tanto, la fatiga muscular tarda más en aparecer, con lo que incrementan su
capacidad de esfuerzo y su resistencia.
Se ha demostrado que el uso de EPO hasta incrementar los niveles de hemoglobina por encima
de 13g/dl aumenta considerablemente el riesgo de fallecimiento por enfermedades
cardiovasculares. El aumento de la masa eritrocitaria va de la mano con el aumento de la
viscosidad sanguínea, lo que dificulta y ralentiza la circulación. Esto favorece la aparición de
trombos que pueden embolizar y producir infartos, de especial importancia en corazón y
cerebro, o episodios de muerte súbita.
Debido a estos pros y contras, resulta de vital importancia el estudio de dicha hormona
endógena, y corroborar, por medio de pruebas bioquímicas-hemáticas como son: Medición de
Hemoglobina, frotis sanguíneo, Conteo de reticulocitos, Hematocrito, Bilirrubina Libre y
Fragilidad Osmótica, la repercusión y efecto que causa en el proceso de eritropoyesis, en el
cual se puede ver afectado el metabolismo de los eritrocitos, que se verá reflejado en la
maduración y cantidad que se encuentran en el torrente sanguíneo; dicha investigación puede
ser extrapolada hacia el metabolismo humano, y tener una aplicación benéfica hacia la mejora
de la calidad de vida de la población.
Marco Teórico
Generalidades de Sangre
Físico: Un líquido con células en suspensión, que se mantiene en estado de solución en los
vasos sanguíneos y que al salir de ellos, por ejemplo: a través de una lesión, puede pasar al
estado de gel.
Con lo anterior se puede integrar una definición que incluya los aspectos más relevantes:
4
que se denomina plasma, en donde se encuentran suspendidos los elementos formes
(celulares) y disueltas algunas sustancias orgánicas e inorgánicas.1
Al dejarla en reposo, las células sedimentan y el plasma aparece como un líquido sobrenadante
de color amarillo claro (Ilustración 1). La sangre coagulada sufre modificaciones, entre las que
destaca la precipitación de fibrina, sustancia que forma la estructura fundamental del coagulo
(Ilustración 2).2
Suero y Coagulo
Ilustración 1
Ilustración 2
1
Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-
Iztacala, México. pp: 295
2
Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª
edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222
3
Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-
Iztacala, México. pp: 295
5
e) Transporte de células y agentes humorales del sistema inmune que protege el
organismo de los agentes patógenos, proteínas extrañas y células transformadas (es
decir: células del cáncer).4
• Paquete Celular
Las células constituyen algo menos de la mitad del volumen de la sangre; cuando la
sedimentación es completa, se observa que estas células forman tres capas. Los glóbulos rojos,
eritrocitos, fácilmente reconocibles por su color, son más densos y se acumulan en el fondo del
recipiente. Los glóbulos centrifugados constituyen alrededor de 45% del volumen de la
muestra de sangre. Encima de ellos puede verse una capa blanca delgada; esta capa
corresponde aproximadamente al 1% del volumen de la muestra; esta capa comprende
glóbulos blancas (leucocitos: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos) y
plaquetas (trombocitos). Las plaquetas, elementos sanguíneos de menor densidad, forman una
capa delgada y nacarada por encima de los glóbulos blancos.5
• Plasma
El plasma es el integrante extracelular líquido de la sangre (50% - 60% del volumen de sangre).
Está constituido por agua (90%) y moléculas orgánicas e inorgánicas (10%), proteínas,
carbohidratos, lípidos, catabolitos, enzimas, coenzimas, vitaminas, hormonas destinadas a
diversas partes del cuerpo (Ilustración 3).
El plasma sirve para mantener las constantes fisicoquímicas de la sangre (viscosidad, presión
osmótica, pH, etc.); se halla en equilibrio dinámico con los líquidos intersticial e intracelular;
transporta: anticuerpos sustancias alimenticias y de desecho, múltiples elementos naturales
con acciones biológicas particulares (hormonas, vitaminas, anticuerpos, etc.) y medicamentos
administrados. Alguna de estas sustancias, permanecen libres en el plasma; otras forman
compuestos químicos en especial con proteínas que las fijan en sus moléculas para
transportarlas. Estas permanecen constantes en el sistema circulatorio gracias a la función
realizada por los vasos linfáticos que las regresan al torrente sanguíneo.6
4
Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª
edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222
5
Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-
Iztacala, México. pp: 295
6
Ibíd.
6
Composición bioquímica del plasma sanguíneo
Ilustración 3
Eritrocito
• Estructura
Los eritrocitos o hematíes son, de entre todos los elementos formes de la sangre, los más
abundantes y determinan el color rojo de la misma. Actúan solo dentro del torrente
circulatorio, en donde fijan oxígeno a la altura de los pulmones para entregarlo a los tejidos y
fijan dióxido de carbono a la altura de los tejidos para llevarlo a los pulmones. El número de
eritrocitos en un milímetro cúbico de sangre es de 4.5 a 5 millones, en la mujer adulta y, de 5 a
5.5 millones en el hombre adulto. La vida media o tiempo que duran circulando, desde su
producción en la médula ósea, hasta su destrucción por el sistema de fagocitos
mononucleares, es de 120 en aproximación. Tienen forma de disco bicóncavo, con diámetro
entre 6 y 8 micrómetros (con promedio 7.2), anchura en la periferia: de 2 micrómetros, y en el
centro, de 1 micrómetro (Ilustración 4). Esta configuración del eritrocito le provee la mayor
cantidad de superficie posible en relación con su volumen, un atributo importante para el
intercambio de gases.7
7
Ibíd.
8
Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª
edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222
7
Forma y Tamaño del eritrocito Eritrocitos
os anormales
Ilustración 4 Ilustración 5
• Función-Hemoglobina
Hemoglobina (Metahemoglobina)
Grupo Hemo
Ilustración 6
8
La hemoglobina de una persona adulta normal, es la hemoglobina A, posee 2 cadenas alfa con
141 aminoácidos y dos cadenas beta con 146 aminoácidos, se le denomina alfa2-beta2. La
función principal de la hemoglobina es transportar oxigeno desde los pulmones, donde la
tensión de oxigeno es elevada, a los tejidos, donde es baja (Ilustración 7). A una tensión de
oxigeno de 100mm de Hg. En los capilares pulmonares del 95% -98% de la hemoglobina esta
combinada con el oxigeno. En los tejidos, donde la tensión de oxigeno puede ser tan baja
como 20mm de Hg., el oxigeno se disocia fácilmente de la hemoglobina; en este caso menos
de una 30% del oxigeno podría permanecer combinado con la hemoglobina.
Hemoglobina
Ilustración 7
La hemoglobina reducida es hemoglobina con hierro no unido al oxigeno. Cuando cada grupo
hemo está asociado a una hemoglobina con hierro no unido al oxigeno, la hemoglobina se
conoce como oxihemoglobina (HbO2). Tanto en la Hb como en el HbO2, el hierro permanece
en estado ferroso. Cuándo el hierro se oxida al estado ferrico, se forma metahemoglobina y la
molécula pierde su capacidad para transportar oxigeno o dioxido de carbono.9
Las vías metabólicas más importantes para el eritrocito maduro necesitan glucosa como
sustrato (Ilustración 8). Estas vías se refieren a:
9
Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-
Iztacala, México. pp: 295
10
Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros,
Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.
9
Metabolismo energético del eritrocito
Ilustración 8
Las principales vías están enmarcadas, los substratos y productos de cada vía están fuera del
marco. Hb, hemoglobina; MHb, metamoglobina; NAD, NADH, nicotinamida adenina
dinucleotidasa; ADP, adenosina difosfatasa; ATP, adenosina trifosfato; NADP, NADPH,
nicotinamida adenina dinucleotidasa fosfato; G-6-P, glucosa-6-fosfato; F-6-P, fructosa-6-
fosfato; Ga-3-P, gliceraldehido-3-fosfato; 2,3 DPG, 2,3-difosfoglicerato.
El potasio intracelular alto, el sodio intracelular bajo y un calcio intracelular muy bajo
(bomba de cationes)
Hemoglobina en forma reducida
Elevados niveles de glutation reducido
Integridad y deformabilidad de la membrana
Proporciona ATP para la regulación de la concentración intracelular de cationes (Na, K, Ca, Mg)
a través de bombas de cationes. El eritrocito obtiene energía en forma de ATP del
desdoblamiento de la glucosa por esta vía. Aproximadamente 90 a 95% del consumo celular de
oxigeno utiliza esta vía. Los eritrocitos normales no tienen depósitos de glucógeno. Dependen
por completo de la glucosa ambiental para la glucólisis. La glucosa penetra a la célula mediante
difusión facilitada, un proceso que no consume energía. Es metabolizada a lactato, donde
produce una ganancia neta de dos moles de ATP por un mol de glucosa.
10
Ilustración 9
Ilustración 10
Ilustracion 8 y 9. Explican los pasos en la reducción univalente del oxigeno y vías
enzimáticos que actúan sobre los metabolitos intermedios. Las vías enzimáticas
enzimáticas mostradas
sobre la derecha son las que procesan estos metabolitos sin formación del radical hidroxilo
altamente reac-tivo.
tivo. Este potente radical puede formarse por las reacciones que se ven a la
izquierda si las concentraciones de peroxido y superoxido
supero son suficientes.
11
transportadora de oxigeno en la sangre. Medicamentos oxidantes pueden interferir
interferi con la
metahemoglobina reductasa y producir valores aun más elevados de metahemoglobina. Esto
provoca cianosis.
2,3 – difosfoglicerato (DPG) el cual facilita la liberación de oxigeno a los tejidos. Este ciclo es
parte de la vía Emboden – Meyerhof y tiene por finalidad evitar la formación de 3 –
fosfoglicerato y ATP. El DPG esta presente en el eritrocito en una concentración de un mol
BPG/mol de hemoglobina y se une con fuerza a la desoxihemoglobina, manteniendo a la
hemoglobina
obina en estado desoxigenado facilitándose la liberación de oxigeno. El incremento en
la concentración de difosfoglicerato facilita la liberación de oxigeno a los tejidos mediante la
disminución en la afinidad de la hemoglobina para el oxigeno. De esta manera man el eritrocito
cuenta con un mecanismo interno para la regulación del aporte de oxigeno a los tejidos.
Ilustración 11
12
• Hemolisis: Trastornos metabólicos.11
La síntesis y final de la síntesis de protoporfirina, así como la incorporación del hierro a esta
para formar el heme, tiene lugar dentro de las mitocondrias (Ilustración 12). En cambio los
pasos intermediarios de la síntesis de protoporfirina ocurren fuera de estas, en la porción
soluble del citoplasma. Las mitocondrias rodean el núcleo del precursor eritroide. En ciertos
trastornos en los que hay un fallo de la incorporación del hierro al heme, se acumula dicho
hierro en el interior de las mitocondrias. La mayoría de las mitocondrias son expulsadas de la
célula junto con núcleo, y pocas que permanecen se pierden al cabo de un día o dos después
de que hematíe penetra en la circulación. Así pues, el hematíe maduro, al carecer de RNA y de
mitocondrias, no pueden sintetizar ni las cadenas de globina ni la porción heme de la
hemoglobina. Las reacciones enzimáticas que producen a la formación del heme pueden
resumirse de la siguiente manera.
11
Ibíd.
12
Daryl. K. Granner. Mayes. A. Peter. Murray Robert K. Robwell Victor W. (2001) Bioquímica de Harper.
15ª edición. Manual Moderno, México. Págs. 413-4123.
13
El succinil –CoA, formadao en las mitocondrias durante el ciclo de Krebs, se combina con
glicina para formar acido δ-aminolevulinico (δ- ALA). La enzima que cataliza esta reacción, (δ-
ALA)- sintetasa, limita la tasa de síntesis del heme. El fosfato de piroxinal es necesario como
coenzima para esta reacción.
14
Síntesis del Grupo Hemo
Ilustración 12
15
La destrucción de la hemoglobina en el cuerpo, la globina se degrada hasta los aminoácidos
que la destruyen, los cuales se reutilizan, y el hierro del heme ingresa a la reserva del hierro
también para su reutilización. También se degrada la porción de porfirina libre de hierro del
heme, sobree todo en las células reticuloendoteliales hepáticas, esplenicas y de la medula ósea.
Al parecer el catabolismo del heme proviente de la totalidad de las hemoproteinas se lleva
acabo enfraccion microsomal de las células mediante un comportamiento sistema enzimatico
e
denominado hem oxigenasa. Cuando el hem de las hemoproteínas llEga al sistema de la heme
oxigenasa, por lo general el hierro y constituye la hemina.
La hemina se reduce a heme con el NADPH y, con ayuda de mas NADPH, se añade oxigeno al
puente α- metenilo entre los pirroles I y II de la porfirina. El ion ferroso se oxida de nuevo a la
variante ferrica. Con la adición subsecuente de oxigeno, se libera el ion férrico, se produce
monóxido de carbono y de la escisión del anillo tetrapirrolico resulta
resulta una cantidad aquimolar
de biliverdina IX- α.
Ilustración 13
16
Eritropoyesis.13
• Funciones de la eritropoyetina:
• Aumento de eritropoyetina
Las etapas de desarrollo morfológico de la célula eritroide incluyen (en orden de madurez
creciente) (Ilustración 14).
• Proeritroblasto
• Eritroblasto basófilo
• Eritroblasto policromatófilo
• Eritroblasto ortocromático
• Reticulocito
• Hematíe, finalmente, cuando ya carece de núcleo y mitocondrias.
Serie Eritrocitica
Ilustración 14
13
Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-
Iztacala, México. pp: 295
17
Los eritrocitos de los mamíferos no poseen núcleo cuando llegan a la madurez, es decir que
pierden su núcleo celular y por lo tanto su ADN (los anfibios y aves tienen eritrocitos con
núcleo). Los eritrocitos también pierden su mitocondria y utilizan la glucosa para producir
energía mediante el proceso de glucólisis seguido por la fermentación láctica.
Los eritrocitos son producidos continuamente en la médula ósea de los huesos largos. (En el
embrión, el hígado es el principal productor de glóbulos rojos.) El bazo actúa como reservorio
de eritrocitos, pero su función es algo limitada en los humanos. Sin embargo, en otros
mamíferos como los perros y los caballos, el bazo libera grandes cantidades de glóbulos rojos
en momentos de estrés. Algunos atletas han tratado de explotar esta función del bazo
tratando de liberar sus reservas de eritrocitos mediante fármacos, pero esta práctica pone en
riesgo al sistema cardiovascular dado que éste no está preparado para soportar sangre cuya
viscosidad sea superior a la normal.
Técnicas
• Determinación de hemoglobina.14
El hematocrito venoso mide el tanto por ciento del volumen total de una muestra de sangre
venosa ocupado por los hematíes o, dicho de otro modo, es la relación entre volumen de
eritrocitos y el de sangre total. Se expresa como porcentaje o como fracción decimal.
14
Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros,
Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.
15
Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el
manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83
16
Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros,
Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.
18
Valores de referencia en ratas: Hto: 46%17
Hematocrito
Ilustración 15
Fundamento: La fragilidad osmótica eritrocitaria (FOE) es una técnica realizada para el estudio
de las membranopatías eritrocitarias. La membrana eritrocitaria es semipermeable, es decir,
permite el libre paso de agua a su través, restringiendo el paso de ciertos solutos iónicos como
el cloruro, sodio y potasio. Por ello, si el eritrocito se incuba en un medio hipertónico, el
eritrocito pierde agua y se deshidrata. Por el contrario, si el eritrocito se incuba en un medio
hipotónico, entra agua y el eritrocito se hidrata. Si la hipotonía del medio supera cierto límite,
se altera la membrana del eritrocito produciéndose una salida masiva de la hemoglobina hacia
17
Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el
manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83
18
www.alojamientos.us.es/hematologia/practicas_2007-08.pdf, 08 de Septiembre de 2008
19
el medio, dando lugar a la hemólisis. La intensidad de la hemólisis es directamente
proporcional al grado de hipotonía del medio (esto es, a mayor hipotonía mayor hemólisis).
Llamamos FOE a la medida realizada para determinar la capacidad de una población de
eritrocitos para resistir el efecto hipotónico del medio, y se expresa como aquella
concentración de NaCl (en g/L) necesaria para producir el 50% de hemólisis (H50).
Para cada eritrocito, la FOE depende de la relación que existe entre su superficie (S) y su
volumen (V). Debido a su forma bicóncava, los eritrocitos pueden aceptar, sin producir
hemólisis, una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta un 70%. Una vez
rebasado este límite, sobreviene la hemólisis. Cuando existe un defecto en la forma del
eritrocito que disminuye la relación S/V, como ocurre en la esferocitosis hereditaria, este límite
disminuye, y la hemólisis comienza en presencia de soluciones menos hipotónicas,
aumentando la FOE (o lo que es lo mismo, aumenta el valor de H50).
• Bilirrubina.19
Fundamento:
λ 530
Interpretación:
Bilirrubina indirecta
Bilirrubina no conjugada o libre, es decir, aquella que se produce en la sangre a partir de la
degradación de los eritrocitos, siendo transportada hacia el hígado por la albumina. Allí este
complejo se disocia y la bilirrubina, sola, penetra en la célula hepática donde se conjuga con el
acido glucuronico por acción de la UDP glucuronil transferasa. El poder identificar cual de las
bilirrubinas esta elevada (directa o indirecta) nos permite definir si el problema esta antes, en
o después del hígado. La bilirrubina indirecta se ve aumentada cuando existe daño
hepatocelular, obstrucción del árbol biliar intrahepático y extrahepático, enfermedad
hemolítica, ictericia neonatal fisiológica, enfermedad de Gilbert, intolerancia a la fructosa, etc.
Bilirrubina directa
Bilirrubina conjugada, es decir, aquella que, después de separarse de la albumina, penetra en
la célula hepática donde se conjuga con el acido glucuronico por acción de la UDP glucuronil
transferasa. La bilirrubina directa se ve aumentada en obstrucciones biliares o colestasis (por
19
Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros,
Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.
20
Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el
manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83
20
un cálculo o piedra de la vesícula), en tumores hepáticos o de cabeza de páncreas, en
estrechamientos de los conductos biliares, en colestasis inducidas por medicamentos, en los
síndromes de Dubin-Johnson y de Rotor, en hepatitis y cirrosis, etc.
Bilirrubina total
Compuesto pigmentado, producido por degradación de los grupos hemo de la hemoglobina en
las células de la medula ósea, del bazo y del hígado. Es un producto de desecho. Su
determinación es útil para el diagnostico y evolución de la ictericia, en la anemia y en la
obstrucción biliar. Viéndose aumentada esta cifra en enfermedades hepáticas, en neoplasias
de páncreas, en anemias hemolíticas, en obstrucciones biliares, en la enfermedad de Gilbert,
en la malaria, etc. La acumulación de bilirrubina en la sangre de los recién nacidos puede
provocar graves daños cerebrales. Por el contrario, la bilirrubina disminuye en anemias
ferropenias y en anemias aplasicas.
• Conteo de reticulocitos. 21
Fundamento: Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de rRNA.
Cuando son sometidos a colorantes llamados supravitales, como el azul de cresilo brillante,
este precipita sobre los restos de rRNA permitiendo observarlo en forma de “cuenta de
rosario”, que los eritrocitos maduros no contienen.
Una cantidad elevada de reticulocitos, indica una gran actividad eritropoyetica de medula
ósea; una cantidad disminuida indica lo contrario; así, la cantidad de reticulocitos presentes en
una muestra de sangre permite conocer la actividad eritropoyetica de la medula ósea.
21
Bauer, John D. (1986). Análisis Clínicos: Métodos e Interpretación. Editorial Reverte, España. Págs:
204-205, 589-594
21
Objetivos General
Administrar eritropoyetina a un lote de ratas wistar machos para estudiar los efectos
sobre la eritropoyesis mediante la valoración de diferentes parámetros hemáticos.
Objetivos Particulares
Administrar por vía subcutánea eritropoyetina en una dosis 0.5mL por cada 250g de
peso en las ratas para evaluar una posible alteración.
Hipótesis
22
Materiales y Metodología Experimental
Materiales
Biológico Químico Instrumental
40 Ratas wistar macho Reactivo de Drabkin Espectrofotómetro
2 ml de Sangre con EDTA EDTA 5% Centrifuga clínica
1.5 ml de sangre NaCl 0.9% Microcentrifuga
Kit para determinación
colorimétrica de bilirrubina
Bioyetin® Bortex
D y T en suero de WIENER
LAB®
Metanol Microscopio óptico
Azul de metileno Balanza de dos platos
Balanza granataria con
Giemsa
canasta
Éter Agujas 25 x 16
Acido pícrico Jeringas 1 y 3 ml
Aceite de inversión Vasos pp 100 y 250 ml
Campana
Tubos de ensaye
Tubos para centrifuga
gradilla
Pipetas graduadas 0.1, 1,
2, 5 y 10 ml
Pipeta sahli
portaobjetos
Pipeta pasteur
Propipeta
Tubos Capilares
Cuba metálica
Baño Maria
23
Metodología experimental
Administradas vía
subcutánea con
eritropoyetina
(0.5mLX250g) dos
veces por semana
(lunes y jueves) Se pesaron antes de
durante 31 días de cada punción
inducción
24
Se puncionaron vía intracardiaca una vez por
semana (obteniéndose 3.5ml de sangre
aprox.)
Centrifugar
Frotis sanguíneo (1 gota)
Conteo de retículocitos (1-2
gotas)
Hematocrito (3/4 partes del Suero (0.6ml)
capilar)
Fragilidad osmótica (1ml)
Hemoglobina (0.02ml)
bilirrubina
25
Cronograma
Días de Días de
Fecha Actividades realizadas
Inducción trabajo
22 0 Lunes Marcado, distribución y administración de EPO
23 1
24 2
a)Realización de pruebas a ratas de lote control
25 3 Jueves
b)Administración de EPO a ratas tratadas
SEPTIEMBRE 26 4
27 5
28 6
Realización de pruebas a ratas tratadas y
29 7 Lunes
administración de EPO
30 8
1 9
a)Realización de pruebas a ratas de lote control
2 10 Jueves
b)Administración de EPO a ratas tratadas
3 11
4 12
5 13
Realización de pruebas a ratas tratadas y
6 14 Lunes
administración de EPO
7 15
8 16
a)Realización de pruebas a ratas de lote control
9 17 Jueves
b)Administración de EPO a ratas tratadas
10 18
11 19
OCTUBRE 12 20
Realización de pruebas a ratas tratadas y
13 21 Lunes
administración de EPO
14 22
15 23
a)Administración de EPO a ratas tratadas
16 24 Jueves
b)Registro de resultados en tablas
17 25
18 26
19 27
20 28 Lunes Realización de pruebas a ratas tratadas
21 29
22 30
a)Realización de pruebas a ratas de lote control
23 31 Jueves
b)Eutanasia
26
27
Gráficos y Análisis de Resultados
Como podemos observar la tendencia del lote de eritropoyetina es a subir, esto debido a que
las ratas proporcionadas eran jóvenes y se encontraban en desarrollo, además que
consumieron un alimento altamente proteico
28
En esta prueba no se realizo una buena apreciación de los reticulocitos debido a que pudieron
existir precipitados de colorante por una mala tinción, por ende, lo observado se confundía
con reticulocitos, además que los frotis estaban gruesos ocasionando resultados pocos
confiables. Como se aprecia en la grafica el cambio no fue significativo, por lo que esta se
vuelve una prueba subjetiva la cual no nos demuestra si existe o no efecto de la EPO exógena
en el proceso de eritropoyesis.
Como nos indica la tabla no hubo cambios observables significativos, esto indica que no existió
un cambio en el tamaño y forma de los eritrocitos al administrar EPO en ratas wistar macho.
29
Como se puede observar en la grafica, la tendencia del lote con EPO aumento con respecto al
lote control, debido a que la administración de la hormona aumentó la producción de
eritrocitos, ya que ésta actúo de forma adecuada en el proceso de eritropoyesis, estimulando
la maduración y diferenciación de las células precursoras del eritrocito.
El gráfico de hemoglobina muestra una incongruencia en los resultados ya que los valores
suben y bajan, por lo tanto es difícil determinar una tendencia que indique un cambio, esto
debido a errores experimentales como un mal manejo de muestra, provocando hemólisis y un
mal tiempo de lectura, ya que la lectura debió realizarse a los 5 minutos exactos de agregar la
muestra al reactivo de Drabkin, si no ocurre esto, como fue en este caso se obtienen lecturas
incorrectas y poco confiables.
30
La gráfica de bilirrubina nos muestra que los valores obtenidos del lote de EPO estuvieron
dentro del rango control a excepción de un punto, el cual se atribuye a errores experimentales
como el tiempo de lectura, la calibración del equipo y a la poca cantidad de muestra (suero)
que se obtenía; además que la medida de la muestra en su mayoría no se realizo con la pipeta
adecuada sino con pipeta graduada, la cual tiene un margen de error que alteró los resultados,
además que la muestra estaba hemolizada.
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En la gráfica correspondiente a esta prueba se observa una disminución gradual de la
bilirrubina total; teóricamente esta debe presentar un comportamiento similar al de la directa
pero experimentalmente no fue así; esto se debió a que la bilirrubina es fotosensible por lo
que al realizar la lectura, el compuesto que iba a dar la propiedad ya no tenía la misma
composición.
La gráfica obtenida para esta prueba indica que no hubo cambios en la estructura de la
membrana del eritrocito, ya que esta se encarga de evaluar la resistencia que tiene la
membrana cuando es sometida a diferentes concentraciones de NaCl, la cual indica el
porcentaje de hemolisis de los hematíes, por esta razón se dice que la administración de
eritropoyetina no afecta la membrana del eritrocito.
Conclusiones
Se logró realizar las pruebas bioquímico-hemáticas a ratas wistar macho tratadas con
eritropoyetina; no se consiguió ver un cambio significativo en los resultados debido a la mala
manipulación de las técnicas y a la regularidad de la dosificación de EPO la cual no fue
significativa, por lo tanto que a una dosis continua de la EPO muy probablemente se hubiesen
provocado alteraciones esperadas, como un aumento en el hematocrito, hemoglobina y
reticulocitos.
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Referencias:
Ilustraciones:
1.-http://www.ugr.es/~jhuertas/EvaluacionFisiologica/Hematocrito/hemat.htm; 06 de
Septiembre de 2008.
2.- http://www.famma.org/discapacidades/hemofilia.htm; 06 de Septiembre de 2008.
3.- Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohematico. UNAM-
FES-Iztacala, México. pp: 295
4.- http://www.academic.marist.edu/~jzmz/HematologyI/Intro8.html; 06 de Septiembre de
2008
5.- http://sovanguru.blogspot.com/2007_12_10_archive.html; 06 de Septiembre de 2008.
6.- http://es.wikipedia.org/wiki/Hemo; 10 de Noviembre de 2008.
7.-http://www.carampangue.cl/Biocarampangue/Plan-tercero-evolucion.htm; 10 de
Noviembre de 2008.
8.- Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán
Libros, Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.
9.- Ibíd.
10.- Ibíd.
11.- Ibíd.
12.- http://personal.us.es/caossorio/temas/tema_11b.pdf, 07 de Septiembre de 2008.
13.- http://personal.us.es/caossorio/temas/tema_11b.pdf, 07 de Septiembre de 2008.
14.- www.alojamientos.us.es/hematologia/practicas_2007-08.pdf, 08 de Septiembre de 2008.
15.- http://www.pezcyclingnews.com/?pg=fullstory&id=4746; 06 de Septiembre de 2008.
Bibliografía:
3. Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía
práctica para el manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán,
México. Págs: 80-83
5. Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohematico.
UNAM-FES-Iztacala, México. pp: 295
7. Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y
molecular. 4ª edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222
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