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DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E AMBIENTE Ciclo de Calvin José Gomes-Laranjo Vila Real, 2009

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E AMBIENTE

Ciclo de Calvin

José Gomes-Laranjo

Vila Real, 2009

ciclo de calvin2

1. INTRODUÇÃO

"A FOTOSSÍNTESE é o mecanismo mediante o qual se pode garantir que a vida

sobre a Terra não chega ao fim por falta de energia" (TEIXEIRA e RICARDO, 1984).

Na essência consiste num processo biossintético pelo qual as plantas sintetizam

compostos orgânicos, a partir de materiais inorgânicos, utilizando a luz como fonte de

energia.

Pela fotossíntese as plantas elaboram compostos orgânicos a partir de formas altamente oxidadas de carbono e hidrogénio (na maioria dos casos CO 2 e H 2 O), os quais

são reduzidos até ao nível dos açúcares. A energia necessária provém, em última

instância, da energia radiante absorvida.

Os seres clorofilinos constituem a base da pirâmide de qualquer cadeia

alimentar, pelo que se pode considerar que todos os seres vivos, derivam mais ou menos

indirectamente de um único grupo de compostos carbonados, os AÇÚCARES.

Estes formam-se nos seres fotossintéticos através de um conjunto de reacções

metabólicas denominado CICLO DE CALVIN. O processo recebe a energia química formada

na cadeia de transferência de electrões, incorporando-a no dióxido de carbono recente-

mente entrado no ciclo, formando-se nova matéria orgânica.

Em suma, todos os átomos de carbono constituintes da matéria viva, são oriundos do CO 2 atmosférico incorporado através do CICLO DE CALVIN.

São inúmeras as designações que o ciclo de Calvin pode tomar.

Em homenagem ao investigador e seus colaboradores que, pela primeira vez conseguiram em laboratório, acompanhar as interconversões do CO 2 fixado via

fotossintética, a rota ficou conhecida como o ciclo de Calvin, ciclo de Calvin-Benson ou

ainda ciclo de Calvin-Benson-Bassham (TEIXEIRA e RICARDO, 1984).

TEIXEIRA e RICARDO (1984), designam o ciclo como o ciclo redutor dos fosfatos

de pentose ou"RPP pathway" pela terminologia em língua inglesa, usada por FOYER

(1984). Trata-se, como se verá mais adiante, de uma rota de interconversões biossintéticas iniciada pela incorporação de CO 2 numa pentose, seguida de redução do

produto resultante, pelo NADPH injectado nesta rota.

SARKEY (1985), considera o ciclo como "PCRC" (Photosynthetic Carbon Reduction

Cycle), ou numa forma ainda mais abreviada referida por LORIMER (1981) e RAWN (1989)

ciclo de calvin3

por "PCR", atendendo ao estado de oxidação do carbono no CO 2 e no composto orgânico

produzido no ciclo.

Para ALBERTS et al. (1990), é o "carbon-fixation-cycle", omitindo o termo

fotossintético, provavelmente, por ter em consideração que outros organismos não fotossintéticos podem fixar CO 2 , independentemente das reacções da fotossíntese.

Nesta lição consideraremos apenas o modelo fotossintético apresentado pelas plantas superiores, i.e., em que a fotossíntese leva à libertação de O 2 e onde o CO 2

atmosférico é directamente incorporado no ciclo de Calvin.

ciclo de calvin4

2.

O

CICLO

DE

FOTOSSINTÉTICO

CALVIN

NO

PROCESSO

Os cloroplastos e as mitocôndrias têm a seu cargo a resolução das necessidades

energéticas no interior da célula.

Na célula vegetal, embora se encontrem mitocôndrias, os cloroplastos são os

principais responsáveis pelas conversões energéticas. Aqui tem lugar todo o processo de

transformação energética (fotossíntese) que vai desde a captação da energia quântica e

sua conversão em energia química, até ao seu armazenamento em moléculas derivadas do CO 2 e H 2 O.

O processo fotossintético desenrola-se em duas grandes etapas (Figura 1):

desenrola-se em duas grandes etapas (Figura 1): Figura 1 - Panorâmica global do processo fotossintético

Figura 1 - Panorâmica global do processo fotossintético (adaptado de BERKALOFF et al.,

1988).

a) "FASE CLARA"

-

Conjunto

de

reacções

fotofísicas

de

captação de energia quântica pelas unidades fotossintéticas (PS.I e PS.II) e sua transformação

fotoquímica pelos centros de reacção dos fotossistemas (P 700 e P 680 ) em energia electrónica

destinada a ser usada na cadeia de transferência electrónica (ESQUEMA EM Z). Ao longo desta

cadeia é produzida energia química potencial na forma de ATP (potencial energético) e

ciclo de calvin5

NADPH (potencial redutor). A principal limitação desta energia química é a de ter transporte e

armazenamento limitados, sendo, por isso, necessária uma segunda fase (TORRES-PEREIRA,

1984).

b) "FASE ESCURA" - Conjunto de reacções que, através da

incorporação de carbono em elevado estado de oxidação (CO 2 ), e da incorporação da energia

química criada na "fase clara", vai originar compostos carboxilados com elevado grau de

redução (principalmente açúcares) de fácil mobilização ou armazenamento. Esta fase pode ser

dividida em três etapas (COLL, 1980):

b.1) - Inclusão de CO 2 em determinado composto orgânico; b.2) - Redução de intermediários
b.1) - Inclusão de CO 2 em determinado composto orgânico;
b.2) - Redução de intermediários fotossintéticos;
b.3) - Regeneração de produtos.

As etapas b.2) e b.3) são iguais para todos os organismos fotossintéticos, excepto algumas bactérias.

A etapa b.1) é bastante variável, conforme o grupo de plantas. Assim, é possível distinguir três modelos de fixação:

• Modelo de fixação em que o CO 2 atmosférico é directamente fixado na ribulose-1,5-bifosfato

(RuBP) do ciclo de Calvin. É o de maior representatividade quanto ao número de espécies. É o

modelo inicialmente descoberto por Calvin, Benson e Bassham. Modelo característico das PLANTAS C 3 e ainda algas, cianobactérias e bactérias autotróficas;

• Modelo alternativo de fixação no qual o CO 2 atmosférico é previamente fixado num ácido

dicarboxílico, que o transportará até ao ciclo de Calvin. É o modelo característico das PLANTAS C 4 .

• Modelo nocturno de fixação e armazenamento de CO 2 atmosférico, para posterior utilização

diurna pelo ciclo de Calvin. É o modelo das PLANTAS CAM.

ciclo de calvin6

Deixa-se em suspenso, o problema da falsa dicotomia "fase clara"/"fase clara" que

será abordada no fim da lição.

Poderá o aluno nesta altura interrogar-se: "Não seria mais fácil e mais rápido para as

plantas usarem exclusivamente o ciclo de Calvin"?

Não querendo avançar antecipadamente com a resposta, direi apenas, que cada

um dos modelos de fixação assume vantagens importantes em "habitats" característicos.

As plantas do primeiro grupo (plantas C 3 ) têm vantagens em climas

temperados, as do segundo grupo (plantas C 4 ) em climas tropicais e as do terceiro grupo

(plantas CAM) em climas áridos.

O objectivo desta lição, restringe-se somente à apresentação do modelo de fixação directa do CO 2 atmosférico na RuBP, ou seja, do modelo de fixação fotossintética nas

plantas C 3 . Enfim, iremos falar das reacções que compoêm o ciclo de Calvin.

ciclo de calvin7

3. APONTAMENTO HISTÓRICO

Os primeiros estudos efectuados sobre o metabolismo fotossintético do CO 2

datam de 1938, e foram conduzidos por RUBEN, KAMEN e HASSID na Universidade da Califórnia. Usando CO 2 isotopicamente marcado com 11 C, utilizando folhas de cevada e

suspensões de algas verdes, e recorrendo a técnicas de cromatografia, tentaram descobrir

os compostos em que aparecia o carbono radioactivo. No entanto, as técnicas da altura

não permitiram mais, do que verificar o aparecimento deste carbono num grupo

carboxílico (-COOH). Uma grande limitação cifrava-se na curta semivida do 11 C, que ao

fim de 20 minutos desaparecia (TEIXEIRA e RICARDO, 1984).

Este problema ficou solucionado com a descoberta do 14 C, cuja semivida é de

5.000 anos. Infelizmente a guerra, e a morte de RUBEN num acidente de laboratório,

interromperam estes trabalhos.

Só mais tarde, em 1946, voltaram a ser retomados por MELVIN CALVIN e seus

colaboradores, nomeadamente BASSHAM e BENSON (BENSON e CALVIN, 1950; BASSHAM,

1962 e MEYER, 1983). Usando técnicas e materiais como:

- marcação com carbono radioactivo 14 C;

- técnicas de cromotografia bidimensional em papel, que permitiam a distinção pelas diferenças relativas de solubilidade de compostos muito semelhantes;

- técnicas de autorradiografia, pois como os produtos eram incolores, havia que localizá-los no papel da cromatografia mediante técnicas especiais. Para isso, colocavam uma folha de papel de raios X sobre o papel de cromatografia durante vários dias;

- suspensões de algas verdes unicelulares Chlorella ou Scenedesmus (de mais fácil fixação),

pois era importante controlar-se com precisão o tempo que levava a "matar" (fixar) a planta,

posto que já se tinha percebido que o processo era muito rápido e poucos segundos seriam o suficiente para desorganizar todo o quadro de estudo;

aplicadas a três tipos de experiências baseadas na determinação de:

• tempos de exposição variáveis;

• determinação da posição relativa dos 14 C fixados nas moléculas;

• alteração de factores externos;

conseguiram chegar à forma hoje conhecida do ciclo de Calvin (Figura 2).

ciclo de calvin8

ciclo de calvin8 Figura 2 - Forma simplificada do ciclo de Calvin, onde se apresentam os

Figura 2 - Forma simplificada do ciclo de Calvin, onde se apresentam os passos chave (adaptado de TEIXEIRA e RICARDO, 1984).

Estes trabalhos valeram a MELVIN CALVIN o Prémio Nobel da Ciência em

1961.

ciclo de calvin9

4. O CICLO DE CALVIN NO CLOROPLASTO

Socorrendo-nos da Figura 1, podemos observar que o conjunto das reacções da "fase clara", ocorre nas membranas tilacóides do cloroplasto.

A mesma figura revela, que todo o conjunto das reacções metabólicas do ciclo de Calvin, se desenrola no estroma (matriz) do cloroplasto.

ciclo de calvin10

5. REACÇÕES METABÓLICAS DO CICLO DE CALVIN

Um aspecto que mais uma vez desejamos relembrar e realçar, é que este é um

ciclo de interconversões de AÇÚCARES.

Não há uniformidade na forma de divisão do processo em etapas. Se para uns

são quatro etapas (SALISBURY e ROSS, 1978 e FOYER, 1984), para outros são três (COLL, 1980;

LENHINGER, 1982; TEIXEIRA e RICARDO, 1984 e RAWN, 1989). Enfim, qualquer que seja a

divisão, as reacções são sempre as mesmas: varia é o critério de apresentação global do

ciclo.

A divisão em três fases parece-nos mais adequada, pois a referida quarta fase

não é mais do que uma subdivisão da terceira fase:

FASE DE CARBOXILAÇÃO - compreende a reacção de fixação do CO 2 pelo aceitador, a

ribulose-1,5-bifosfato (RuBP).

FASE DE REDUÇÃO - grupo de reacções que têm como objectivo o enriquecimento

energético do açúcar resultante da carboxilação. No final desta fase encontra-se "a porta de

saída" do ciclo.

FASE DE REGENERAÇÃO DA RuBP - engloba um conjunto de reaçções de interconversão que se realizam no sentido de originar novamente o aceitador do CO 2 .

Por fim, salienta-se que devem ser fixadas três moléculas CO 2 , antes que uma

molécula de açúcar possa ser exportada do ciclo (ou seja, numa proporção de três para

uma), sem desiquilibrar estequiometricamente as restantes reacções do ciclo, logo são

necessários três CO 2 para que uma volta completa do ciclo se realize (RAWN, 1989).

5.1. FASE DE CARBOXILAÇÃO

Foi fácil a identificação por CALVIN e seus colaboradores do primeiro açúcar formado após a incorporação do 14 CO 2 . Ao fim de cinco segundos, 90% de todo o 14 CO 2

fixado, aparecia no açúcar-ácido (de três carbonos) ÁCIDO-3-FOSFOGLICÉRICO (PGA),

ciclo de calvin11

constituindo o grupo carboxílico (como tinha sido verificado por RUBEN) de uma das duas moléculas formadas. Os restantes 10% do 14 CO 2 fixado era encontrado em

aminoácidos (possivelmente uma rota alternativa). Mais difícil, foi descobrir o composto no qual era fixado o 14 CO 2 . Levou cinco anos, até que se descobrisse que

poderia ser um açúcar de 5C e não 2C, como seria lógico esperar (2C + 1C = 3C). BENSON e

CALVIN (1950) embora fossem dando conta nos seus trabalhos que eventualmente seria

um açúcar de 2C, faziam-no sempre com fortes reservas. Investigações subsequentes revelaram que o composto aceitador de CO 2 era uma pentose (5C), a RIBULOSE-1,5-

BIFOSFATO (RuBP), (BASSHAM, 1962).

Com efeito, a RuBP ao receber o CO 2 converte-se num composto intermediário

de seis carbonos, extremamente instável (Figura 3) e rapidamente convertível, razão pela

qual, só muito recentemente se descobriu que, se tratava do 2-CARBOXI-3-CETOARABINI-

TOL-1,5-BIFOSFATO (TEIXEIRA e RICARDO, 1984 e RAWN, 1989).

CH P 2 O C O H C OH H C OH CH P 2
CH
P
2 O
C
O
H
C
OH
H
C
OH
CH
P
2 O

* CO 2

CH P 2 O C O H C OH H C OH CH P 2 O
CH P 2 O HO C * COOH H 2 O C O H C
CH
P
2 O
HO
C
* COOH
H 2 O
C
O
H
C
OH
CH
O P
2
CH P 2 O H C OH * COOH
CH
P
2 O
H
C
OH
* COOH
COOH H C OH CH P 2 O
COOH
H
C
OH
CH
P
2 O

Ribulose-1,5-bifosfato

(RuBP)

2-Carboxi-3-cetoarabinitol-

-1,5-bifosfato

(PGA) Figura 3 - Reacção de carboxilação da RuBP, em que o CO 2 é transfor- mado em carbono orgânico. Pelo facto de se formarem trioses, não seria forçosamente necessário que o composto aceitador tivesse 2 carbonos.

2 x Ácido-3-fosfoglicérico

Este composto intermediário é imediatamente hidrolisado, formando-se duas moléculas em C 3 , uma de PGA e outra, que após sofrer uma dismutação (transformação,

por oxidação, do grupo carbonilo em carboxilo), origina a segunda molécula de PGA.

No fim desta reacção registamos o ganho de mais um átomo de carbono ligado

a um composto orgânico (o PGA).

Dado que o primeiro composto estável formado após a fixação do CO 2

atmosférico, é um composto em C 3 , chamam-se às plantas que seguem este tipo de

fixação, "PLANTAS C 3 " (TEIXEIRA e RICARDO, 1984; BAZZAZ e FAJER, 1992, entre outros).

Em termos estequiométricos, por cada três CO 2 são necessários três RuBP, que

vão originar, após a carboxilação, seis PGA.

ciclo de calvin12

é catalisada pela ribulose-1,5-bifosfato-

carboxilase/oxigenase (RuBisCO), uma das proteínas mais abundantes no mundo vivo. Uma

abordagem, mais completa, sobre a acção desta enzima será feita à frente no ponto 8.4.

Resta

referir

que

esta

reacção

Parece-nos importante, nesta fase inicial do ciclo, fazer um parêntesis para recordar ao aluno, os tipos de reacções promovidas por algumas classes de enzimas, sobretudo aquelas que entram no ciclo. Será assim mais fácil perceber qual o tipo de enzima que em determinada altura vai actuar. Em ANEXOS I, poder-se-ão consultar figuras demonstrativas, da forma de actuação das classes de enzimas intervenientes no ciclo:

carboxilases, transcetolases, cinases, aldolases e desidrogenases (TORRES-DE-CASTRO, 1987)

5.2. FASE DE REDUÇÃO

Como já anteriormente se referiu, o PGA enceta nesta fase um processo de "enriquecimento energético", à custa do ATP e NADPH formados na "fase clara" (Figura 4). Com efeito, numa primeira fase, o ATP vai ser necessário para fornecer a energia extra requerida para a redução do grupo carboxílico do PGA, formando-se o ÁCIDO-1,3- BIFOSFOGLICÉRICO (ABPG). Esta é uma reacção bastante endergónica (∆G=+4,5 Kcal/mol). Na segunda fase vai ocorrer a redução do grupo carboxílico do ABPG (transformado num grupo aldeído) originando GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO (G3P). Passamos de um açúcar-ácido para uma aldose (bastante mais energética). Esta reacção é, ligeiramente exergónica (∆G=-1,5 Kcal/mol) e portanto espontânea (TEIXEIRA e

RICARDO, 1984; STRASBURGER, 1988; DARNELL et al., 1990 e RAWN, 1989). O balanço líquido

desta fase é, portanto, positivo, conferindo um carácter bastante endergónico (∆G °' =+3 Kcal/mol) a esta etapa.

COOH H C OH CH P 2 O
COOH
H
C
OH
CH
P
2 O

PGA

ATP ADP
ATP
ADP
CH P 2 O H C OH COO P
CH
P
2 O
H
C
OH
COO P
NADPH NADP +
NADPH
NADP +
CHO H C OH CH 2 O P
CHO
H
C
OH
CH 2 O P

+ Pi

Ácido-1,3-bifosfoglicérico

(ABPG)

Gliceraldeído-3-fosfato

(G3P)

Figura 4 - Enriquecimento energético do PGA. O objectivo do ciclo fica cumprido - o armazenamento da energia química criada

na "fase clara". Nota: Pi = H 2 PO 4 - .

A

primeira

reacção

de

fosforilação

é

catalisada

pela

fosfoglicerato-cinase,

enquanto

a

reacção

de

redução

(a

segunda)

é

catalisada

pela

fosfogliceraldeído-

desidrogenase.

ciclo de calvin13

E eis-nos, nesta altura, perante os mais elevados potenciais energéticos que se

atingem ao longo do ciclo. É portanto, a altura ideal para o aparecimento da "porta de

saída" do ciclo, i.e., o momento em que ocorrerá a exportação da "nova" energia química

formada.

Das seis trioses fosfato que temos nesta altura, uma será exportada do ciclo,

permanecendo as outras cinco no ciclo, cujas transformações vamos estudar ao longo da

fase de regeneração.

O destino da triose exportada, será estudado mais para a frente, logo depois de

completarmos o estudo do ciclo.

5.3. FASE DE REGENERAÇÃO

Depois de cumprido o objectivo do processo fotossintético, i.e., a produção de

uma nova forma de energia química (transportável para os tecidos não fotossintéticos a

fim de assegurar as funções vitais ou, então, em situações de excedente, ser facilmente

armazenável, quer nos tecidos de reserva, quer no próprio cloroplasto) mais não resta a

este processo, que a sua reorganização para uma nova carboxilação.

Com efeito, através de um vasto conjunto de reacções de isomerização, hidrólise, transcetolização, transaldolização e fosforilação; as cinco trioses-fosfato (5C 3 )

converter-se-ão em três pentoses-fosfato (3C 5 - Ribulose-5-bifosfato).

Dado serem várias reacções, parece-nos aconselhável, nesta altura,

fornecermos um suporte mais completo (Figura 5) que o fornecido inicialmente (Figura

2), para que, com mais facilidade, o aluno possa abarcar o mecanismo de regeneração.

C3 + C3 → C6 C3 + C6 → C5 + C4 C3 + C4 → C7 C3 + C7 → C5 + C5

Global: 5C3 → 3C5

Figura 5 - Balanço carbonado do ciclo de Calvin.

O primeiro passo, trata-se da ocorrência de uma reacção de isomerização do

G3P. Com efeito, como se pode observar pela Figura 6, a referida reacção consiste numa modificação dos grupos funcionais (isomerização do grupo funcional), originando o aparecimento de uma cetose a partir de uma aldose. Esta isomerização é apenas protagonizada por duas das cinco trioses-fosfato, implicadas a reconstituição da RuBP. O

G3P manter-se-á em equilíbrio com o seu isómero DI-HIDROXIACETONA-FOSFATO (DHAP).

ciclo de calvin14

CHO H C OH CH P 2 O
CHO
H
C
OH
CH
P
2 O

G3P

ciclo de calvin14 CHO H C OH CH P 2 O G3P CH 2 OH C
CH 2 OH C O CH 2 O P
CH 2 OH
C
O
CH 2 O P

Di-hidroxiacetona-fosfato

(DHAP)

Figura 6 - Isomerização do grupo funcional de uma aldose numa cetose.

Esta reacção é catalisada pela triose-fosfato-isomerase.

A partir daqui, trata-se de administrar correctamente o emprego das cinco trioses-fosfato (G3P e DHAP) que vamos considerar, por hipótese, que se encontram num "reservatório".

Numa primeira e brevíssima análise da fase de regeneração podemos verificar, na Figura 5, a seguinte evolução da estrutura carbonada dos compostos intervenientes:

a) Por condensação, duas moléculas em C 3 originam uma em C 6 ;

b) esta molécula em C 6 com outro em C 3 dá origem a uma em C 4 e uma em C 5 ;

c) a molécula em C 4 condensa-se com nova em C 3 dando uma em C 7 ;

d) esta molécula em C 7 com outra em C 3 origina duas em C 5 .

em C 7 com outra em C 3 origina duas em C 5 . 5 moléculas

5 moléculas em C 3 originam 3 moléculas em C 5

Passemos agora a uma análise em pormenor: o processo de regeneração, começa por ir ao "reservatório" buscar duas trioses- -fosfato (1G3P + 1DHAP), as quais irão sofrer um processo de condensação (Figura 7). Acabou de se formar a FRUTOSE-1,6-BIFOSFATO (FBP), que é uma cetose. Chama-se a atenção para o facto de esta condensação (e as outras), ser feita entre uma aldose e uma cetose, e não entre duas aldoses ou duas cetoses.

Esta reacção é catalisada pela aldolase.

ciclo de calvin15

G3P

+

DHAP

ciclo de calvin15 G3P + DHAP CH 2 O P C O HO—C—H H—C—OH H C
CH 2 O P C O HO—C—H H—C—OH H C OH CH P 2 O
CH 2 O P
C
O
HO—C—H
H—C—OH
H
C
OH
CH
P
2 O

Frutose-1,6-bifosfato

(FBP)

Figura 7 - Reacção de condensação para formacão de uma hexose do grupo das cetoses.

De seguida, através de uma hidrólise a FBP vai perder um grupo fosfato (Figura 8), numa reacção catalisada pela frutose-1,6- -bifosfatase. O novo composto formado é a FRUTOSE-6-FOSFATO (F6P).

FBP

+

H 2 O

formado é a FRUTOSE-6-FOSFATO ( F6P ). FBP + H 2 O CH 2 OH C
CH 2 OH C O HO—C—H H—C—OH H C OH CH 2 O P
CH 2 OH
C
O
HO—C—H
H—C—OH
H
C
OH
CH 2 O P

Frutose-6-fosfato

(F6P)

+

Pi

Figura 8 - Subtracção de um grupo fosfato à FBP.

Para a reacção seguinte, é preciso mais uma triose-fosfato que temos em

reserva (a terceira). A F6P (cetose) e a aldose G3P vão sofrer uma transcetolização

(Figura 9), formando-se XILULOSE-5-FOSFATO (Xu5P) e ERITROSE-4-FOSFATO (E4P). Para

que esta reacção ocorra é necessária a presença de uma transcetolase. Nesta conversão a tiamina-pirofosfato (TPP) actua como cofactor implicado na transferência do grupo C 2

da F6P para o G3P.

ciclo de calvin16

F6P

+

G3P

TPP, Mg 2+

CHO

H—C—OH

H—C—OH CH P 2 O Eritrose-4-fosfato
H—C—OH
CH
P
2 O
Eritrose-4-fosfato

(E4P)

+

CH 2 OH C O HO—C—H
CH 2 OH
C
O
HO—C—H
H—C—OH CH 2 O P
H—C—OH
CH 2 O P

Xilulose-5-fosfato

(Xu5P)

Figura 9 - Reacção de transcetolização entre F6P e G3P, originando mais uma aldose e uma cetose.

Com esta reacção forma-se a primeira das três pentoses-fosfato necessárias o

restabelecimento do equilíbrio estequiométrico do ciclo. Vamos deixá-la por enquanto,

retomando o processo com a E4P que, é uma aldose com quatro carbonos.

Nova condensação ocorre nesta fase. À tetrose vai juntar-se uma DHAP oriunda

da reserva (a quarta), para se formar a SEDO-

-HEPTULOSE-1,7-BIFOSFATO (SHBP). Esta condensação é catalisada pela sedo-heptulose-1,7-

bifosfato-aldolase (Figura 10).

E4P

+

DHAP

bifosfato-aldolase (Figura 10 ). E4P + DHAP CH 2 O P C O HO—C—H H—C—OH H
CH 2 O P C O HO—C—H
CH 2 O P
C
O
HO—C—H

H—C—OH

HCOH

H—C—OH

CH

2 O

P
P

Sedo-heptulose-1,7-bifosfato

(SHBP)

Figura 10 - Reacção de condensação para formação da heptose SHBP.

De seguida a SHBP, através de uma hidrólise catalisada pela sedo-heptulose-1,7-

bifosfatase, transforma-se em SEDO-HEPTULOSE-7-FOSFATO (SH7P), libertando o grupo fosfato que se encontra ligado ao C 1 (Figura 11).

ciclo de calvin17

SHBP

+

2 O

H

ciclo de calvin17 SHBP + 2 O H CH 2 OH C O HO—C—H H—C—OH +
CH 2 OH C O HO—C—H H—C—OH + Pi H—C—OH H—C—OH CH 2 O P
CH 2 OH
C
O
HO—C—H
H—C—OH
+
Pi
H—C—OH
H—C—OH
CH 2 O P

Figura 11 - Hidrólise da SHBP.

Sedo-heptulose-7-fosfato

(SH7P)

Uma última transcetolização (Figura 12) ocorre. Enfim, é gasta a última triose-

fosfato do "reservatório", numa reacção catalisada pela transcetolase, formando-se as

duas últimas pentoses: uma Xu5P e uma RIBOSE-5-FOSFATO (R5P).

SH7P

+

G3P

CHO

TPP, Mg 2+

RIBOSE-5-FOSFATO ( R5P ). SH7P + G 3 P CHO TPP, Mg 2 + H—C—OH H—C—OH

H—C—OH

H—C—OH

H—C—OH

CH 2 O P Ribose-5-fosfato
CH 2 O P
Ribose-5-fosfato

(R5P)

+

Xu5P

Figura 12 - Transferência de um grupo C 2 da SH7P para o G3P e consequente formação das duas últimas pentoses.

Finalmente, alcançaram-se as três pentoses que referimos, no início como meta do

processo.

A

etapa de regeneração vai agora prosseguir, com simples reacções de

isomerização, para dar a forma adequada a estas três pentoses-fosfato.

Relativamente às duas xilulose-5-fosfato, terão que sofrer uma epimerização (rotação de um carbono assimétrico). Esta reacção é catalisada pela ribulose-5-fosfato- epimerase (Figura 13). Estão regeneradas a primeiras duas RIBULOSE-5-FOSFATO.

ciclo de calvin18

CH 2 OH C O HO—C—H
CH 2 OH
C
O
HO—C—H
H—C—OH CH 2 O P
H—C—OH
CH 2 O P
de calvin18 CH 2 OH C O HO—C—H H—C—OH CH 2 O P CH 2 OH
CH 2 OH C O H—C—OH H—C—OH CH P 2 O
CH 2 OH
C
O
H—C—OH
H—C—OH
CH
P
2 O

Xilulose-5-fosfato

Ribulose-5-fosfato

(Ru5P)

Figura 13 - Formação da ribulose, através da epimerização da Xu5P.

(Xu5P)

Falta a R5P, que irá passar de aldose a cetose por isomerização do seu grupo funcional, numa reacção catalisada pela ribose-5-fosfato-isomerase (Figura 14).

CHO

H—C—OH

H—C—OH

H—C—OH

CH 2 O P Ribose 5-fosfato
CH 2 O P
Ribose 5-fosfato

(R5P)

CH 2 OH C O H—C—OH H—C—OH CH 2 O P
CH 2 OH
C
O
H—C—OH
H—C—OH
CH 2 O P

Ribulose 5-fosfato

(Ru5P)

Figura 14 - Transformação de uma aldose numa cetose.

Por último, falta a etapa de fosforilação (Figura 15), considerada por alguns autores (COLL, 1980 e FOYER, 1984), já como uma pré-fase da carboxilação (Figura 3). Esta fosforilação é catalisada pela Ribulose-fosfato-cinase

Ru5P

+

ATP

é catalisada pela Ribulose-fosfato-cinase Ru5P + A T P CH 2 O P C O H—C—OH
CH 2 O P C O
CH 2 O P
C
O
H—C—OH H—C—OH CH P 2 O
H—C—OH
H—C—OH
CH
P
2 O

Ribulose-1,5-bifosfato

(RuBP)

Figura 15 - Formação final das três RuBP.

+

ADP

ciclo de calvin19

Recapitulando:

3 moléculas de CO 2 são fixadas por 3 moléculas de ribulose-1,5-bifosfato (RuBP: 3 x 5 = 15 átomos de

carbono), produzindo 6 moléculas de ácido-3-fosfoglicérico (PGA: 6 x 3 = 18 átomos de carbono). Esta reacção é catalisada pela ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase/oxigenase (RuBisCO). A cada molécula de ácido-3-fosfoglicérico (PGA), é-lhe adicionado potencial energético (6 ATP) e redutor (3 NADPH), transformando-a em gliceraldeído-3-fosfato (G3P: 6 x 3 = 18 átomos de carbono). Daqui é preciso retirar os carbonos necessários (15 átomos de carbono) para regenerar 3 novas moléculas de RuBP, pelo que so- bram 3 átomos de carbono, o correspondente a uma molécula de G3P. Este G3P (ou DHAP, o seu enanteómero) é o ganho líquido de matéria orgânica por cada volta. E assim fica cumprido o objectivo do ciclo, criar um tipo diferente de energia química (transportável e armazenável), a partir da originada na "fase clara". Isto tudo, pode ser observado na Figura 16.

ciclo de calvin20

ciclo de calvin20 Acrónimos: •RuBP- Ribulose-1,5.bifosfato •PGA- Ácido-3-fosfoglicérico •ABPG-

Acrónimos:

•RuBP- Ribulose-1,5.bifosfato •PGA- Ácido-3-fosfoglicérico •ABPG- Ácido-1,3-bifosfoglicérico •G3P- Gliceraldeído-3-fosfato •DHAP- Di-hidroxiacetona-3-fosfato

•FBP- Frutose-1,6-fosfato •F6P- Frutose-6-fosfato •E4P- Eritrose-4-fosfato •Xu5P- Xilulose-5-fosfato •SHBP- Sedo-heptulose-1,7-bifosfato

Figura 16 - O ciclo de Calvin (adaptado de RAWN, 1989).

•SH7P- Sedo-heptulose-7-fosfato •R5P- Ribose-5-fosfato •ATP- Adenosina-trifosfato •NADP- Nicotinamida-adenina-dinucleóti- - do-fosfat

ciclo de calvin21

6. BALANÇO ENERGÉTICO

Estamos agora em condições de efectuarmos o balanço energético do conjunto das reacções do ciclo.

Assim:

• : 3 RuBP + 3 CO 2 + 9 ATP + 6 NADPH +
:
3
RuBP + 3 CO 2 + 9 ATP + 6 NADPH + 6 H + + 5 H 2 O →
→ 3 RuBP + 1 triose-fosfato + 9 ADP + 9 Pi + 6 NADP +
• são necessárias 2 voltas: 6 RuBP + 6 CO 2 + 18 ATP +
são necessárias 2 voltas:
6
RuBP + 6 CO 2 + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H + + 10 H 2 O →
→ 6 RuBP + 1 glucose + 18 ADP + 18 Pi + 12 NADP +

ENERGIA QUÍMICA

ENERGIA QUÍMICA Energia solar

Energia solar

Em resumo:

• :

:

Consumo de 3 ATP + 2 NADPH

• :

:

Consumo de 18 ATP + 12 NADPH

ciclo de calvin22

7. DESTINO FINAL DA TRIO-SE-FOSFATO EXPORTADA

Coloquemo-nos novamente na "porta de saída" do ciclo.

Convém aqui salientar o sentido figurado do termo "porta de saída", uma vez que todo o ciclo ocorre no estroma e não há evidentemente uma porta de saída, no sentido restrito da palavra. Acontece que, para que todo o ciclo se desenrole, é necessário a existência no meio, de proporções mínimas dos vários intermediários. Dessa forma "por cada volta", haverá entre as moléculas de G3P e DHAP uma molécula excedentária, não reciclável. Vamos ver qual o destino da triose-fosfato.

O fim destinado à triose-fosfato subtraída ao ciclo, é em grande parte a entrada na constituição de outros açúcares mais complexos — SACAROSE (açúcar de transporte) e AMIDO (açúcar de reserva). Em menor proporção, a partir de outros intermediários do ciclo, a entrada noutras rotas biossintéticas de AMINOÁCIDOS, ÁCIDOS CARBOXÍLICOS e

ÁCIDOS GORDOS (COLL, 1980).

Em algumas plantas (v.g. Rosaceas lenhosas) em lugar da sacarose predomina o SORBITOL, ao passo que noutras a RAFINOSE é o principal oligossacárido de transporte

(FOYER, 1984).

7.1. UMA FRONTEIRA ENTRE O CLOROPLASTO E O CITOPLASMA DA CÉLULA - BREVE REVISÃO.

Dado que alguns importantes processos metabólicos derivados do ciclo ocorrem no citoplasma, o invólucro desempenha importante papel na regulação das trocas. É imprescindível um adequado conhecimento dos mecanismos de transporte existentes ao nível da membrana interna do invólucro (a principal barreira), que interfi- ram nas trocas dos produtos do ciclo.

Embora este assunto tenha já sido abordado em aulas anteriores, parece-nos oportuno relembrar algumas noções básicas relacionadas com este ponto. Julgamos, ser assim mais fácil, compreender as conversões moleculares existentes ao nível deste organito, com vista à saída de certas moléculas, nomeadamente a nova energia química criada.

a

necessidade de exportação de energia para as partes não produtoras (tecidos não

Sendo

o

cloroplasto

uma

das

centrais

energéticas

da célula,

é óbvia

ciclo de calvin23

fotossintéticos). Esta exportação deve ser facilitada ao máximo, mas ao mesmo tempo

deve ser rigorosamente controlada, para que o cloroplasto não perca a sua identidade,

comprometendo as suas funções.

A MEMBRANA EXTERNA do invólucro, não constitui propriamente uma barreira,

na medida em que permite a difusão de todas as moléculas até um peso molecular de

aproximadamente 8.000 daltons, como por exemplo sacarose, intermediários do ciclo como ATP, NADPH (FOYER, 1984).

A MEMBRANA INTERNA apresenta, por conseguinte, uma permeabilidade muito

selectiva. Tem muito baixa permeabilidade a moléculas com carga ou moléculas com peso molecular superior a 200 daltons. Por isso, moléculas como ATP, NADPH , PPi, Pi,

HCO 3 - , compostos intermediários do ciclo e outras macromoléculas, não passam por

difusão passiva, ou fazem-no a muito baixa velocidade. Tem permeabilidade para

moléculas sem carga, de baixo peso molecular (menor que 200 daltons), como a H 2 O, O 2 e CO 2 que

entram por difusão passiva (DOUCE, 1977; HEBER e HELDT, 1981 e FOYER, 1984).

A membrana interna, possui também um tipo de difusão facilitada (para

algumas pequenas moléculas com carga), efectuada com o recurso a translocadores: o

TRANSLOCADOR

RICARDO, 1984).

FOSFATO

e

o

TRANSLOCADOR

CARBOXÍLICO

(FOYER,

1984;

TEIXEIRA e

Para esta lição tem interesse rever o translocador fosfato, porque é o que está

directamente envolvido com os intercâmbios de trioses-fosfato do ciclo de Calvin entre

o estroma e o citoplasma da célula.

7.1.1. O translocador fosfato

Mecanismo de natureza proteica, codificado pelo DNA nuclear, tem um peso

molecular de cerca de 30.000 daltons, representando cerca de 10% do teor em proteína da

membrana interna, FLÜGGE e HELDT (1991). Este mecanismo, funcionando como uma

espécie de "roda dentada", possibilita um conjunto de trocas equimoleculares (uma por

uma) de G3P, DHAP e PGA com o fosfato inorgânico (Figura 18) (FOYER, 1984; TEIXEIRA e

RICARDO, 1984).

Com base neste translocador funciona um sistema de transporte indirecto - a

"lançadeira" PGA/DHAP que permite colocar equivalentes de redução (NADPH) e ATP no

citoplasma a expensas do cloroplasto (Figura 17). Também pode funcionar inversamente

colocando no cloroplasto as mesmas formas de energia, no caso de fazer falta para

assegurar a manutenção das suas actividades vitais durante a noite.

ciclo de calvin24

ciclo de calvin24 Figura 17 - Funcionamento da "lançadeira" PGA/DHAP acoplada ao translocador fosfato. Notar a

Figura 17 - Funcionamento da "lançadeira" PGA/DHAP acoplada ao translocador fosfato. Notar a libertação de ATP e NADH no citoplasma (adaptado de FOYER, 1984).

A "lançadeira" é capaz de assegurar que trioses-fosfato só sejam exportadas

para o citoplasma, quando estiver a ocorrer a sua mobilização activa para a rota de

síntese da SACAROSE, libertando fosfato inorgânico (Pi), que funciona como composto

regulador deste processo. A reciclagem do Pi do citoplasma para o cloroplasto é im-

portante para a continuidade da fotofosforilação. Se a rota da sacarose estiver saturada,

não se liberta tanto Pi, pelo que as trioses-fosfato ficarão retidas no cloroplasto (o

translocador não pode funcionar), entrando para a rota de síntese do AMIDO PRIMÁRIO

(FOYER, 1984; TEIXEIRA e RICARDO, 1984).

7.2. A SÍNTESE DE SACAROSE E AMIDO A PARTIR DE TRIOSES- FOSFATO

Em condições de boa luminosidade a sacarose e o amido são os principais produtos da fixação fotossintética do CO 2 . A exportação de açúcares para o citoplasma

dá-se sob a forma fosforilada onde poderão ser utilizados, em primeiro lugar, para suprir

necessidades energéticas da célula e, o remanescente, transformado em SACAROSE. Com

efeito, este deverá ser o principal destino dos produtos da fotossíntese, necessários à

formação de mais biomassa (Figura 18).

A sacarose só se forma no citoplasma das células, não ocorrendo a sua síntese

no estroma do cloroplasto.

ciclo de calvin25

A triose-fosfato originará F6P e glucose que, na forma activada de URIDINA

DIFOSFOGLUCOSE (UDP-G) produzirão SACAROSE-FOSFATO, por acção da sacarose-fosfato-

sintetase:

F6P + UDP-G

sacarose-P + UDP + PPi

donde, por acção da fosfatase:

A

SACAROSE

possui

sacarose-P sacarose + Pi

algumas

características

especiais

que

lhe

permitem

desempenhar as funções de transporte (FOYER, 1984):

• É um dissacárido constituído por glucose e frutose (a-D-glucopiranosilo-β-D- frutofuranósido); • É
É
um
dissacárido
constituído
por
glucose
e
frutose
(a-D-glucopiranosilo-β-D-
frutofuranósido);
• É uma molécula sem carga não possuindo propriedades redutoras, pelo que a sua
passagem não provocará interacções com grupos funcionais de outras moléculas;
• É muito solúvel, podendo acumular-se em concentrações consideráveis, sem causar inibição
aos outros processos metabólicos;
• É facilmente hidrolisável por ácidos muito diluídos ou pela enzima invertase, originando
glucose e frutose. A ruptura desta ligação glicosídica fornece uma energia livre de -7,0
Kcal/mol (a maior parte das outras ligações glicosídicas têm energias muito inferiores);
• É um regulador da pressão osmótica e das relações hídricas na planta;
• Tem fácil difusão através das membranas biológicas, movendo-se a uma velocidade de 0,5 a
1,0 m.h -1 no floema.

ciclo de calvin26

ciclo de calvin26 Figura 18 - Principais rotas das trioses-fosfato exportadas do ciclo. A sacarose transporta

Figura 18 - Principais rotas das trioses-fosfato exportadas do ciclo.

A sacarose transporta a energia fotossintética, através dos vasos condutores, a

todas as partes da planta alcançando, em última instância, os órgãos de reserva (Figura 18), onde se vai acumular sob a forma de amido — o AMIDO DE RESERVA (STRASBURGER,

1989).

Outra importante via é aquela que se processa, quando a taxa de produção de trioses-fosfato, excede a capacidade de mobilização do cloroplasto. Neste caso, o excesso (até 30% dos produtos da fotossíntese) é canalizado para uma rota biossintética de amido que ocorre no estroma (Figura 18). É o chamado AMIDO PRIMÁRIO ou de assimilação (polímero de glucose). É uma forma de reserva temporária, que impede uma eventual inibição do processo fotossintético, bem como um perigoso aumento da pressão osmótica do estroma por excesso de trioses-fosfato. O comando da direcção da síntese para a produção de sacarose ou amido centra-se no efeito regulador exercido pelo Pi ao nível do translocador fosfato (CRAFTS-BRANDNER, 1992).

O processo de síntese para o amido (primário e reserva) é idêntico ao da

sacarose até à formação da glucose-1-fosfato. A partir daqui:

ciclo de calvin27

Glucose-1-fosfato + ATP

ADP-glucose + PPi

A reacção é catalisada pela ADP-glucose pirofosforilase, sendo este passo um dos pontos de regulação deste processo. Requer Mg 2+ para o seu funcionamento. É activada pelo aumento da concentração de PGA e F6P e inibida pela diminuição de Pi (FOYER, 1984;

TEIXEIRA e RICARDO, 1984).

Logo que as rotas de exportação de trioses-fosfato deixem de estar saturadas (normalmente à noite), inicia-se o processo de remoção do amido primário, para fornecer energia necessária a todas estruturas celulares e canalizar os excedentes para os órgãos de reserva. O processo começa por uma hidrólise deste, formando-se novamente as trioses-fosfato, que seguirão então o percurso normal.

Súmula:

O cloroplasto tem necessidade de exportar os produtos recém formados no ciclo de Calvin, a fim de levar a energia fotossintética às partes não verdes da planta.

A membrana interna do cloroplasto, constitui uma barreira extremamente selectiva às trocas de materiais com o citoplasma, sendo um garante da individualidade do cloroplasto. Os translocadores fosfato asseguram, em volume adequado, as trocas necessárias de trioses-fosfato destinadas à formação de saca- rose (açúcar de transporte).

Há no cloroplasto, um sistema de armazenamento temporário de trioses sob a forma de amido primário, que ocorrerá nas situações em que a capacidade de produção fotossintética exceda a capacidade de exportação.

ciclo de calvin28

8. REGULAÇÃO ENZIMÁTICA DO CICLO DE CALVIN

O ciclo de Calvin é fundamentalmente controlado pela luz, pelo que no escuro

é ínfima a fixação de CO 2 , ou mesmo nula.

A regulação é levada a cabo pela luz por acção de dois tipos de mecanismos

(COLL, 1980; RAWN, 1989 e CHUECA, 1991):

•Através da fotomodulação de enzimas chave do ciclo, sobretudo as das etapas irreversíveis do ciclo;

- Via tiorredoxina;

- Pelo pH e Mg 2+ do estroma.

•Através do fluxo electrónico, que controla o fornecimento de NADPH e ATP, necessários para

fixação de CO 2 interferindo também nas concentrações dos diferentes intermediários.

8.1. REDUÇÃO DAS PONTES BISSULFETO

O mecanismo de regulação efectuado pela luz, via tiorredoxina, é idêntico para

todas as enzimas controladas por este processo (COLL, 1980; DIETZ e HEBER, 1984 e RAWN,

1989):

• Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase;

• Frutose-bifosfatase;

• Sedo-heptulose-bifosfatase;

• Ribulose-5-fosfato-cinase.

Como é bem conhecido, a estrutura terciária das proteínas é bastante frágil,

pelo que bastarão pequenas modificações no meio, para que isso se reflicta na sua

conformação estrutural.

ciclo de calvin29

Durante a activação efectuada pela luz, as pontes bissulfeto establecidas entre os resíduos das enzimas sulfuradas da superfície das enzimas inactivas, são reduzidas a grupos sulfidrilo.

Esta redução vai ser responsável por alterações ao nível da estrutura terciária das

enzimas, induzindo a sua actividade. O estado de inactividade é novamente atingido

pela reoxidação destes grupos.

A fonte de electrões para as reduções vem, em última análise, da água (Figura

19). Com efeito, a absorção de energia radiante pelos pigmentos antena das unidades

fotossintéticas e a sua transformação fotoquímica pelos centros de reacção dos fotossistemas (P 700 e P 680 ) em energia electrónica, destina-se a ser usada na cadeia de

transferência electrónica, cujos electrões são oriundos da fotólise da água. Este facto, vai

levar a um aumento da concentração dos intermediários da cadeia, nomeadamente de

ferrredoxina reduzida. Precisamente neste passo, há um desvio de electrões, da cadeia

para a TIORREDOXINA, uma proteína de baixo peso molecular. Esta reacção é catalisada

pela ferredoxina-tiorredoxina-reductase.

é catalisada pela ferredoxina-tiorredoxina-reductase . Figura 19 - Redução das pontes bissulfeto ocorrida em

Figura 19 - Redução das pontes bissulfeto ocorrida em certas enzimas do ciclo de Calvin.

A tiorredoxina reduzida, transfere o poder redutor para as pontes bissulfeto,

activando a formação de grupos sulfidrilo (-SH) (COLL, 1980 e RAWN, 1989).

8.2. MODULAÇÃO PELO M g 2+ E PELO pH

Há algumas enzimas do ciclo cuja entrada em actividade depende da existência

de Mg 2+ do estroma e pH alcalino (COLL, 1980 e RAWN, 1989):

• Ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase/oxigenase (RuBisCO);

• Frutose-bifosfatase;

ciclo de calvin30

• Sedo-heptulose-bifosfatase;

• Fosfoglicerato-cinase.

Na presença de luz, há um bombeamento de protões do estroma para o lúmen dos tilacóides, gerando um gradiente indispensável à fotofosforilação. Com o fim de

manter o equilíbrio electrostático, idênticas quantidades de cargas positivas passam para

o estroma através do Mg 2+ . Como consequência destas trocas, advém um

empobrecimento do estroma em H + e concomitante alcalinização e enriquecimento em

Mg 2+ .

8.3. REGULAÇÃO ESTEQUIOMÉTRICA

Deve ter-se em conta, os efeitos estequiométricos exercidos sobre a actividade das enzimas, tanto pelo ATP, como pelo NADPH, como por alguns intermediários do ciclo.

Com efeito, na presença de luz, há maiores concentrações de ATP, NADPH e de intermediários do ciclo, nomeadamente a RuBP. Este facto, induzirá a um maior ou menor grau de actividade das enzimas envolvidas.

Se a concentração de Pi no estroma fôr muito baixa, pode vir a limitar a taxa de formação de ATP pelo que, a relação PGA/Pi, desempenha um importante papel como elemento regulador do ciclo. Se o valor da relação fôr alto, sinal da existência de pouco Pi no estroma, ocorrerá um efeito alostérico de activação da ADP-glucose-pirofosforilase (enzima implicada na formação de amido no estroma), para evitar a saída de mais fosfato do cloroplasto.

O CO 2 tem uma acção mais independente da luz, exercendo regulação ao nível

da velocidade de carboxilação em função da sua concentração (COLL, 1980 e HUDSON et

al., 1992).

A reter:

A luz exerce um efeito regulador, a vários níveis, das enzimas do ciclo de Calvin:

De uma forma mais directa, através do mecanismo da redução das pontes bissulfeto.

De uma forma mais indirecta através do aumento do pH e da concentração de Mg 2+ no estroma e pelo efeito estequiométrico de alguns compostos presentes no estroma.

ciclo de calvin31

8.4. CARACTERIZAÇÃO MODULATIVA DA RUBISCO

8.4.1. Importância biológica da enzima

Aparecendo frequentemente com a designação de RuBisCO, é a enzima que

catalisa a reacção de carboxilação no ciclo. Além desta actividade, promove também, de

forma competitiva, a oxigenação da RuBP para a fotorrespiração.

Encontra-se normalmente no estroma, podendo também aparecer associada

quer às membranas tilacóides, quer à membrana interna do invólucro cloroplástico. Nas

plantas superiores pode alcançar 50-65% da proteína total solúvel (300 mg.ml -1 ) de um

extracto de folhas (FOYER, 1984; STRASBURGER, 1990 e RAWN, 1989). Estes valores só

podem ser tomados como um indicador geral do grau de presença desta enzima nas

folhas, dado que, de facto, há alguma variação. Assim as folhas mais expostas ao sol

possuem mais enzima que as menos expostas, o mesmo acontecendo com as plantas em C 3 relativamente às C 4 e CAM.

As

plantas

C 3

têm

maior

afinidade

para

o

CO 2

que

as

C 4

e

CAM,

presumivelmente por estas últimas possuirem um sistema de bombeamento do CO 2 para

a vizinhança da RuBisCO, tornando esta enzima mais "preguiçosa" (FOYER, 1984).

A RuBisCO é a proteína mais abundante na natureza, o que não é de estranhar, tendo

em conta a biomassa formada pelos seres fotossintéticos (BERKALOFF, 1988 e RAWN, 1989).

8.4.2. Substratos para a RuBisCO

Juntamente com a RuBP, os outros substratos da RuBisCO são o CO 2 e o O 2 .

Relativamente ao CO 2 há que sublinhar a selectividade por este, em detrimento

do HCO 3 - . Com efeito, estas duas formas carbonadas inorgânicas (em elevado grau de

oxidação) encontram-se em equilíbrio no meio celular, como se pode verificar pela

Figura 20:

CO 2 gasoso

Substrato para a RuBisCO

pela Figura 20: CO 2 gasoso Substrato para a RuBisCO CO 2 dissolvido + H 2

CO 2 dissolvido + H

2 O

Substrato para a RuBisCO CO 2 dissolvido + H 2 O H + + HCO 3

H + + HCO 3

-

Figura 20 - Reacções de equilíbrio entre o CO 2 e o HCO 3 - (adaptado de STRASBURGER,

1990).

ciclo de calvin32

Esta

reacção

é

catalisada

pela

ácido

carbónico-anidratase

ao

nível

da

interconversão

CO 2

e

HCO 3 - .

O

ponto

de

equilíbrio

depende

do

pH

do

meio

(STRASBURGER, 1990). Sabe-se também que a membrana interna do cloroplasto é impermeável ao HCO 3 - , como já foi dito.

Segundo

COOMBS (1987), RAWN (1989) e STRASBURGER (1990) a afinidade da

RuBisCO (traduzida por uma constante, designada constante de Michaelis-Menton que,

será tanto maior quanto menor fôr a afinidade da enzima para o substrato) para os seus

substratos é a seguinte:

RuBP: K m = 20 - 50 µM;

CO 2 : K m = 12 - 25 µM;

O 2 : K m = 250 µM.

8.4.3. Estrutura molecular

Nos eucariota, o peso molecular desta enzima é de aproximadamente 500.000-

550.000 daltons (FOYER, 1984; BERKALOFF, 1988; RAWN, 1989 e STRASBURGER, 1990).

Relativamente à sua estrutura (Figura 21), sabe-se hoje, que é composta no seu

nível estrutural quaternário, por 8 unidades grandes (L: 56.000 daltons) mais 8 unidades

pequenas (S: 14.000 daltons). Esta forma de enzima (8L8S) é chamada de T enzima

(FOYER, 1984 e KNAFF, 1989).

) é chamada de T enzima (F OYER , 1984 e K NAFF , 1989) .

Figura 21 - Estrutura molecular da RuBisCO. Associação das unidades grandes e pequenas (adaptado de COOMBS, 1987).

ciclo de calvin33

Em alguns procariota (v.g. Chlorobium thiosulphatophilum), pode encontrar-se uma

outra forma de enzima, só possuindo unidades grandes (6L) à qual MC FADDEN, citado

por FOYER (1984), chamou O enzima.

Dada a maior importância da T enzima, propomo-nos por isso fazer uma breve

abordagem a esta forma.

A síntese das unidades grandes ocorre no estroma sendo da responsabilidade do

DNA cloroplástico e dos plastorribossomas (70S). A síntese das unidades pequenas é da

responsabilidade do DNA nuclear e dos ribossomas citoplasmáticos (80S) que sintetizam

também um precursor adicional (de peso molecular aproximadamente 5.000 da) para

assegurar a translocação através do invólucro do cloroplasto (FOYER, 1984 e COOMBS,

1987).

Cada unidade grande possui um centro activo, responsável pela carboxilação

pelo que, cada molécula de RuBisCO possui 8 centros activos. A função das unidades

pequenas julga-se que seja de regulação e de estabilização estrutural dos centros

catalíticos da molécula (MIZIORKO e LORIMER, 1983 e FOYER, 1984).

8.4.4. Mecanismo de activação

O processo de activação é relativamente lento, sendo regulado pelo pH, Mg 2+ e

intervindo também o CO 2 .

O pH do estroma deve situar-se entre 7-8,5 para que se desencadeie o processo

de activação (Figura 22), condições só possíveis, em presença de luz.

Então, uma molécula de CO 2 vai ligar-se ao grupo amino de um resíduo de

lisina da superfície do sítio activo da enzima, formando-se um grupo CARBAMATO. Esta

reacção, como se pensava até há algum tempo, não é espontânea. Necessita de ser

catalisada pela RuBisCO-activase, que, por sua vez, precisa de ATP (ROBINSON et al., 1988;

KNAFF, 1991; LAN e MOTT, 1991). É uma etapa relativamente lenta, podendo demorar

segundo FOYER (1984), cerca de 1 minuto ou mais.

ciclo de calvin34

Enz-Lys-NH

3 + (inactiva)

H +

ciclo de calvin34 Enz-Lys-NH 3 + (inactiva) H + Enz-Lys-NH 2 (inactiva) CO 2 lento RuBisCO

Enz-Lys-NH

2 (inactiva)

CO 2 lento RuBisCO activase H + - (inactiva) Enz-Lys- NHCOO (grupo carbamato) Mg ++
CO 2
lento
RuBisCO activase
H +
-
(inactiva)
Enz-Lys-
NHCOO
(grupo carbamato)
Mg ++
rápido
++
Enz-Lys-NH
COO - Mg
(activa)
RUBP
++
2 PGA
Enz-Lys-NH
COO - Mg
RUBP

CO 2

Figura 22 - Mecanismo de activação da RuBisCO. Envolve uma primeira complexação com CO 2 e depois com Mg 2+ , para finalmente se poder ligar devidamente aos substratos (adaptado de COOMBS, 1987).

A activação da enzima é finalmente conseguida com, a reacção do grupo

carbamato com o Mg 2+ . Está formado o chamado "complexo ternário" Enzima-CO 2 -Mg 2+ ,

pronto a complexar-se com os seus substratos (RuBP e CO 2 ou O 2 ) (TEIXEIRA e RICARDO,

1984; FOYER, 1984; PIERCE, 1986 e RAWN, 1989).

É necessária grande quantidade de enzima no estroma, para assegurar razoáveis

taxas de fixação de CO 2 , pois a enzima tem uma taxa de renovação relativamente lenta

(FOYER, 1984 e COOMBS, 1987). A capacidade máxima de fixação de CO 2 , por cada sítio

catalítico e por minuto, segundo este autor, é de aproximadamente 200 moléculas.

8.4.5. A duplicidade carboxilativa/oxidativa

A RuBisCO é uma enzima bifuncional

carboxilação como a de oxigenação, da RuBP.

Estas

duas

reacções

usam

o

COMPETITIVAS (Figura 23).

mesmo

que

tanto

pode

catalisar

a

centro

catalítico,

sendo

reacção

de

por

isso

A carboxilação da RuBP origina 2 moléculas de PGA.

ciclo de calvin35

CH 2 O P C O
CH 2 O P
C
O
H—C—OH H—C—OH CH P 2 O
H—C—OH
H—C—OH
CH
P
2 O

RuBP

Ácido Fosfoglicólico

CH 2 O P FOTORRESPIRAÇÃO COOH O 2 Mg 2+ COOH H C OH CH
CH 2 O
P
FOTORRESPIRAÇÃO
COOH
O 2
Mg 2+
COOH
H
C
OH
CH 2 O P
Mg 2+
PGA
FOTOSSÍNTESE
COOH
CO 2 , H 2 O
H
C
OH
CH 2 O P

Figura 23 - Reacções catalisadas pela RuBisCO (adaptado de JENSEN e BAHR, 1977).

A oxigenação da RuBP, conduz à produção de uma molécula de PGA e outra de

fosfoglicolato, i.e., guia o processo para a chamada FOTORRESPIRAÇÃO. Será conveniente

relembrar o menor rendimento energético desta função oxigenásica, que será objecto de

estudo em aula próxima.

Limitar-nos-emos, a fazer um balanço das "preferências" da enzima por um ou outro substrato no caso das plantas C 3 .

Apesar de a afinidade ser bastante mais elevada para o CO 2 (K m =12-25 µM) do

que para o O 2 (K m =250 µM), verifica-se que ambos contribuem de forma significativa

para a actividade da enzima (RAWN, 1989; COOMBS, 1987 e STRASBURGER, 1990).

Perguntar-se-á porquê?!

A explicação reside no facto de a concentração atmosférica de O 2 (cerca de

21%) ser muito maior que a de CO 2 (cerca de 0,035%), pelo que, a relação CO 2 /O 2 do meio

é determinante para a via a ser catalisada pela RuBisCO (RAWN, 1989 e STRASBURGER,

1990).

Em condições normais, a relação carboxilação/oxigenação oscila entre 3:1 e 4:1

(RAWN, 1989).

A possibilidade de se vir a conhecer com mais exatidão a eficiência

carboxilativa, e porventura vir a melhorá-la modificando a afinidade relativa da RuBisCO para o CO 2 e CO 2 , tem sido objecto de numerosos estudos (HUDSON et al., 1992 e ZHU et al.,

1992).

ciclo de calvin36

A terminar, reforça-se uma vez mais, a ideia do duplo papel do CO 2 , como

regulador e como substrato.

Resumo:

De entre todos os factores de regulação do ciclo, sobressai a RuBisCO, a enzima que catalisa a reacção de carboxilação no ciclo de Calvin.

É activada por condições de pH alcalino e elevada concentração de Mg 2+ no estroma, que promovem a carbamilação da enzima, reacção que é catalizada pela RuBisCO-activase. O estádio final de activação é alcançado pela complexação com o Mg 2+ .

A RuBisCO tanto pode catalisar uma reacção de carboxilação como alternativamente uma reacção de oxidação da RuBP.

ciclo de calvin37

9.

AA

FFAALLSSAA

DDIICCOOTTOOMMIIAA

CCLLAARRAA""//""FFAASSEE EESSCCUURRAA"""

""FFAASSEE

Depois da leitura atenta dos capítulos precedentes, estamos em condições de

perceber que, efectivamente, não há uma fase que se realize de dia e outra de noite.

O estudo dos mecanismos de regulação, mostrou-nos que, na realidade, uma fase precisa tanto de luz como a outra. A diferença estará em que a chamada "fase clara" necessita da luz de forma directa a cadeia de transferência de electrões (esquema em Z). Já a segunda fase necessita da luz de uma forma indirecta, dado que são as condições do meio favorecidas pela presença de luz, que vão influenciar a actividade das enzimas, logo o desenrolar do ciclo.

Conceito a reter:

É incorrecta a divisão da fotossíntese nas clássicas "fase clara"/"fase escura", na medida em que ambas

necessitam de luz para ocorrerem. A dita "fase escura" necessita da luz pois parte das enzimas que aqui intervêm são moduladas indirectamente pela luz via tiorredoxina; ou via pH, CO 2 e Mg 2+ .

ciclo de calvin38

10. BIBLIOGRAFIA

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